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    一株肉牛A型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定

    2019-12-16 08:22:08張貴剛徐麗媛黃海碧韓四娥李化生關(guān)平原劉國(guó)英
    關(guān)鍵詞:殺性莢膜氏桿菌

    張貴剛,徐麗媛,黃海碧,韓四娥,李化生,關(guān)平原,劉國(guó)英

    (金宇保靈生物藥品有限公司獸用疫苗國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特 010030)

    多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)是一種可感染各種動(dòng)物的重要病原菌,主要引發(fā)牛出血性敗血癥、牛肺炎、豬肺疫、豬萎縮性鼻炎、禽霍亂等,也能夠感染野生鳥類、海洋哺乳動(dòng)物和人。Pm的致病機(jī)理相對(duì)復(fù)雜,健康動(dòng)物的口腔、鼻腔和扁桃體常常存在Pm,被感染動(dòng)物的呼吸道和消化道黏膜等處在發(fā)病前也已寄生了大量Pm。當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí),病原菌首先沖破免疫防線,侵入機(jī)體并繁殖,發(fā)生外源性感染。接著Pm隨淋巴液進(jìn)入血液,導(dǎo)致內(nèi)源性感染[1-3]。研究認(rèn)為,Pm侵入機(jī)體感染和繁殖與菌體的莢膜有著很大的關(guān)系,它們?cè)隗w內(nèi)繁殖時(shí)能夠產(chǎn)生大量?jī)?nèi)毒素,導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生病變[4]。Pm菌體有5個(gè)莢膜血清型,分為A、B、D、E和F型,每種莢膜血清型都可引起不同動(dòng)物發(fā)病。相同莢膜血清型的不同菌株對(duì)相同宿主的毒力強(qiáng)弱和致病性也不同。A型和B型Pm毒力最強(qiáng),感染動(dòng)物的死亡率較高,發(fā)病常呈流行性。D型Pm的宿主范圍廣泛,但毒力相對(duì)較弱,多為散發(fā)性。E型菌株非常少見,F(xiàn)型菌株常見于患病火雞中[5,6]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示,2008年后我國(guó)牛感染Pm的病例中,病原多為A型Pm,主要引發(fā)犢牛肺炎(又稱“運(yùn)輸熱”)和牛肺炎(地方流行性肺炎)[7]。在歐美國(guó)家,死亡率較高的牛呼吸系統(tǒng)疾病多是由Pm導(dǎo)致。調(diào)查報(bào)道顯示,2014年英國(guó)牛場(chǎng)中多殺性巴氏桿菌病的爆發(fā)率相對(duì)較高[8]。可見,Pm分離株是引起牛呼吸系統(tǒng)疾病的主要原因,給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損害。本研究采用常規(guī)微生物學(xué)方法和分子生物學(xué)技術(shù),對(duì)河北省患有呼吸系統(tǒng)疾病肉牛進(jìn)行病原分離培養(yǎng)和分型鑒定,為有效預(yù)防與治療提供參考,同時(shí)也為疫苗生產(chǎn)提供菌種資源。

    1 材料和方法

    1.1 病料與菌株在河北省某肉牛場(chǎng)采集病牛鼻拭子5份;多殺性巴氏桿菌A型陽性菌株由金宇保靈生物藥品有限公司國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)平臺(tái)保存。

    1.2 培養(yǎng)基和主要試劑營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;馬丁肉湯培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司;胎牛血清購自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司;快速革蘭氏染液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;Phusion Hot Start II DNA Polymerase購自美國(guó)Thermo Scientific公司;Premix TaqTM、6×Loading Buffer、DL2000 Marker均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明系小白鼠購自內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物中心,體重18~22 g

    1.4 病原分離培養(yǎng)將無菌采集的5份鼻拭子分別劃線接種至5%鮮血瓊脂培養(yǎng)基,同時(shí)接種到適量血清馬丁肉湯培養(yǎng)基中,37℃過夜培養(yǎng),觀察菌落生長(zhǎng)特性。挑取少量可疑多殺性巴氏桿菌菌落,無菌操作涂片,進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。將染色鑒定為可疑多殺性巴氏桿菌的HB5和HB25菌株在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基上進(jìn)一步純化,記做G2代。

    1.5 PCR鑒定

    1.5.1 引物的設(shè)計(jì)合成 參照文獻(xiàn)[9]合成多殺性巴氏桿菌特異性基因kmt1,以及莢膜血清特異性基因capA、capB、capD、capE、capF序列引物,參照文獻(xiàn)[10]合成細(xì)菌16S rDNA序列引物,引物均由北京華大基因有限公司合成,序列信息見表1。

    1.5.2 種屬PCR及分型鑒定 取HB5和HB25菌株的G2代細(xì)菌培養(yǎng)物2 mL,用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌液DNA,并采用多殺性巴氏桿菌kmt1基因通用引物進(jìn)行種屬PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系:PremixTaqTM12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5μL,DNA 模板1 μL,無酶水補(bǔ)至總體積25 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;擴(kuò)增循環(huán)30×(95℃ 60 s,55℃ 30 s,72℃ 60 s);72℃再延伸7 min, PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。對(duì)PCR陽性的樣品分別加入5個(gè)莢膜血清特異性基因引物,進(jìn)行分型鑒定,反應(yīng)體系與條件同上。

