一例種鴨病毒性腸炎與圓環(huán)病毒混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

朱衛(wèi)華 趙亭 趙萬(wàn)升 李靜 范明杰 張莉莉 李玉峰

中圖分類號(hào)：S858.314.4+3? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? ?文章編號(hào)：1673-1085（2019）11-0051-03

鴨病毒性腸炎（Duck viral enteritis，DVE）又稱鴨瘟，是雁形目鴨科成員的一種急性、接觸性、敗血性傳染病，主要侵害宿主的消化道、內(nèi)臟和淋巴器官，造成消化道出血、淋巴器官受損和實(shí)質(zhì)性器官的退行性病變。該病呈世界分布，在我國(guó)主要養(yǎng)鴨地區(qū)廣泛存在，但主要呈地方性流行。該病的病原是鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus， DEV），現(xiàn)歸于皰疹病毒科馬立克氏病毒屬。該病毒可以感染各品種和日齡的鴨，發(fā)病率和死亡率最高可達(dá)100%，是對(duì)鴨致病性最強(qiáng)的病原之一，一旦感染往往會(huì)對(duì)鴨群造成嚴(yán)重?fù)p失。黃引賢等[1]最早于1959年報(bào)道了該病在我國(guó)的存在，之后我國(guó)研發(fā)出了針對(duì)該病的弱毒疫苗，起到了較好的防控效果。

鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus，DCoV）感染最早報(bào)道于德國(guó)[2]，據(jù)稱能夠引起鴨生長(zhǎng)遲滯，發(fā)育不良，并造成鴨免疫抑制增加其他病原繼發(fā)感染的可能。DCoV呈世界性分布，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)其在養(yǎng)鴨業(yè)中的陽(yáng)性率較高。DCoV可以感染北京鴨、番鴨等多個(gè)品種，根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)可以分成I型和II型[3]，目前在我國(guó)主要養(yǎng)鴨地區(qū)流行毒株以I型為主。

近來(lái)某養(yǎng)殖公司陸續(xù)出現(xiàn)育成期種鴨發(fā)生DVE的病例，發(fā)病時(shí)間多在10～16周齡，發(fā)病鴨群表現(xiàn)精神不振，采食量下降，排白色或綠色稀糞，死亡率達(dá)到每天1%～3%，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷為DEV與DCoV混合感染，現(xiàn)報(bào)道如下：

1? 材料與方法

1.1? 病料采集與處理? 發(fā)病鴨來(lái)自山東地區(qū)某種鴨場(chǎng)15周齡育成鴨，外觀精神萎靡，有的表現(xiàn)頭頸腫大。剖檢可見(jiàn)心肌出血或心肌蒼白，肝臟腫大出血，脾臟斑駁狀或者出血，有的胰腺壞死;腸道有明顯的腸炎癥狀，泄殖腔出血明顯。多數(shù)病死鴨食道有典型的條紋狀出血或壞死。采集病死鴨肝臟、脾臟和胰腺等作為病料，混合后以1：5比例加入滅菌生理鹽水，使用組織勻漿機(jī)將病料打碎形成混懸液，置-80℃凍融2次，4℃ 8000g離心15min，取上清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)。

1.2? 實(shí)驗(yàn)室PCR診斷? 病料上清按照試劑盒（Axyen）方法提取病毒核酸，利用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的針對(duì)禽流感病毒（AIV）、鴨腸炎病毒（DEV）、鴨肝炎病毒（DHV）、鴨呼腸孤病毒（DReoV）、鴨細(xì)小病毒（DPV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）和鴨圓環(huán)病毒（DCoV）等常見(jiàn)病原的引物，通過(guò)PCR或RT-PCR方法進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)。

1.3? 病毒分離? 病料上清加入適量抗生素（卡那霉素1000IU/mL），混合后通過(guò)絨毛尿囊膜途徑接種12日齡健康鴨胚，每胚0.1mL。接種后每天觀察鴨胚死亡情況，收集死亡鴨胚絨尿膜和尿囊液，按照以上方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室PCR核酸檢測(cè)。

1.4? 動(dòng)物回歸試驗(yàn)? 將病毒分離物以生理鹽水1：100稀釋，通過(guò)肌肉注射途徑接種5只10日齡健康雛鴨，每只接種0.2mL，另設(shè)5只作為對(duì)照，肌肉注射生理鹽水0.2mL/只，每天觀察記錄試驗(yàn)鴨發(fā)病和死亡情況。采集死亡試驗(yàn)鴨肝臟、脾臟等病料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病毒核酸檢測(cè)。

2? 結(jié)果

2.1? 實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)? 病毒核酸檢測(cè)結(jié)果顯示，DEV和DCoV-I型為陽(yáng)性，其他常見(jiàn)病毒均為陰性。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2? 病毒分離? 病料接種鴨胚于接種后72～96h死亡，死亡鴨胚表現(xiàn)絨尿膜水腫，胚體出血。分離病毒核酸檢測(cè)結(jié)果為DVE陽(yáng)性，其他病毒均為陰性，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3? 動(dòng)物回歸試驗(yàn)? 攻毒組試驗(yàn)鴨于攻毒后96h開(kāi)始發(fā)病，表現(xiàn)精神沉郁，食欲廢絕，于144h全部死亡，剖檢可見(jiàn)肝臟壞死出血，食道條紋狀出血等典型病毒性腸炎癥狀，5只試驗(yàn)鴨病料實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)均為DEV陽(yáng)性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

