暗紫貝母FPS基因克隆與表達(dá)特性分析

(內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/特色農(nóng)業(yè)資源研究與利用四川省高校重點實驗室， 四川 內(nèi)江 641112)

暗紫貝母(FritillariaunibracteataHisao et K.C.Hsia)為百合科多年生草本植物，是川貝母的基原植物，為四川重要的道地藥材之一，主產(chǎn)于川西高原地區(qū)，具有清熱潤肺，止咳化痰，鎮(zhèn)靜平喘，抗炎降壓等多種功效[1-2]。已有研究表明，暗紫貝母的有效成分主要為其次生代謝產(chǎn)物生物堿類，此外還包括皂苷、核苷類等，其中異甾體生物堿成分所含比例最多[3]。

對于植物次生代謝途徑的研究，其關(guān)鍵酶基因的克隆與分析對于闡明代謝產(chǎn)物合成途徑和調(diào)控機制至關(guān)重要。貝母中異甾體生物堿合成途徑與三萜類化合物類似，主要由甲羥戊酸途徑合成[4]。法尼基焦磷酸合酶(Fanesyl Pyrophosphate Synthase，F(xiàn)PS)是該途徑中的重要限速酶之一[5]，其催化2個異戊烯基焦磷酸(IPP)和1個二甲丙烯基焦磷酸(DMAPP)分子發(fā)生縮合反應(yīng)生成法尼基焦磷酸(Farnesyl Pyrophosphate，F(xiàn)PP)[6-7]，F(xiàn)PP進一步通過一系列的氧化還原反應(yīng)合成生物堿等次生代謝產(chǎn)物[8-9]。目前已從臘梅[10]、刺五加[9]、姜花[11]、洋甘菊[12]、虎眼萬年青[13]、雷公藤[14]、浙貝母[15]、茅蒼術(shù)[16]等多種植物中克隆出編碼FPS的cDNA序列，但尚未見暗紫貝母異甾體生物堿合成途徑中FPS基因的相關(guān)研究報道。本研究克隆編碼暗紫貝母法尼基焦磷酸合酶的FrFPS基因，對其在不同器官中的表達(dá)特性進行分析，并測定不同海拔高度鱗莖的生物堿含量，為研究該基因在暗紫貝母生物堿合成途徑中的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試暗紫貝母采自四川省阿壩州松潘縣，經(jīng)內(nèi)江師范學(xué)院陳文年教授鑒定為百合科植物暗紫貝母。用清水洗凈雜質(zhì)，濾紙吸干表面水分后的鱗莖作為暗紫貝母總RNA提取材料，液氮速凍保存。表達(dá)分析時，在3 200 m、3 400 m、3 600 m、3 800 m 等4個不同海拔高度取材，將暗紫貝母鱗莖、莖、葉分別作為總RNA提取材料，液氮速凍保存。每個海拔高度設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)分別用5株暗紫貝母相應(yīng)部位材料混樣。

RNAisoPlus試劑，HiScript?Ⅱ 1st Strand cDNA synthesis試劑盒，3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase，5′-Full RACE kit with TAP，SYBR?Premix Ex TaqTM(Takara 公司)；Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme Biotech公司)；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pGM-T克隆試劑盒、TOP-10感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技有限公司)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。PCR擴增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

將液氮速凍的暗紫貝母組織迅速研磨成細(xì)粉，分裝至1.5 mL離心管中，按照RNA提取試劑盒說明書提取暗紫貝母總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳快速檢測RNA的完整性，紫外分光光度計測定純度和濃度。取500 ng左右的RNA，采用HiScript?Ⅱ1 st Strand cDNA synthesis kit按照說明書反轉(zhuǎn)錄cDNA。

1.3 暗紫貝母FrFPS基因的克隆

通過在NCBI上相近物種保守序列的分析，設(shè)計1對兼并引物(FPS-DF 1：5′-YCTTGATGATATHATGGACAA-3′；FPS-DR 1：5′-CTYTTGTARATCTTRTGCARG-3′)，以暗紫貝母cDNA為模板進行同源片段的擴增。20μL反應(yīng)體系；94 ℃ 5 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。得到單一條帶后回收PCR產(chǎn)物直接進行正反向測序。

根據(jù)保守序列測序結(jié)果，按照RACE試劑盒說明書設(shè)計3′-RACE引物FPS-3′F 1(5′-GCTTCGGGGCAGATGCTTGATTTGAT-3′)和FPS-3′R 1(5′-ATTTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTT-3′)。以暗紫貝母cDNA為模板，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序為:94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR擴增獲得基因3′端后進行TA克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子測序。

