諾沃霉素對西瓜立枯病的防治效果

黃大野 方 偉 萬中義 張亞妮 楊 丹 鄭嬌莉 姚經(jīng)武 王開梅 周榮華 李金萍 曹春霞*

（1 湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北武漢 430064；2 北京市植物保護站，北京 100029）

我國是全球西甜瓜生產(chