犬弓首蛔蟲衡陽分離株的核糖體DNA ITS序列分析

文貴輝，劉振湘

（湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院,衡陽 421005）

犬弓首蛔蟲（Toxocara canis）屬于蛔蟲目（Ascarididea）、弓首科（Toxocaridae）、弓首屬（Toxocara），是犬的常見寄生蟲，成蟲主要寄生于肉食獸的小腸內(nèi)。犬弓首蛔蟲主要危害2周至5月齡的幼犬，引起幼犬發(fā)育不良，生長緩慢，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[1]。犬弓首蛔蟲也可感染貓、鵪鶉、鴕鳥以及豬等動物[2-5]。作為一類常見的人畜共患性寄生蟲病，犬弓首蛔蟲對人類健康存在嚴(yán)重威脅，其幼蟲能在人體內(nèi)移行，引起人體內(nèi)臟幼蟲移行癥、眼睛幼蟲移行癥、隱性弓首蛔蟲病和非化膿性腦膜腦炎等疾病綜合癥[6,7]。

犬弓首蛔蟲在全世界分布廣泛，感染率為5.3%～64.7%。我國的犬弓首蛔蟲病感染率為8.13%～77.4%。近年來，寵物犬飼養(yǎng)量劇增，弓首蛔蟲病感染率也呈逐年上升趨勢[8]。同時(shí)，犬弓首蛔蟲對犬、貓等動物的健康成長產(chǎn)生了極大的危害，給相關(guān)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究對湖南省衡陽市犬弓首蛔蟲流行感染情況進(jìn)行調(diào)查，通過對犬弓首蛔蟲核糖體ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，探討與其他蛔蟲的種系發(fā)育關(guān)系，旨在為犬弓首蛔蟲的分類、鑒別診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查等研究提供參考，同時(shí)為犬弓首蛔蟲疾病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品收集在湖南省衡陽市隨即采集犬糞樣共453份，其中從蒸湘區(qū)、石鼓區(qū)、雁峰區(qū)、珠暉區(qū)和南岳區(qū)寵物醫(yī)院采集的犬糞樣品數(shù)分別為36份、31份、33份、33份和31份，共164份；從以上地區(qū)采集野外犬糞樣品數(shù)量分別為72份、58份、57份、53份和49份，共289份。

1.2 主要試劑DNA提取試劑盒WizardTMDNA Clean-Up System購自O(shè)mega生物技術(shù)公司；PCR試劑（Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP等）、DL2000 Marker等均購自大連寶生物工程有限公司；蛋白酶K為Merck公司產(chǎn)品；引物由上海華大基因有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定與蟲卵DNA提取 應(yīng)用飽和鹽水漂浮法對所獲得的犬糞便進(jìn)行犬弓首蛔蟲蟲卵檢測。對采用飽和食鹽水離心漂浮法獲得的樣品漂浮液面進(jìn)行鏡檢。若3次均未發(fā)現(xiàn)犬弓首蛔蟲蟲卵，即判定為陰性，若1次發(fā)現(xiàn)犬弓首蛔蟲蟲卵，則判定為陽性。對陽性樣品中蟲卵進(jìn)行富集，并提取蟲卵DNA基因組[9]。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 采用文獻(xiàn)[10]中引物用于擴(kuò)增弓首蛔蟲卵與獅弓蛔蟲卵核糖體ITS部分序列，引物序列為：NC5：5'-GTAGGTGAACCTGCGGAA GGATCATT-3'（26 bp）；NC2：5'-TTAGTTTCTT TTCCTCCGCT-3'（20 bp），進(jìn)行弓首蛔蟲ITS基因序列擴(kuò)增，預(yù)期片段長度為885 bp左右。50 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 8 μL、MgCl2（25 mmol/L）5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4 μL、rTaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL、上下游引物（50 pmol/μL）各1.0 μL、DNA模板4 μL和ddH2O 24.5 μL，混勻后短暫離心15 s。同時(shí)，以雙蒸水代替DNA模板作空白對照。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1% TAE瓊脂糖凝膠電泳觀測目的條帶，將陽性產(chǎn)物直接送至上海華大基因有限公司進(jìn)行測序。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 對測序結(jié)果用DNAStar5.0軟件進(jìn)行分析，下載GenBankTM收錄的所有不同國家/地區(qū)具有代表性的弓首蛔蟲的ITS基因序列，然后對其進(jìn)行相似性對比，與其他蛔蟲種系發(fā)育分析，用Clustal X 2.0 軟件和Mega 7.0軟件對獲得的5株弓首蛔蟲和從GenBankTM中下載的蛔蟲ITS序列進(jìn)行比對，計(jì)算遺傳差距。利用Mega 7.0程序中的鄰位相連法（neighbor-joining，NJ）繪制種系發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 衡陽市犬弓首蛔蟲感染情況調(diào)查結(jié)果