根據(jù)保守序列測序結(jié)果設(shè)計5′-RACE引物FPS-5′F 1(5′-CTGATGATCAGTCGATG-3′)和FPS-5′R 1(5′-CCTCGCCTTGTGTGAGAGTTGTCCAT-3′)，以暗紫貝母cDNA為模板，按照RACE試劑盒說明書進行PCR反應(yīng)獲得基因的5′端。電泳后將得到的單一條帶進行切膠回收，同時進行TA克隆，選取陽性轉(zhuǎn)化子進行測序。

cDNA序列拼接利用DNAMAN 6.0軟件進行，獲得cDNA全長，并利用NCBI數(shù)據(jù)庫的ORFfinder查找完整的開放閱讀框(ORF)。根據(jù)拼接的序列設(shè)計包含起始密碼子的上游引物FPS-ORF-F(5′-CCATCTATAGCTCCGACGATGGC-3′)和包含終止密碼子的下游引物FPS-ORF-R(5′-CTACTTCTGCCTCTTGTAAATC-3′)，以cDNA為模板擴增基因的完整開放閱讀框。反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)程序為:94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)TA克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP 10，挑取陽性轉(zhuǎn)化子測序。

注：(a)為核心片段；(b)為3′-RACE；(c)為5′-RACE；(d)為FrFPS基因的開放閱讀框。圖1 FrFPS基因克隆電泳結(jié)果

1.4 序列的生物信息學(xué)分析

利用NCBI的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov./BLAST/)進行基因和蛋白質(zhì)序列同源性比對。ExPASy的ComputepI/MW在線分析蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、等電點等理化性質(zhì)。NCBI在線分析工具CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析氨基酸保守結(jié)構(gòu)域。SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_server.html)在線分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，并通過SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)進行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽分析。PSORT(https://www.genscript.com/psort.html)預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。ClustalX 2.1和MEGA 6.0進行序列的多重比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 FrFPS基因響應(yīng)不同海拔梯度應(yīng)答的表達(dá)分析

根據(jù)克隆的暗紫貝母FrFPS序列，設(shè)計熒光定量PCR上游引物FrFPS-F：5′-AGGCGAGGTCAGCCTTGTTG-3′和下游引物FrFPS-R：5′-CATCTGCCCCGAAGCAGTCT-3′，以暗紫貝母18 srRNA(KF 906209.1)為內(nèi)參，設(shè)計上游引物Fr 18 s-F：5′-GCGACGTTCGCTCTCTATCCATAC-3′和下游引物Fr 18 s-R：5′-TGGTTCACGGGATTCTGCAA-3′。引物使用在線Primer 3軟件設(shè)計(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer 3/primer 3_www.cgi)。分別提取海拔梯度在3 200 m、3 400 m、3 600 m和3 800 m的暗紫貝母鱗莖、莖、葉的RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板，使用Takara的SYBR?PremixEx TaqTM試劑盒進行qRT-PCR檢測，在7300 Realtime PCR System上進行擴增并實時收集數(shù)據(jù)。15μL反應(yīng)體系[SYBR Premix Ex Taq(2×)7.5μL；ROX Reference Dye(50×)0.3μL；上下游引物(2μM)各1μL;cDNA模板2μL;ddH2O 3.2μL]，反應(yīng)程序為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。每處理設(shè)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)分析得到各個樣品的CT值，實驗結(jié)果采用2-ΔGt的方法進行計算。

1.6 不同海拔高度暗紫貝母生物堿含量測定

采集不同海拔高度(3 200 m、3 400 m、3 600 m和3 800 m)的暗紫貝母鱗莖，洗凈烘干過60目篩，經(jīng)前處理后上柱，分別以貝母甲素、貝母乙素和貝母辛為標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC測定鱗莖中的生物堿含量，每個海拔高度3次生物學(xué)重復(fù)，比較不同海拔高度上鱗莖中生物堿含量的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 RACE獲取FrFPS基因全長

以暗紫貝母cDNA為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的其他物種FPS基因保守序列設(shè)計簡并引物，PCR擴增獲得732 bp的核心序列。根據(jù)獲得的中間片段，分別設(shè)計引物進行3′-RACE和5′-RACE，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序表明獲得基因的3′和5′端序列，分別為913 bp和498 bp。利用DNAMAN 6.0軟件將5′和3′端序列進行拼接，獲得1條具有完整開放閱讀框(ORF)全長為1 333 bp的序列。設(shè)計包含起始密碼子和終止密碼子的特異引物擴增基因的ORF，驗證獲得的開放閱讀框序列長度為1 059 bp，編碼352個氨基酸(圖1、圖2)。將該基因命名為FrFPS，序列已提交到NCBI，獲得的登錄號為KX 900485。