綜合實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)、病毒分離和動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果，將該病例判定為鴨病毒性腸炎與圓環(huán)病毒混合感染。

3? 討論

DVE是養(yǎng)鴨生產(chǎn)中的傳統(tǒng)疫病，一般呈地方流行或散發(fā)，但該病近年來(lái)有發(fā)病增加趨勢(shì)。根據(jù)從業(yè)者反映，現(xiàn)有的弱毒疫苗對(duì)該病的保護(hù)率有所下降，鴨群發(fā)生病毒性腸炎后用弱毒疫苗緊急免疫效果不理想，有的養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病后將緊急免疫劑量提高到十倍以上仍不奏效。自2006年以來(lái)，國(guó)內(nèi)多次出現(xiàn)“新型鴨瘟”疫情的報(bào)道[4， 5]，該疫情的流行特點(diǎn)、發(fā)病癥狀等均與傳統(tǒng)病毒性腸炎相似，病原也具有皰疹病毒的特征，但中和試驗(yàn)證明其與DEV不同。近年來(lái)的病例實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果病原仍是DEV，弱毒疫苗也具有一定的保護(hù)效果，說(shuō)明這些病例不是“新型鴨瘟”。報(bào)道顯示，這些流行毒株與疫苗株和原參考株僅有個(gè)別基因差異，從分子水平來(lái)看沒(méi)有發(fā)生明顯變異[6， 7]。

在本病例中，除DEV以外還檢測(cè)到DCoV-I型病毒。DCoV自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，世界上多個(gè)國(guó)家報(bào)道了該病原的存在，我國(guó)的福建、浙江、廣東、廣西、山東、安徽、河南等主要養(yǎng)鴨地區(qū)均有該病報(bào)道，流行病學(xué)調(diào)查顯示以上主要省份DCoV感染總陽(yáng)性率在30%左右，而個(gè)別鴨場(chǎng)陽(yáng)性率可達(dá)80%以上[8]。感染DCoV病鴨表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩、體況消瘦、羽毛發(fā)育障礙等癥狀，病理學(xué)分析表明DCoV可以造成法氏囊、胸腺、脾臟、肝臟等器官損傷，尤其是引起淋巴細(xì)胞凋亡而造成免疫抑制，從而加劇其他病原的致病性[9]。由于DCoV感染普遍存在，近來(lái)DVE病例經(jīng)常能夠同時(shí)檢測(cè)到DCoV，因此推測(cè)這可能是DVE免疫失敗的原因之一。但是，由于缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)，DEV和DCoV是否能夠協(xié)同致病以及其協(xié)同致病機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

DCoV目前尚無(wú)有效的分離培養(yǎng)方法，也沒(méi)有商品化的疫苗產(chǎn)品可供使用（因此在病毒分離時(shí)，僅分離到DEV）。對(duì)于該病的防控只能采取嚴(yán)格的生物安全手段，避免使用劣質(zhì)的粗制抗體以防止該病的人為傳播。另外，還應(yīng)該關(guān)注該病在父母代及祖代種鴨上的感染情況，必要時(shí)采取有效的凈化措施，切斷病毒的垂直傳播途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1]? 黃引賢，歐守杼，鄺榮祿，等. 鴨瘟病毒的研究 [J]. 華南農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)， 1980， （01）： 21-36.

[2]? Hattermann K.， Schmitt C.， Soike D.， Mankertz A. Cloning and sequencing of Duck circovirus （DuCV） [J]. Archives of virology， 2003， 148（12）： 2471-2480.

[3]? 萬(wàn)春和，程龍飛，傅光華，等.鴨圓環(huán)病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型PCR-RFLP鑒別診斷方法的建立[J].中國(guó)家禽， 2016， 38（17）： 53-55.

[4]? 刁有祥，呂桂霞，鄭福英，等.一種新型鴨瘟病原的分離鑒定及其特性[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2006， （02）： 136-139.

[5]? 丁巧玲，袁生，李建軍，等.廣東部分地區(qū)發(fā)生“新型鴨瘟”的初步診斷報(bào)告[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2006，（04）： 28+32.

[6]? 傅光華，陳翠騰，劉榮昌，等.鴨瘟病毒新近分離毒株部分基因變異分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2018，49（10）：2215-2222.

[7]? 姜甜甜， 張大丙. 鴨瘟強(qiáng)毒與疫苗毒的囊膜糖蛋白序列比較 [J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志， 2013， 49（02）： 3-7.

[8]? 黃瑜，萬(wàn)春和，彭春香，等.鴨圓環(huán)病毒感染的臨床癥狀 [J].中國(guó)家禽， 2013， 35（05）： 47-48.

[9]? 李鵬飛.鴨圓環(huán)病毒在人工感染雛鴨體內(nèi)的侵染分布、組織病理學(xué)觀察及其致凋亡作用的研究[D].雅安： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015.