光周期對(duì)龍眼胚性愈傷組織類黃酮類胡蘿卜素含量及合成相關(guān)基因的表達(dá)影響

朱寧，焦楠，張舒婷，李曉斐，賴鐘雄

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州350002）

龍眼（Dimocarpus longanLour）是無患子科龍眼屬的木本植物，別名桂圓、益智，其種植面積在我國(guó)水果大類中排名第六[1]。龍眼果肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而且具有豐富的藥用價(jià)值，龍眼中所含豐富的次生代謝產(chǎn)物具有豐富的功能。目前我國(guó)對(duì)龍眼胚性愈傷組織生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的報(bào)道還很少，所以了解龍眼胚性愈傷組織的次生代謝工程和代謝調(diào)控非常有意義，該試驗(yàn)研究了不同光周期對(duì)龍眼胚性愈傷組織類黃酮和類胡蘿卜素積累的影響，對(duì)細(xì)胞保護(hù)酶活性的影響以及對(duì)相關(guān)合成基因表達(dá)的影響，旨在為研究光周期對(duì)龍眼胚性愈傷組織生產(chǎn)類黃酮和類胡蘿卜素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

賴鐘雄1994 年誘導(dǎo)并由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所長(zhǎng)期繼代保存的龍眼松散型胚性愈傷組織（‘紅核子’品種LC2 細(xì)胞系）[2-4]。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件。選擇在AgNO3培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況良好并相同的松散型龍眼胚性愈傷組織接種到2，4-D培養(yǎng)基上，分別在全光照24 h/0 h L/D、長(zhǎng)光照18 h/6 h L/D、半光照12 h/12 h L/D、短光照6 h/18 h L/D、全黑暗0 h/24 h L/D 5 種光周期下（25±2）℃處理20 d，其培養(yǎng)條件為：光照培養(yǎng)箱白光，光強(qiáng)為36 μmol/m2·s。

1.2.2 提取與檢測(cè)方法。將不同光周期處理的龍眼胚性愈傷組織分別于50℃烘箱中烘干至恒重，研缽研磨成粉末狀，過40 目篩，于-20℃保存?zhèn)溆?。類黃酮采用超聲波—乙醇提取的方法，參考董慧雪[5]的方法，并根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)加以改動(dòng)。類胡蘿卜素采用酸熱法提取，參照張志軍[6]的測(cè)定方法，并根據(jù)崔彤彤[7]優(yōu)化后的結(jié)果稍作改動(dòng)進(jìn)行提取測(cè)定。

將不同光周期處理后的龍眼胚性愈傷組織分別取適量于液氮中速凍，后轉(zhuǎn)移到-80℃中保存。龍眼胚性愈傷組織中細(xì)胞保護(hù)酶SOD、POD、H2O2、脯氨酸（PRO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性及含量均按照相應(yīng)試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）的提取方法和計(jì)算方法進(jìn)行。

針對(duì)光周期處理的龍眼胚性愈傷組織采用TriPure 試劑盒（Invitrogen）進(jìn)行總RNA 提取，并于-80℃保存?zhèn)溆?，采用SYBR ExScriptTM（Takara，日本）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20℃，以用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析。

以cDNA10×稀釋液為模板進(jìn)行擴(kuò)增，于羅氏LightCycler 480 儀器中進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。采用SYBR premix Ex TaqTMⅡkit（TaKaRa）進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系為20 μL，應(yīng)用2x SYBR 10 μL，cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，40 次循環(huán)。以EF-1a 為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCT方法來計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)取樣點(diǎn)設(shè)3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，試驗(yàn)共設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)類黃酮類與胡蘿卜素含量和產(chǎn)量的影響

2.1.1 類黃酮含量和產(chǎn)量。如圖1 所示，通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析繪制出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程式為y=9.1714x+0.0047，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，該回歸方程可用于樣品類黃酮含量的計(jì)算。