2.2 暗紫貝母FrFPS基因的生物信息學(xué)分析

ExPASy在線預(yù)測FrFPS基因的編碼蛋白質(zhì)分子量為40.13 KDa，等電點5.17。通過在NCBI網(wǎng)站中進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白質(zhì)與其他植物法尼基焦磷酸合酶氨基酸序列具有較高的同源性，其中與同為百合科植物的鐵炮百合氨基酸序列同源性最高，達(dá)到95%，其次為同科植物海蔥83%，與油棕82%，與竹節(jié)參、蕙蘭、喜樹、菠蘿、臘梅等的相似性均為81%。相似性在75%以上的植物達(dá)數(shù)十種，表明植物法尼基焦磷酸合酶保守性較高。

SOPMA在線分析表明，F(xiàn)rFPS基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，占60.51%；其次是無規(guī)則卷曲，占21.31%；此外還包括9.94%的延伸鏈和8.24%的β-轉(zhuǎn)角(圖3)。利用NCBI在線分析工具CDD分析保守區(qū)，發(fā)現(xiàn)FrFPS的功能域氨基酸具有5個保守結(jié)構(gòu)域，屬于Isoprenoid-Biosyn-C 1蛋白家族。通過ClustalX 2.1序列比對表明，F(xiàn)rFPS保守結(jié)構(gòu)域氨基酸組成與其他植物一致，其中有2個高度保守的富含天冬氨酸區(qū)域(DDXXD)(圖4)，說明各物種FPS基因在進化過程中相對保守。進一步利用SWISS-MODEL構(gòu)建該蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果顯示FrFPS蛋白主要由多個α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成，α-螺旋在表面和內(nèi)部分布較均勻(圖5)。PSORT預(yù)測分析顯示，F(xiàn)rFPS編碼蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)、線粒體基質(zhì)空間及微體上。SignalP 4.1分析表明FrFPS蛋白中不存在信號肽，為非分泌蛋白。

圖2 FrFPS基因全長cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 FrFPS推導(dǎo)蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

為確立FPS基因在不同植物間的進化關(guān)系，將FrFPS基因編碼的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的鐵炮百合、青蒿、紫花苜蓿、黃芪、煙草、小麥等21個物種的法尼基焦磷酸合酶氨基酸序列進行比對分析，基于鄰接法(NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖6)。結(jié)果表明，包含F(xiàn)rFPS蛋白的共22種氨基酸序列可以聚為兩大類。第一類中，暗紫貝母FPS與同為百合科的鐵炮百合(Liliumlongiflorum，JF 273657.1)和海蔥(Ornithogalumlongebracteatum，KF 509889.1)聚為一個小亞類，然后與芭蕉科的小果野蕉(Musaacuminata，XM_009396239.2)，棕櫚科的海棗(Phoenixdactylifera，XM_008794576.2)、油棕(Elaeisguineensis，XM_010925807.2)，姜科的姜花(Hedychiumcoccineum，AER 12202.1)，鳳梨科的菠蘿(Ananascomosus，XM_020250595.1)，禾本科的小麥(Triticumaestivum，JX 235714.1)和穇子(Eleusinecoracana，KT 824871.1)，木蘭科的樂昌含笑(Micheliachapensis，GQ 214406.1)依次聚合在一起，共同構(gòu)成一個大的分枝。說明暗紫貝母在進化上與這些植物的親緣關(guān)系較近。第二類包括豆科的黃芪(Astragalusmembranaceus，KP 233831.1)、綠豆(Vignaradiatavar.Radiata，XP_014517551.1)、紫花苜蓿(Medicagosativa，ADC 32809.1)，茄科的煙草(Nicotianatabacum，XM_016600471.1)，薔薇科的玫瑰(Rosarugosa，KP 768082.1)，菊科的青蒿(Artemisiaannua，U 36376.1)等，說明暗紫貝母在進化上與這些植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 FrFPS序列與其他FPS氨基酸序列多重比對

圖5 FrFPS三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

2.3 暗紫貝母FrFPS基因響應(yīng)海拔梯度的應(yīng)答

為研究FrFPS基因表達(dá)對不同海拔高度的響應(yīng)，采用實時熒光定量PCR分析FrFPS基因在3 200 m、3 400 m、3 600 m和3 800 m不同海拔高度上暗紫貝母鱗莖、莖和葉中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，F(xiàn)rFPS基因主要在暗紫貝母鱗莖中表達(dá)，葉片和莖中表達(dá)量極低。在不同海拔梯度上，F(xiàn)rFPS基因表達(dá)量呈現(xiàn)出隨海拔梯度升高而降低的趨勢。較低海拔(3 200 m、3 400 m)暗紫貝母鱗莖中FrFPS基因表達(dá)量約為高海拔(3 800 m)鱗莖表達(dá)量的6倍左右(圖7)。表明較低海拔更有利于FrFPS基因的表達(dá)。