    1.5.3 16SrDNA基因擴(kuò)增及測(cè)序 以上述PCR鑒定為陽性Pm的DNA為模板,用高保真酶Phusion Hot Start II DNA Polymerase和16S rDNA基因序列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系:無酶水27.8 μL,dNTP Mix(10 mmpl/L each)0.8 μL,5× Phusion HF Buffer 8 μL,Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase (2 μ/μL)0.4 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA 模板2 μL。反應(yīng)條件: 98℃預(yù)變性30 s;擴(kuò)增循環(huán)30×(98℃ 10 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s);72℃延伸10 min, PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后,送上海英維捷基公司測(cè)序。

    1.6 致病性試驗(yàn)將連續(xù)純化3代的HB25菌液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),并梯度稀釋至10、20、30、40 CFU。隨機(jī)分為4個(gè)攻毒組與1個(gè)對(duì)照組,每組5只小鼠。4個(gè)攻毒組小鼠分別腹腔注射10、20、30、40 CFU的HB25菌液0.1 mL,對(duì)照組小鼠均腹腔注射馬丁肉湯培養(yǎng)基0.1 mL,次日觀察小鼠發(fā)病死亡情況。

    表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

    2 結(jié)果

    2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果在5%鮮血瓊脂培養(yǎng)基上,病原菌形成光滑、濕潤(rùn)、圓形的水滴樣菌落,革蘭氏染色陰性,顯微鏡下呈球形或短桿狀,散在分布(圖1)。

    圖1 分離菌株的形態(tài)學(xué)鑒定Fig.1 Morphological identification of isolated strain

    2.2 PCR及分型鑒定結(jié)果經(jīng)分離培養(yǎng)和染色鑒定為可疑的G2代Pm菌株HB5和HB25,采用Pm種屬kmt1基因序列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示,HB5菌株無擴(kuò)增條帶,HB25菌株擴(kuò)增出現(xiàn)約460 bp大小的目的條帶,鑒定為Pm(圖2)。進(jìn)一步用莢膜血清特異性基因分型引物PCR鑒定HB25菌株,電泳結(jié)果顯示,條段大小約為1044 bp,說明HB25菌株為A型Pm(圖3)。

    圖2 多殺性巴氏桿菌kmt1基因PCR電泳圖Fig.2 PCR result of kmt1 gene

    2.3 16S rDNA基因擴(kuò)增及序列分析HB25分離株經(jīng)16S rDNA基因PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖4所示。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì),并對(duì)其序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示,本菌株與陽性菌株SSF1-8以及GenBank中公布的8個(gè)Pm菌株16S序列相似性均在99%以上(圖5),結(jié)合患病牛臨床表現(xiàn)及分離菌培養(yǎng)特性可確定所分離菌株為牛源Pm。

    圖3 HB25菌株分型鑒定結(jié)果Fig.3 Typing of strain HB25 by PCR

    圖4 HB25菌株16S rDNA基因PCR結(jié)果Fig.4 PCR result of 16S rDNA of strain HB25

    2.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)4個(gè)攻毒組小鼠分別腹腔注射0.1 mL經(jīng)梯度稀釋的10、20、30、40CFU的HB25純菌液,對(duì)照組按相同方式和劑量注射馬丁肉湯培養(yǎng)基。24 h后,30 CFU組和40 CFU組小鼠均100%死亡;20 CFU攻毒組小鼠死亡4只,死亡率為80%;10 CFU組2只死亡,死亡率40%(表2)??梢姡闔B25對(duì)小鼠的最小致死量為3CFU。

    圖5 HB25菌株16SrDNA基因遺傳進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic trees of strain HB25 based on 16SrDNA gene

    表2 菌株HB25的毒力檢測(cè)結(jié)果Table2 Results of virulence test of strain HB25

    3 討論

    Pm是呼吸道一種較為常見的條件性致病菌,當(dāng)宿主受到其他病原感染(細(xì)菌、病毒、寄生蟲等)時(shí),抵抗力下降,或是外界環(huán)境惡劣(寒冷、潮濕、擁擠等),宿主受到應(yīng)激刺激時(shí),都可能誘發(fā)多殺性巴氏桿菌病。近幾年,我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展迅速,不同地區(qū)之間的奶牛肉牛運(yùn)輸尤其頻繁,加大了牛巴氏桿菌病發(fā)生和流行的概率[11]。研究發(fā)現(xiàn),Pm的5個(gè)血清型之間在宿主嗜性、抗原特異性和致病性等方面存在較大的差異,不同血清型之間交叉保護(hù)性較低,給多殺性巴氏桿菌病的防治增加了困難。前些年,我國(guó)牛群感染的Pm以莢膜血清B型為主,但近幾年,研究者不斷從病死牛中分離到莢膜血清A型Pm,而現(xiàn)有的巴氏桿菌疫苗主要是針對(duì)莢膜血清B型,對(duì)A型Pm的保護(hù)率很低,導(dǎo)致我國(guó)牛群中A型Pm的流行與發(fā)生日益增多。目前對(duì)于牛巴氏桿菌病的綜合防治應(yīng)采取以疫苗免疫為主的預(yù)防控制措施,所以研制針對(duì)莢膜血清A型Pm的新型疫苗已迫在眉睫[13-15]。檢測(cè)結(jié)果顯示,分離的A型Pm菌株只需3 CFU即可100%致死小鼠,說明菌株毒力很強(qiáng)。本研究分離的菌株為高效預(yù)防該病的疫苗研制提供了基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)材料。

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