不同光周期對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮的含量和產(chǎn)量的影響如圖2 和圖3 所示。其中6 h 光照處理下龍眼胚性愈傷組織中類黃酮的含量和產(chǎn)量均為最高，分別是3.760 mg/g（DW 干重）和0.2457 mg/瓶（DW 干重），且含量和產(chǎn)量均與0、12、18、24 h 光照處理下差異顯著；在24 h 光照處理下類黃酮的含量和產(chǎn)量均最低，僅為1.800 mg/g（DW 干重）和0.1175 mg/瓶（DW 干重）。不同光周期處理對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量和產(chǎn)量影響的高低順序如下：6 h＞12 h＞18 h＞0 h＞24 h。

2.1.2 類胡蘿卜素含量和產(chǎn)量。不同光周期處理對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類胡蘿卜素含量和產(chǎn)量的影響如圖4 和圖5 所示。其中光照24 h 的處理下龍眼胚性愈傷組織中類胡蘿卜素含量和產(chǎn)量最高，分別為51.25 μg/g（DW 干重）和3.2697 μg/瓶（DW 干重），且含量與0、6、12、18 h 差異顯著，產(chǎn)量與12 h 差異顯著；12 h 光照處理下的類胡蘿卜素含量和產(chǎn)量均最低，僅為41.25 μg/g（DW 干重）和2.7772 μg/瓶（DW 干重）。不同光周期處理對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量和產(chǎn)量影響的高低順序?yàn)椋?4 h＞0 h＞6 h＞18 h＞12 h。

2.2 對(duì)細(xì)胞保護(hù)酶活性的影響

2.2.1 SOD 酶。SOD 是植物抗氧化系統(tǒng)中重要的一員，是植物體中重要的活性氧清除劑，是清除ROS的第一道防線，又是H2O2主要的生成酶[8]。如圖6 所示，在不同光周期下，光照12 h 時(shí)SOD 酶活性最高，隨著光照時(shí)間的增長(zhǎng)，SOD 酶活性逐漸降低，但是光照6 h 時(shí)SOD 酶活性最低，光照0 h 時(shí)SOD 酶活性相較于其他的光周期來說也很低。

2.2.2 POD 酶。細(xì)胞壁當(dāng)中的POD 可以催化NADH或NADPH 氧化產(chǎn)生進(jìn)一步歧化生成H2O2和O2[9-10]。POD 和CAT 均能夠代謝H2O2，然后由酚底物還原形成的自由基聚合形成木質(zhì)素[11]。如圖7 所示，0 h 光照的時(shí)候POD 酶活性最高，6～24 h 這4 個(gè)階段POD 酶活性呈倒“V”模式，其中12 h 光照POD酶活性最高，24 h 光照POD 酶活性最低。

2.2.3 H2O2含量。H2O2作為細(xì)胞的有氧代謝產(chǎn)物，在植物體遇到脅迫時(shí)便大量產(chǎn)生，可以作為信號(hào)分子誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)防御基因的表達(dá)來應(yīng)對(duì)外界環(huán)境條件的變化[8]。如圖8 所示，在不同光周期的變化下，12 h和18 h 的H2O2的含量相同且最高，而6 h 時(shí)H2O2的含量最低。

2.2.4 PRO 含量。PRO 是植物體內(nèi)最為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一[12]，在脅迫條件下，植物體內(nèi)所積累的脯氨酸具有清除胞內(nèi)活性氧的作用[13]，還能夠作為儲(chǔ)能物質(zhì)存儲(chǔ)參與細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，保證植物體在脅迫條件下的能量供給[14]。如圖9 所示，0～24 h 這5 個(gè)階段PRO 含量的變化呈現(xiàn)“V”字形，其中12 h 光照PRO含量最低，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)（或降低），POD 酶活性呈逐漸上升的趨勢(shì)，24 h 光照PRO 含量最高。

