基因芯片技術對結核分枝桿菌利福平及異煙肼的耐藥性檢測研究

孫桂英，趙 剛，沈 燕，徐密琴，高勝利，俞 凈,鈕志林

(蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院感染科，江蘇蘇州 215200)

結核病是因感染結核分枝桿菌(Mtb)而發(fā)生的并具有傳染性的慢性疾病，可累及全身各種器官，最為常見是以肺部受累形成的肺結核病。根據(jù)WHO的2016年結核病年度報告顯示[1]，肺結核病在2015年的全球新發(fā)病例高達1 040萬例，死亡病例為140萬例，超過HIV；同年我國新發(fā)生肺結核病91萬例，僅次于印度(238萬例)與印尼(102萬例)位列全球第3位，死亡病例約3.5萬。當前,我國是全球22個結核病高負擔國家及27個耐多藥(MDR)結核病高負擔國家之一[2]。自1993年WHO宣布“全球結核病緊急狀態(tài)”以來，多個國家及地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)了1例或多例MDR結核病。全球有3.9%的新發(fā)病例和21%的復診患者患有MDR結核病[1]。結核病耐藥已成為全世界結核病疫情控制的巨大阻礙。建立有效且快速的Mtb耐藥檢測方法對臨床合理用藥及結核病疫情控制意義重大。長期以來，傳統(tǒng)羅氏比例法由于操作簡單、經濟、方便、易于推廣等因素而被廣泛應用于Mtb藥敏試驗，并被視為結核病診斷的“金標準”。但該方法耗時較久，步驟繁瑣，已很難滿足當前對MDR結核病診斷及時性的需求。伴隨著Mtb耐藥分子機制的闡明，幾種快速檢測結核病耐藥的分子藥敏檢測技術得以問世，其中基因芯片技術日益受到重視。與此同時，近年來受耐藥率不斷升高的影響，利福平(RFP)與異煙肼(INH)這一經典的抗結核病一線藥物組合在蘇州吳江地區(qū)的治療效果有所降低。本研究采用基因芯片技術對Mtb的耐藥性進行檢測，并與傳統(tǒng)羅氏比例法藥敏試驗結果進行對比，同時采用DNA測序驗證，旨在探討基因芯片法對蘇州地區(qū)Mtb臨床分離株RFP與INH耐藥性快速檢測的實用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年5月1日至2018年12月31日在蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院感染科發(fā)現(xiàn)的痰液標本涂片陽性的結核病患者。以無菌容器連續(xù)3 d采集所有患者的第1口晨痰2～5 mL并及時送檢。

1.2試劑與儀器 晶芯?系列試劑或儀器均購自博奧生物公司，包括核酸快速提取儀(ExtractorTM 36)、芯片洗干儀(SlideWasherTM 8)、芯片雜交儀(BioMixerTM Ⅱ)、微陣列芯片掃描儀(LuxScanTM10K-B)、Mtb耐藥基因檢測試劑盒與菌種鑒定試劑盒；實時PCR擴增儀(美國伯樂)，改良羅氏培養(yǎng)基(海博生物)，PNB與TCH菌種鑒定培養(yǎng)基。

1.3方法

1.3.1羅氏培養(yǎng)藥敏試驗 嚴格按照《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[3]進行試驗操作。采用2倍于痰標本量的標本消化液進行樣本前處理，接種至改良羅氏培養(yǎng)基后進行恒溫(37 ℃)培養(yǎng)，觀察到陽性培養(yǎng)結果后即行比例法藥敏試驗及菌種鑒定，陰性培養(yǎng)結果延長培養(yǎng)時間，最長不超過8周。將臨床分離Mtb的初生長2周菌落研磨并配成菌懸液，濃度1 mg/mL，梯度稀釋，目標濃度分別為10-2mg/mL與10-4mg/mL，分別滿環(huán)沾取并接種至含RFP(40 μg/mL)與INH(0.2 μg/mL)的藥敏試驗培養(yǎng)基，同時采用PNB與TCH培養(yǎng)基鑒定菌種。所有樣本完成以上處理后均進行恒溫(37 ℃)培養(yǎng)，4周后觀察結果。本研究以Mtb標準菌株H37RV為質控菌株。

