重組大腸桿菌表達(dá)凝乳酶工業(yè)化研究

王延山 曹沛莉

【摘?要】針對(duì)傳統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)凝乳酶發(fā)酵工藝的不足，在 10 m 3 新型高溶氧發(fā)酵罐上，對(duì)重組大腸桿菌（ Recombinant?E.?Coli）連續(xù)流加補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶進(jìn)行了工業(yè)化研究，優(yōu)化了培養(yǎng)基配方和工藝條件。 結(jié)果表明：優(yōu)化后的培養(yǎng)基以及工藝條件比優(yōu)化前菌體濃度與酶活均具有較大的提升，對(duì)凝乳酶工業(yè)化發(fā)展提供了重要的技術(shù)支持。

【關(guān)鍵詞】凝乳酶;高密度發(fā)酵;培養(yǎng)基;流加培養(yǎng);優(yōu)化

【中圖分類號(hào)】R715???【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A????【文章編號(hào)】1004-7484（2019）12-0112-01

引言

凝乳酶（Chymosin）是奶酪工藝中不可或缺的酶制劑，能使乳中蛋白質(zhì)凝結(jié)成乳酪，在歐美等地制酪市場(chǎng)廣泛應(yīng)用[1]。凝乳酶早期來(lái)源于未斷奶的小牛胃粘膜提取獲得，原料來(lái)源受局限，產(chǎn)能較低，成本較高[2]。隨著重組DNA技術(shù)和發(fā)酵工程的快速發(fā)展，凝乳酶基因成功在基因工程菌大腸桿菌中得到表達(dá)。但是局限于大腸桿菌一般為胞內(nèi)酶，且菌體密度難以提高，總體產(chǎn)量不高等因素的制約，整體產(chǎn)能相對(duì)較低，在工業(yè)化上的應(yīng)用帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)效益較差[3-4]。

本研究在常規(guī)大腸桿菌發(fā)酵所用LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行配方改進(jìn)，采取高營(yíng)養(yǎng)以及無(wú)機(jī)鹽混合配方，并結(jié)合在生物反應(yīng)器中對(duì)重組大腸桿菌高密度發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以此達(dá)到提升產(chǎn)量的目的。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌種?產(chǎn)凝乳酶重組大腸桿菌，由本公司生化實(shí)驗(yàn)室提供

1.1.2?主要儀器?電子分析天平、20L發(fā)酵罐及補(bǔ)料系統(tǒng)、顯微鏡、離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、恒溫?fù)u床等

1.1.3?主要試劑?蛋白胨、酵母粉、氯化銨、消泡劑、甘油、鹽酸硫胺、葡萄糖、微量元素、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氨芐、乳糖、IPTG

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?培養(yǎng)基配制?改進(jìn)前培養(yǎng)基（g/L）

基礎(chǔ)料：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉10g、葡萄糖20g、消泡劑。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：蛋白胨30g、酵母粉30g、氯化鈉2g、葡萄糖60g、硫酸鎂3g，磷酸二氫鈉12g、磷酸氫二鈉24g。

改進(jìn)培養(yǎng)基（g/L）

（1）基礎(chǔ)料：蛋白胨15.65g、酵母粉31.3g、氯化銨2.35g、甘油31.5g、消泡劑、HDM緩沖液43.88ml。

（2）補(bǔ)料培養(yǎng)基：蛋白胨55g、酵母粉110g、氯化銨8.25g、葡萄糖105g、HDM緩沖液150ml、鹽酸硫胺0.055g、微量元素。

（3）HDM緩沖液：磷酸二氫鉀26.6g、磷酸氫二鉀80g、氯化銨26.7g、硫酸鈉13.3g。

1.2.2?菌種培養(yǎng)?從平板上挑取單菌落劃線于LB固體平板，30±1℃培養(yǎng)27h后，在平板上挑選單菌落接入15ml*4（100ml三角瓶）LB液體培養(yǎng)基中，30±1℃，180rpm搖床培養(yǎng)，約15h，轉(zhuǎn)接至150ml*4（1L三角瓶）擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間約25小時(shí)，測(cè)定其OD600值6.0±0.5。

1.2.3?發(fā)酵培養(yǎng)?發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)高溫滅菌后接入培養(yǎng)好的菌種開始培養(yǎng)，溫度37±1℃，pH值利用氫氧化鈉和鹽酸自動(dòng)控制維持6.5-7.5，溶氧控制在30%以上。通過(guò)補(bǔ)料維持發(fā)酵所需碳源和氮源。通過(guò)添加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)凝乳酶，發(fā)酵結(jié)束收集菌體。