2.2.5 PAL 酶活性。PAL 廣泛存在于植物體當(dāng)中，是苯丙烷類代謝途徑的第一種酶[15]，是許多次級(jí)代謝產(chǎn)物的直接或者間接前體[16]。PAL在植物體生長(zhǎng)發(fā)育和適應(yīng)外界環(huán)境因素過程中起重要作用。如圖10 所示，0～24 h 這5 個(gè)階段PAL 酶活性的變化呈現(xiàn)“M”字形，其中6 h 時(shí)PAL 酶活性值最大，為17.47 U/g，12 h時(shí)PAL 酶活性值最低，為15.11 U/g。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 不同光周期對(duì)龍眼EC 中類黃酮含量的影響

圖3 不同光周期對(duì)龍眼EC 中類黃酮產(chǎn)量的影響

圖4 不同光周期處理對(duì)龍眼EC 中類胡蘿卜素含量的影響

圖5 不同光周期處理對(duì)龍眼EC 中類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

圖6 光周期對(duì)龍眼EC 中SOD 酶活性的影響

圖7 光周期對(duì)龍眼EC 中POD 酶活性的影響

圖8 光周期對(duì)龍眼EC 中H2O2 含量的影響

圖9 光周期對(duì)龍眼EC 中PRO 含量的影響

2.3 對(duì)類黃酮和類胡蘿卜素合成相關(guān)基因表達(dá)分析

2.3.1 類黃酮合成相關(guān)基因表達(dá)。如圖11 所示，CHI在6 h 時(shí)的表達(dá)量最高，CHS、DFR 和F3H 均是在18 h 時(shí)表達(dá)量最高，由此可見18 h 的光照時(shí)間可明顯促進(jìn)這3 個(gè)基因在龍眼EC 中的表達(dá)。

圖10 光周期對(duì)龍眼EC 中PAL 酶活性的影響

如圖11-A所示，隨著光照時(shí)間的增加，CHI 的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，6 h 光照促進(jìn)了龍眼EC 中CHI 基因的表達(dá)，而24 h 光照則明顯抑制了CHI 基因的表達(dá)，6 h 光照的表達(dá)量是24 h光照的表達(dá)量的7.69 倍。

如圖11-B 所示，隨著光周期的變化，龍眼胚性愈傷組織中CHS 基因的表達(dá)量呈先上升后下降再上升后下降的趨勢(shì)，其中18 h 處理下的表達(dá)量最高，12 h 的表達(dá)量最低，18 h 的表達(dá)量是12 h 的6.27 倍，其表達(dá)量差異顯著。

如圖11-C 所示，隨著光周期的變化，龍眼胚性愈傷組織中DFR基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)趨勢(shì)，其中18 h 的表達(dá)量最高，0 h 的表達(dá)量最低，18 h 的表達(dá)量是0 h 的5.54 倍。

如圖11-D 所示，隨著光照時(shí)間的增加，龍眼EC 中F3H 的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后增加的趨勢(shì)，其中18 h 光照明顯促進(jìn)F3H 在龍眼EC中的表達(dá)，其表達(dá)量是最低0 h 時(shí)表達(dá)量的9.98 倍。

2.3.2 類胡蘿卜素合成相關(guān)基因表達(dá)。如圖12-A 所示，隨著光周期的變化，龍眼EC 中GGPS 基因的表達(dá)量呈先上升后下降再上升下降的變化趨勢(shì)，在6 h 光照時(shí)其表達(dá)量顯著高于其他光周期處理下GGPS 的表達(dá)量，是12 h 時(shí)最低表達(dá)量的2.46 倍。

如圖12-B 所示，隨著光周期的變化，龍眼EC 中PSY 基因的表達(dá)量呈先下降后平穩(wěn)上升再下降的表達(dá)趨勢(shì)，在0 h 光照的黑暗處理時(shí)其表達(dá)量最高，在24 h 全光照的處理下其表達(dá)量最低，最高表達(dá)量是最低表達(dá)量的1.65 倍。

