離子色譜法測(cè)定銀耳湯中的硝酸鹽和亞硝酸鹽

林淼 白冰 時(shí)文興

摘要 [目的]建立銀耳湯中硝酸鹽和亞硝酸鹽的離子色譜測(cè)定方法。[方法]銀耳樣品經(jīng)純水蒸煮提取，3%乙酸沉淀蛋白質(zhì)后，低溫離心，上清液依次過C18小柱、Ag柱、Na柱，經(jīng)濾膜過濾凈化后，由電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)樣品中的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量。[結(jié)果]硝酸鹽（以NO3-計(jì)）和亞硝酸鹽（以NO2-計(jì)）分別在0.2～2.0和0.02～0.20 mg/L呈良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)R2均大于0.999 6。該方法硝酸鹽和亞硝酸鹽檢出限分別為0.4和0.2 mg/kg，硝酸鹽的回收率為89.8%～96.1%，亞硝酸鹽的回收率為85.1%～95.3%。[結(jié)論]該方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用于銀耳湯中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞 銀耳湯;離子色譜法;硝酸鹽;亞硝酸鹽

中圖分類號(hào) TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）19-0209-03

Abstract [Objective] The research aimed to establish an ion chromatographic method for the determination of nitrate and nitrite in tremella soup.[Method] After cooking with pure water，protein precipitation using 3% acetic acid，and centrifugaion at low temperature，the supernatant was filtered through C18 column，Ag column and Na column for injection analysis.And then it was analyzed by ion chromatogrephy，and the conductivity dectector was used to detect nitrate and nitrite in tremella soup.[Result] Nitrate （calculated as NO3-） and nitrite （calculated as NO2-） showed good linearity at 0.2-2.0 and 0.02-0.20 mg/L，respectively，and the determination coefficient R2 was greater than 0.999 6.This method detection limit was 0.4 mg/kg for nitrate and 0.2 mg/kg for nitrite.The recovery rate of nitrate was 89.8%-96.1%，and the recovery rate of nitrite was 85.1%-95.3%.[Conclusion] This method is accurate and reliable，and suitable for determination of nitrate and nitrite in tremella soup.

Key words Tremella soup;Ion chromatogrephy method;Nitrate;Nitrite

硝酸鹽和亞硝酸鹽是2種經(jīng)常使用的食品添加劑，在肉制品加工業(yè)中常被用作發(fā)色劑，可以使其保持良好的色澤，并起到一定的防腐和增強(qiáng)食品風(fēng)味的功效。即使沒有人工添加，蔬菜在生長(zhǎng)過程中也容易富集硝酸鹽[1]。大量攝入硝酸鹽可使人中毒，如搶救不及時(shí)會(huì)危及生命。同時(shí)，硝酸鹽通過唾液、胃和血管還原成亞硝酸鹽[2]，亞硝酸鹽的含量主要受硝酸鹽含量的影響[3]。亞硝酸鹽在人體內(nèi)外與仲胺類作用可形成亞硝胺類物質(zhì)，當(dāng)其在人體內(nèi)達(dá)到一定計(jì)量時(shí)，就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生致癌、致畸、致突變的危害[4]。研究發(fā)現(xiàn)，攝入硝酸鹽含量較高的食物會(huì)增加人們患乳腺癌、腸胃癌、高鐵血紅蛋白癥等疾病的概率[5-7]。當(dāng)患有胃腸道疾病或者胃酸過少時(shí)，胃腸道內(nèi)的細(xì)菌會(huì)把硝酸鹽還原成亞硝酸鹽而導(dǎo)致中毒，就是人們常說的“腸原性紫紺癥”[8]。

銀耳又名白木耳、血耳，為銀耳科植物銀耳的子實(shí)體。銀耳有菌中之冠的美譽(yù)，性味甘平，含有天然植物性膠質(zhì)多糖，可以長(zhǎng)期服用，具有補(bǔ)腎潤肺、生津止咳、強(qiáng)心健腦、滋陰養(yǎng)胃、益氣和血、增強(qiáng)免疫功能之功效[9-11]。由于銀耳是一類營腐生生長(zhǎng)的真菌，因腐生質(zhì)中含有豐富的氮源（硝酸鹽類），在該基質(zhì)上生長(zhǎng)時(shí)，造成銀耳不可避免地會(huì)富集大量的硝酸鹽[12]。銀耳煮湯后，隨著放置時(shí)間的增長(zhǎng)，湯中富集的亞硝酸鹽也會(huì)增多，因此，有必要建立一種準(zhǔn)確快速的檢測(cè)方法，用于銀耳湯中硝酸鹽和亞硝酸鹽的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀耳（Tremella fuciformis）干樣購自某電商。OnGuard ⅡAg柱（1? mL）、OnGuard ⅡNa柱（1? mL），賽默飛世爾科技（中國）有限公司;冰醋酸（色譜純），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司;50%～52%氫氧化鈉溶液，美國Fluka公司;硝酸根離子（NO3-）標(biāo)液（1 000 mg/L，水基體）、亞硝酸根離子（NO2-）標(biāo)液（1 00 mg/L，水基體）均購自上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院;分析中所用水均為超純水（>18 MΩ·cm）;C18小柱（3? mL/500 mg），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;10? mL注射器，岳陽明康醫(yī)用材料有限公司;0.22 μm水性濾膜，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 主要儀器

離子色譜ICS3000，美國Dionex公司，配備四元梯度泵和電導(dǎo)檢測(cè)器、陰離子抑制器;Chromeleon 6.7 色譜工作站; ST16R型冷凍高速離心機(jī)，Therom公司;AL204-IC型電子天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司; C21-WK2102型電磁爐及鍋具，美的集團(tuán);ELGA型超純水儀，PURELAB Ultra公司。

1.3 溶液配制

淋洗液：移取50%氫氧化鈉5.2? mL，用去離子水溶解至1 L，此濃度為100 mmol/L。乙酸溶液（3%）：量取乙酸3 mL于100 mL容量瓶中，以水稀釋至刻度，混勻。

亞硝酸鹽和硝酸鹽混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：移取亞硝酸鹽和硝酸鹽混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水逐級(jí)稀釋，制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，亞硝酸根離子濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/L;硝酸根離子濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、15、2.0 mg/L;該溶液臨用現(xiàn)配。

1.4 色譜條件

陰離子交換色譜分析柱為Dionex IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm（帶IonPac AG11-HC型保護(hù)柱 4 mm×50 mm），柱溫30 ℃;進(jìn)樣體積25 μL;淋洗液：氫氧化鈉溶液，濃度為6～70 mmol/L;洗脫梯度為6 mmol/L 30 min，70 mmol/L 5 min，6 mmol/L 5 min;流速1.0 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

由于銀耳干樣吸水量很高，如果稱樣量較大會(huì)導(dǎo)致無法提取銀耳湯溶液，而且銀耳多糖含量較高，經(jīng)高溫蒸煮后的溶液較黏稠，同時(shí)銀耳中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，干擾較多，雜質(zhì)會(huì)干擾目標(biāo)峰，而稱樣量過小則達(dá)不到檢測(cè)要求的靈敏度，因此選擇合適的稱樣量對(duì)試驗(yàn)有很大的影響。研究考察了10.0、20.0、40.0、80.0和100.0 g這5個(gè)稱樣量，對(duì)比不同稱樣量樣品的色譜圖，參考峰形、靈敏度和基線，結(jié)果顯示稱樣量40.0 g效果最佳。

2.2 沉淀劑的選擇

去除蛋白質(zhì)一般是采用有機(jī)溶劑、酸沉淀、加熱變性或者用重金屬沉淀等方法。由于銀耳樣品的基質(zhì)復(fù)雜，在使用有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀時(shí)，雜質(zhì)物質(zhì)也會(huì)在過C18小柱時(shí)同時(shí)洗脫，不易凈化。使用加熱變性法不適用于銀耳，因?yàn)樵摲椒ê苋菀自斐摄y耳糊化變性，沉淀效果不好。使用重金屬沉淀，常用的有亞鐵氰化鉀和乙酸鋅，則會(huì)引入大量鋅、鉀、鐵等金屬離子污染色譜柱，使離子色譜柱效降低，壽命縮短。試驗(yàn)表明，采用3%的乙酸沉淀蛋白質(zhì)效果最好，雜質(zhì)峰相對(duì)較少。

2.3 樣液分離及初步凈化

由于銀耳湯樣品較黏稠，高溫易糊化，不能采用濾紙過濾的方法。為方便進(jìn)行批量操作，該試驗(yàn)采用50? mL離心管進(jìn)行沉淀，低溫離心分離樣液。上清液依次過C18小柱、Ag柱、Na柱進(jìn)行凈化。其中Ag柱主要去除Cl-，避免過濾的Cl-干擾亞硝酸鹽的檢測(cè)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

由表1可知，硝酸鹽在0.2～2.0 mg/L、亞硝酸鹽在0.02～0.20 mg/L濃度與峰面積的線性良好，硝酸鹽和亞硝酸鹽的方法檢出限分別為0.4和0.2 mg/kg，定量限分別為1.2和0.6 mg/kg。由圖1可知，硝酸鹽和亞硝酸鹽在26 min內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)完全分離，硝酸鹽和亞硝酸鹽色譜峰分離度良好，能夠進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。應(yīng)用此方法對(duì)銀耳湯實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果令人滿意，如圖2～3所示。

2.5 精密度、重復(fù)性和回收率

按上述優(yōu)化后的條件制備銀耳溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，硝酸鹽和亞硝酸鹽的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%，分別平行稱取6份銀耳湯樣品，依次進(jìn)樣分析，硝酸鹽和亞硝酸鹽峰面積的RSD均小于10%，表明方法精密度、重復(fù)性良好。

由表2可知，向銀耳湯樣品中分別添加不同水平的硝酸鹽和亞硝酸鹽，回收率為81%～101%，表明回收率良好。

2.6 樣品測(cè)定結(jié)果

為貼近實(shí)際生活需要，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用3種不同蒸煮操作方案、2種保存方式（室溫20 ℃和冷藏4 ℃）。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3），用去離子水處理過的銀耳湯中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量均較低，且在室溫和冷藏條件下，隨著保存時(shí)間的增加并無明顯變化。用自來水煮的銀耳湯無論是否加入冰糖，其硝酸鹽和亞硝酸鹽含量均顯著高于用去離子水煮的銀耳湯，并且隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，硝酸鹽含量呈逐步下降的趨勢(shì)，亞硝酸鹽含量逐步上升。同樣用自來水煮后保存相同的時(shí)間，室溫儲(chǔ)存條件下亞硝酸鹽的增加幅度明顯高于冷藏保存條件;用自來水煮的過程中加入冰糖，在室溫保存條件下保存48 h，其亞硝酸鹽含量增加特別明顯。根據(jù)該試驗(yàn)的結(jié)果，建議在煮銀耳時(shí)盡量現(xiàn)煮現(xiàn)喝，不要過長(zhǎng)時(shí)間保存;如果因?yàn)楦鞣N原因需要保存一段時(shí)間食用，也需要冷藏保存，盡量先不要加冰糖，在需要食用時(shí)加熱過程中再加入冰糖;如果條件允許，可以使用純凈水煮銀耳，可以有效防止亞硝酸鹽的生成。

3 討論

隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)飲食的營養(yǎng)成分以及食品安全都倍加重視，銀耳由于其具有很高的藥用價(jià)值而受到大家的喜愛。如何健康食用銀耳、減少危害是人們最為關(guān)心的內(nèi)容。該方法采用離心分離樣液，并過C18小柱，解決了樣品前處理液黏稠及過濾后樣液不澄清等技術(shù)問題。結(jié)果表明，該試驗(yàn)采用的方法操作簡(jiǎn)便高效、準(zhǔn)確度高、數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好，適用于大批量銀耳中硝酸鹽和亞硝酸鹽的測(cè)定，對(duì)銀耳的質(zhì)量控制和指導(dǎo)普通市民食用銀耳具有重大意義。

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