2.1.1 衡陽市寵物犬弓首蛔蟲感染調(diào)查結(jié)果 通過對衡陽市453份犬糞樣品進(jìn)行犬弓首蛔蟲感染情況調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有60份樣品檢測為犬弓首蛔蟲病陽性，平均陽性率為13.28%（60/453）；164份寵物犬糞便樣品中有28份檢測為犬弓首蛔蟲病陽性，陽性率為17.07%（28/164）；野犬的弓首蛔蟲病陽性率偏低，為10.38%（30/289）。本次調(diào)查結(jié)果明顯高于長沙市和懷化市犬弓首蛔蟲感染率調(diào)查結(jié)果[9]（4.89%），但低于益陽市犬弓首蛔蟲感染率（54.9%）[7]。說明湖南省犬弓首蛔蟲感染情況差異較大，分布較廣，對人畜健康已形成較大的威脅，應(yīng)該引起重視。

2.1.2 弓首蛔蟲蟲卵鏡檢結(jié)果 糞便樣本中犬弓首蛔蟲蟲卵呈圓形，顏色較淺，蟲卵內(nèi)部存在空隙，輪廓較清晰[11]（圖1）。

圖1 犬弓首蛔蟲蟲卵鏡檢結(jié)果Fig 1 Examination of T.canis eggs by microscope

2.1.3 測序與序列分析結(jié)果 ITS基因由18S rRNAITS-1-5.8S rRNA-ITS-2-28S rRNA方式排列組成，其中18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA基因?qū)儆诟叨缺Ｊ貐^(qū)域，而ITS-1和ITS-2為高度變異區(qū)，在種內(nèi)相對保守，種間具有顯著的差異性。PCR 技術(shù)在寄生蟲學(xué)方面已經(jīng)得到了泛的應(yīng)用[12]。采用 PCR 對寄生蟲某段特異性基因片段的分析開創(chuàng)了寄生蟲分類學(xué)的新紀(jì)元。研究表明，ITS基因序列可以作為理想的遺傳標(biāo)記，應(yīng)用于寄生蟲的分類鑒定、種系發(fā)育學(xué)和種間分類等分子學(xué)研究中[13-15]。

對5個(gè)犬弓首蛔蟲衡陽市分離株的核糖體ITS基因序列進(jìn)行擴(kuò)增與分析，結(jié)果顯示，所獲得犬弓首蛔蟲ITS片段大小為885 bp，其中A、T、C和G平均含量分別為25.34%、26.50%、19.54%和29.62%，A+T和C+G平均含量分別為51.84%和49.16%。在擴(kuò)增的基因片段中，未出現(xiàn)堿基缺失和插入，僅存在核苷酸置換的現(xiàn)象。對獲得的序列進(jìn)行遺傳差異分析，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)變異程度較低，為0.0～0.8%；與GenBank中收錄的犬弓首蛔蟲ITS序列分離株同源性最高，均高于98.4%；與其他蛔蟲ITS序列相比，同源性較低，均低于62.0%。

2.1.5 ITS序列系統(tǒng)發(fā)生樹 采用 Mega 7.0軟件將本次所測定的序列與從GenBank中登錄的其他弓首科和蛔科蟲體的ITS基因序列進(jìn)行對比分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，5株犬弓首蛔蟲分離株與來自日本和澳大利亞的3個(gè)犬源犬弓首蛔蟲處于同一進(jìn)化分枝上，與其他蛔蟲所屬分支距離較遠(yuǎn)，說明此次分離的蟲株為犬弓首蛔蟲（圖3）。

圖2 基于分離株ITS 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees based on the ribosomal DNA ITS gene sequences using neighbor-joining (NJ) method

至今為止，關(guān)于寄生蟲分類、鑒定及遺傳變異的分子生物學(xué)方法已有很多報(bào)道[16-18]。宋美冉等[19]對于mtDNA上cox1、nad1和nad4三種序列進(jìn)行了研究。研究結(jié)果顯示線粒體基因突變率較高，相對而言mtDNA上序列對隱藏種的鑒定更為有效[20,21]。本研究基于ITS序列對衡陽市犬弓首蛔蟲的種系發(fā)育關(guān)系進(jìn)行鑒別，為今后犬蛔蟲的分類、鑒別診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查等研究提供了依據(jù)。目前，ITS進(jìn)化方式的相關(guān)研究還不是很深入，不同重復(fù)序列究竟是如何保持一致等問題還在探究中[16]。