如圖12-C 所示，隨著光照時(shí)間的增加，龍眼EC中PDS 的表達(dá)量呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，在12 h 光照時(shí)達(dá)到最高表達(dá)量，是24 h 時(shí)最低表達(dá)量的1.72 倍。

如圖12-D 所示，隨著光照時(shí)間的增加，龍眼EC 中ZDS 的表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢(shì)，其中0 h 光照的黑暗處理時(shí)其表達(dá)量最高，12 h 半光照時(shí)其表達(dá)量最低，最高表達(dá)量是最低表達(dá)量的1.53 倍。

3 結(jié)論與討論

圖11 光周期對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖12 光周期對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類胡蘿卜素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

通過該試驗(yàn)得知，光周期影響龍眼胚性愈傷組織中類黃酮和類胡蘿卜素的積累，其中光照能夠提高龍眼胚性愈傷組織中類黃酮的含量，短光照能夠明顯提高類黃酮的含量。王偉[17]等研究表明，不同光周期的補(bǔ)光處理使得金線蓮總黃酮含量顯著高于對(duì)照組正常光處理，該試驗(yàn)結(jié)果與王偉的試驗(yàn)結(jié)果一致。但是該試驗(yàn)中24 h 全光照類胡蘿卜素含量最高，而其他3 個(gè)光周期處理中類胡蘿卜素的含量卻比黑暗環(huán)境中低，這說明只有足夠的光照才能夠提高類胡蘿卜素含量。通過不同光周期的處理，龍眼胚性愈傷組織中SOD、POD、H2O2的變化一致，SOD 和POD 都是植物氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，共同清除活性氧（ROS），從而維持植物體內(nèi)自由基的平衡，防止對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)造成傷害，從而保持組織的正常代謝。PRO 在6、12、18 h 的PRO含量均低于黑暗時(shí)期，24 h 全光照處理的龍眼胚性愈傷組織中PRO 含量比黑暗時(shí)期高。PAL 參與形成植物體內(nèi)類黃酮等次生代謝物質(zhì)，并且其活性與類黃酮含量顯著相關(guān)，這也與類黃酮含量在短光照6 h 是龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量最高的結(jié)果一致。

通過該研究發(fā)現(xiàn)，不同光周期的處理對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮合成基因具有調(diào)控作用，其中CHI基因在短光照6 h 時(shí)的表達(dá)量明顯上調(diào)，CHS、DFR和F3H均是在18 h 時(shí)表達(dá)量最高，由此可見長(zhǎng)光照18 h 時(shí)可明顯促進(jìn)這3 個(gè)基因在龍眼EC 中的表達(dá)。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，24 h 全光照時(shí)相比于長(zhǎng)光照18 h 時(shí)表達(dá)量均有不同程度的下調(diào)，則可以說明24 h全光照在不同程度上抑制龍眼EC 中類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)，由此可見24 h 全光照肯定不是龍眼EC 生產(chǎn)類黃酮的最佳光周期，這個(gè)結(jié)果也與該研究結(jié)果相符。不同光周期處理對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類胡蘿卜素合成基因具有調(diào)控作用。其中，GGPS的表達(dá)量在6 h 光照時(shí)明顯上調(diào)；PSY的表達(dá)量在CK黑暗時(shí)期的表達(dá)量最高，這說明光周期明顯抑制PSY的表達(dá)；PDS的表達(dá)量在12 h 光照時(shí)最高，這說明合適的半光照促進(jìn)了PDS的表達(dá)，其他的光周期則抑制其表達(dá)；ZDS的表達(dá)量在CK黑暗時(shí)期最高，光周期明顯抑制其表達(dá)。

通過以上試驗(yàn)，初步得到了光周期對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮和類胡蘿卜素的積累以及相關(guān)基因表達(dá)的變化，為龍眼胚性愈傷組織的次生代謝工程和代謝調(diào)控研究提了供理論依據(jù)。