1.3.2基因芯片檢測 選擇RFP耐藥基因rpoB及INH耐藥基因katG與inhA作為本次檢測的目標基因，檢測Mtb中以上基因啟動子的野生型(wt)及多種突變型(mt)，具體實驗操作嚴格按照試劑盒說明書及實驗室操作標準程序進行。(1)采用核酸快速提取儀進行核酸提?。?2)在提取好核酸的離心管中加入PCR擴增試劑進行PCR擴增；(3)在PCR擴增反應結束后對標本進行芯片雜交，擴增產物按說明書加雜交緩沖液加入芯片，放入56 ℃水浴箱2 h；(4)芯片雜交結束后，將芯片按照說明書所配置好的洗滌液進行洗滌，洗滌后進行干燥；(5)采用微陣列芯片掃描儀對干燥后芯片進行掃描，軟件讀取信號并自行判讀結果。

1.3.3DNA測序驗證 對經羅氏比例法檢測的Mtb陽性菌株，進行3個目標基因耐藥相關區(qū)域擴增產物的DNA測序，具體測序工作由博奧生物公司完成，采用第一代DNA測序技術雙脫氧鏈終止法進行核酸測序。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，對配對計數(shù)資料進行交叉制表下的χ2檢驗分析兩種檢驗方式是否存在差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；采用Kappa檢驗分析兩種檢驗方法的結果一致性，Kappa≥0.75為一致性良好。

2 結 果

2.1標本檢測情況 本研究共納入300例痰液涂片陽性肺結核患者的共計900份痰標本，排除31份(3.44%)培養(yǎng)陰性及7份(0.78%)培養(yǎng)污染標本后對862份標本進行了藥敏試驗與菌種鑒定。862份標本中有4份(0.46%)藥敏試驗失敗，5份(0.58%)菌種鑒定為非結核分枝桿菌(NTM)，最終有853份可用于藥敏分析。900份痰標本中，基因芯片檢測未檢測到Mtb的有11份(1.22%),NTM9份(1.00%)，結果不能判定的有17份(1.89%)，最終有863份可用于藥敏分析。綜合藥敏試驗與基因芯片檢測結果，最終有829份標本的檢測結果可用于藥敏檢測結果的比較。

表1 基因芯片檢測Mtb RFP和INH耐藥相關突變位點情況

注：密碼子改變一欄中的數(shù)字前后字母分別為wt與mt堿基

2.2基因芯片檢測Mtb耐藥基因相關突變位點 基因芯片檢出rpoB突變型菌株109株，包括單一位點突變108株與雙位點突變1株。突變頻率最高的2個位點分別為531位點[56.88%(62/109)]與526位點[23.85%(26/109)]?；蛐酒瑱z出katG/inhA突變型菌株162株，包括katG315單一位點突變112株[69.14%(112/162)]，inhA-15單一位點突變47株[29.01%(47/162)]，katG315位點與inhA啟動子區(qū)域雙突變3株[1.85%(3/162)]。見表1。

表2 基因芯片與羅氏比例法檢測RFP、INH及MDR的結果比較(n)

2.3基因芯片與羅氏比例法檢測RFP、INH及MDR 基因芯片與羅氏比例法檢測RFP耐藥及MDR的效果相近(均P>0.05)，對INH耐藥的檢測差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2；以羅氏比例法為金標準，對基因芯片檢測RFP、INH耐藥及MDR的評估見表3。

表3 基因芯片檢測RFP、INH及MDR的效果評價

注：本研究中，將對RFP與INH均耐藥定義為MDR

2.4基因芯片技術與DNA測序的對比 以DNA測序結果作為金標準，基因芯片檢測RFP耐藥結果不一致為4株，檢測準確率為99.52%(825/829)；檢測INH耐藥結果不一致為2株，檢測準確率為99.76%(827/829)，相關分離菌株檢測結果的不一致基因位點見表4。

表4 基因芯片技術與DNA測序結果對比

3 討 論

隨著全程督導化學治療策略的逐步開展，我國個別地區(qū)結核病疫情開始有所緩解，但全國總體形式嚴峻依舊，區(qū)域化流行趨勢差別仍然存在[4]。鑒于本院所屬蘇州吳江地區(qū)的RFP與INH耐藥結核病病例逐年增多的趨勢明顯，尋求一種及時、準確的耐藥性檢測方法對有效控制本地區(qū)耐多藥結核病的流行與傳播具有重要的現(xiàn)實意義。與傳統(tǒng)方法相比，生物芯片技術具有快速、結果可靠、重復性好、通量高、可以在一個反應中檢測成千基因表達的特點，為Mtb的實驗室診斷開拓了新的途徑，更滿足了當前臨床快速檢測之需求[5]。