2 結(jié)果與分析

2.1?培養(yǎng)基優(yōu)化后對(duì)產(chǎn)量的影響

由表1對(duì)比試驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果可知，菌體總量增加了74.65%，過(guò)程數(shù)據(jù)顯示優(yōu)勢(shì)明顯，目的產(chǎn)物包涵體的單位酶活力有所提高。這是因?yàn)樾屡浞皆趶?fù)合碳源氮源方面豐富于原LB培養(yǎng)基，發(fā)酵過(guò)程啟動(dòng)速度較快，生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯，優(yōu)化后培養(yǎng)基用甘油替代了優(yōu)化前培養(yǎng)基的葡萄糖，甘油更有利于微生物的代謝利用。同時(shí)，優(yōu)化后培養(yǎng)基中增加幾種緩沖鹽類，使得反應(yīng)體系pH值變化相對(duì)較緩和，不會(huì)因?yàn)榫w生長(zhǎng)較快，導(dǎo)致的反應(yīng)體系中pH值變化劇烈，影響菌體生長(zhǎng)代謝。微量元素的加入也有利于微生物的生長(zhǎng)，微量元素能夠構(gòu)成有機(jī)化合物，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓，恒定微生物發(fā)育生長(zhǎng)條件，參與酶系反應(yīng)，維持酶的活性，也可以作為自養(yǎng)微生物的能源，供給生命活動(dòng)所需的能量。

2.2?不同比生長(zhǎng)速率對(duì)產(chǎn)量的影響?為了進(jìn)一步提高菌體密度和蛋白產(chǎn)量，我們采用了指數(shù)流加策略。指數(shù)流加方式是目前較為有效的流加策略，它不僅可以根據(jù)菌體密度的增加和發(fā)酵液體積的增大，改變流加速率， 還可以控制恒定的比生長(zhǎng)速率，從而避免乙酸的抑制和副產(chǎn)物的形成[5-6]。實(shí)驗(yàn)將比生長(zhǎng)速率分別設(shè)定為0.1h-1、0.2h-1、0.3h-1，在A600達(dá)到100時(shí)，開始添加IPTG誘導(dǎo)12h。結(jié)果見表2。

由上表可知，在指數(shù)流加方式下，0.2h-1的比生長(zhǎng)速率較其它比生長(zhǎng)速率相比，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得較高的菌體濃度，且獲得較高的酶活。這是因?yàn)?，發(fā)酵過(guò)程中，過(guò)低的補(bǔ)料速度會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)缺陷，菌體生長(zhǎng)得不到充分的營(yíng)養(yǎng)和能量需求。而過(guò)高的補(bǔ)料速度則會(huì)導(dǎo)致乙酸及代謝副產(chǎn)物過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致其它代謝途徑過(guò)于旺盛，爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)與能量，溶氧需求急劇增加，進(jìn)而影響菌體生長(zhǎng)及蛋白表達(dá)途徑正常代謝。

3?結(jié)論

重組大腸桿菌高密度發(fā)酵是酶制劑產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問(wèn)題。目前主要問(wèn)題包括工程菌的表達(dá)穩(wěn)定性、針對(duì)性培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵機(jī)理的調(diào)控以及如何去避免染菌的威脅。這些問(wèn)題的解決與豐富工程菌理論、完備檢測(cè)與調(diào)控手段以及生物反應(yīng)器的改進(jìn)息息相關(guān)。隨著生物技術(shù)工藝與設(shè)備的不斷高質(zhì)量發(fā)展，高密度高表達(dá)的酶制劑產(chǎn)品將越來(lái)越多的能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

參考文獻(xiàn)

[1]?孟廣震. 凝乳酶研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 1987（02）：46-48.

[2]?孫海蛟， 呂敏， 黃艾祥. 我國(guó)干酪凝乳酶研究及應(yīng)用現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)乳業(yè)， 2008， 000（005）：50-52.

[3]?曾祺， 張志國(guó). 微生物凝乳酶研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)乳品工業(yè)， 2019， 047（003）：30-36.

[4]?龍建銀， 王會(huì)信. 外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的研究進(jìn)展[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 1997， 024（002）：126-132.

[5]?李民， 陳常慶. 重組大腸桿菌高密度發(fā)酵研究進(jìn)展[J]. 生物工程進(jìn)展， 2000.

[6]孫艷， 王長(zhǎng)城， 張玲， et al. 重組大腸桿菌產(chǎn)膽固醇氧化酶的指數(shù)流加策略[J]. 化工進(jìn)展， 2010（01）：130-133.

作者簡(jiǎn)介：王延山（1985.04.06），男，漢，江蘇省鹽城市，本科，化工工程助理工程師，研究方向：酶制劑產(chǎn)業(yè)化。