圖6 FPS蛋白系統(tǒng)進化分析

2.4 不同海拔高度暗紫貝母生物堿含量

HPLC測定暗紫貝母鱗莖生物堿含量結(jié)果表明，不論以貝母辛或貝母甲為標(biāo)準(zhǔn)品，較低海拔高度(3 200 m和3 400 m)的暗紫貝母鱗莖中的生物堿含量要高于較高海拔(3 600 m和3 800 m)的鱗莖，以海拔3 200 m鱗莖中生物堿含量最高(表1)。這與實時熒光定量PCR測定結(jié)果相似。在鱗莖中未能檢測出貝母乙素。

表1 不同海拔高度暗紫貝母鱗莖生物堿含量

海拔高度(m)生物堿含量/(μg·g-1)(以貝母辛為標(biāo)準(zhǔn)品)含量/(μg·g-1)(以貝母素甲為標(biāo)準(zhǔn)品)320062.9618.23340047.8813.86360047.3713.71380046.0213.32

圖7 FrFPS基因在不同海拔高度的表達(dá)分析

3 討 論

法尼基焦磷酸合酶(FPS)是一種異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，是類異戊二烯途徑的一個重要調(diào)節(jié)酶，催化異戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)合成法尼基焦磷酸(FPP)。FPP是植物體內(nèi)甾體、皂苷、倍半萜等多種次生代謝產(chǎn)物的前體，進一步通過鯊烯合酶催化甾體類、皂苷類、倍半萜類等物質(zhì)的合成[8,17-18]。

本研究克隆的FrFPS基因的編碼產(chǎn)物具有植物法尼基焦磷酸合酶的一般特征：二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，其次是無規(guī)則卷曲，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角較少，分散于整個蛋白質(zhì)中[18]。以IPP為底物的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶等，均含有典型的DDXXD保守結(jié)構(gòu)域[17]。本研究中的暗紫貝母FrFPS基因所推測的肽鏈的103～107氨基酸和242～246氨基酸處同樣有典型的DDXXD保守結(jié)構(gòu)域(圖4)，這與茅蒼術(shù)[16]、三七[17]、陸地棉[18]等植物的FPS基因相似，2個區(qū)域富含天門冬氨酸，認(rèn)為是這類酶的活性中心[17,19]。FrFPS跨膜區(qū)及亞細(xì)胞定位分析表明其無跨膜結(jié)構(gòu)，定位于細(xì)胞質(zhì)，這符合植物FPS不存在跨膜結(jié)構(gòu)域的觀點。通過進化樹分析，暗紫貝母與百合科植物鐵炮百合親緣關(guān)系較近，體現(xiàn)了其在分子系統(tǒng)演化關(guān)系中所處的位置，為其分類地位提供了佐證，也為進一步認(rèn)識植物基因功能提供依據(jù)。

已有研究表明，植物FPS表達(dá)具有組織特異性[20-22]，并且伴隨著類異戊二烯衍生物含量而增加[23]。本研究中FrFPS在暗紫貝母鱗莖中表達(dá)量最高，莖、葉中雖有表達(dá)但量非常低，說明FrFPS具有組織特異性，同時也符合暗紫貝母以鱗莖入藥的傳統(tǒng)。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，暗紫貝母各物候期都是在低海拔部位最先出現(xiàn)，在高海拔部位最遲出現(xiàn)；鱗莖平均單粒重量有隨海拔升高而降低的趨勢[24]。本研究中，較低海拔(3 200 m、3 400 m)暗紫貝母鱗莖中FrFPS表達(dá)量為高海拔(3 800 m)鱗莖中的6倍左右，F(xiàn)rFPS表達(dá)可能是暗紫貝母鱗莖在不同海拔梯度上存在差異的原因之一，也為暗紫貝母人工栽培的適生海拔選擇提供了分子水平的參考依據(jù)。但暗紫貝母的生長發(fā)育及次生代謝產(chǎn)物合成受多種環(huán)境因子的影響，對其他代謝過程中的關(guān)鍵酶基因作用及代謝調(diào)控機制還需進一步研究。

利用FPS基因過量表達(dá)可以有效提高青蒿[25]、人參[26]等藥用植物活性成分的產(chǎn)量，在藥用植物遺傳改良中具有重要作用。本研究首次克隆獲得暗紫貝母FPS基因的全長cDNA，并對其響應(yīng)海拔高度的表達(dá)特性進行了分析，為進一步探索暗紫貝母法尼基焦磷酸合酶在生物堿合成途徑中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。