研究表明[6-7]，95%以上的RFP耐藥與rpoB基因變異有關。本研究選擇了幾種rpoB基因常見突變位點(511、513、516、526、531、533位點)，考察與蘇州吳江地區(qū)RFP耐藥的相關性。基因芯片檢測結果表明，本地區(qū)RFP耐藥基因rpoB的突變類型包括511(T→C)、513(A→C或C→A)、516(G→T或A→G或A→T)、526(A→G或A→T或C→G或C→T)、531(C→T或C→G)、533(T→C)等單位點突變以及511與516的雙位點突變，其中的531(C→T或C→G)與526(A→G或A→T或C→G或C→T)為主要突變類型，突變率分別為56.88%與23.85%。KatG基因315位點突變與inhA基因-15位點突變不僅普遍存在于耐藥Mtb中，同時也與INH耐藥高度相關?；蛐酒瑱z測結果表明，本地區(qū)INH耐藥基因的主要突變類型為KatG315(G→A或G→C)，突變率達69.14%，與吉林省(68.55%)[8]相似，但與青島(44.83%)[9]及青海(75.5%)[10]等地區(qū)明顯不同，提示KatG315突變存在一定地域差異。后經DNA測序驗證，基因芯片檢測RFP與INH耐藥相關基因突變位點不一致分別為4株與2株，檢測準確率分別為99.52%與99.76%。表明本次采用基因芯片檢測Mtb RFP和INH耐藥相關突變位點的結果是可靠的，總體提示rpoB531、526位點突變及katG315位點突變可能是促成蘇州吳江地區(qū)RFP和INH耐藥病例增多最為關鍵的分子機制。

本研究中，基因芯片與羅氏比例法藥敏試驗檢測RFP耐藥及MDR效果相近，對INH耐藥的檢測結果存在明顯差異，由于羅氏比例法藥敏試驗為金標準，故初步認為基因芯片對INH耐藥檢測的一致性可能不及RFP與MDR。具體效果：以羅氏比例法為金標準，基因芯片檢測RFP耐藥的符合率為97.47%，靈敏度為94.90%，特異度為97.81%，陽性預測值為85.32%，陰性預測值為99.31%，Kappa值為0.952；檢測INH耐藥的符合率為94.45%，靈敏度為78.16%，特異度為99.84%，陽性預測值為99.38%，陰性預測值為93.25%，Kappa值為0.823；檢測MDR的符合率為97.83%，靈敏度為82.50%，特異度為99.47%，陽性預測值為94.29%，陰性預測值為98.16%，Kappa值為0.927。由此可見，基因芯片檢測RFP耐藥及MDR的效果是值得肯定的，但檢測INH耐藥的符合率、靈敏度、陰性預測值以及Kappa值均相對偏低，其中靈敏度明顯偏低，Kappa值低也進一步印證了其與金標準檢測一致性存在一定不足。分析原因可能包括以下幾方面：(1)非基因突變的原發(fā)性耐藥造成對INH的耐藥性，現(xiàn)已探明的機制為多層Mtb胞外包被與活性多藥外排離子泵構成了屏障機制，繼而對藥物運輸產生干擾[11-12]；(2)非KatG與inhA基因(如ahpC、KasA、ndh等)的突變也與INH耐藥具有一定相關性[13]；(3)KatG與inhA基因中除本研究選擇315及-15位點的極少數(shù)其他位點突變也可能引起INH耐藥[14-15]。但總體來看，74.52%的靈敏度尚在可接受范圍，同時基于檢測的及時性優(yōu)勢，筆者認為基因芯片在蘇州吳江地區(qū)臨床INH耐藥菌株的快速診斷價值不應被忽視。

綜上所述，rpoB531、526位點突變與katG315位點突變可能是蘇州吳江地區(qū)Mtb產生RFP和INH耐藥的關鍵性分子機制，基因芯片技術能快速且高準確度地檢測出以上位點的突變情況，值得在本地區(qū)推廣應用于RFP和INH的耐藥性檢測。但基因芯片技術尚不能檢出所有的基因突變位點，本研究中其對INH耐藥的靈敏度相對偏低，提示現(xiàn)階段該技術還必然存在某些局限，但可作為傳統(tǒng)藥敏試驗的重要補充。本課題組擬在后續(xù)研究中酌情增加相關基因位點進行檢測，以期進一步提高本地區(qū)對RFP和INH耐藥性檢測的敏感度。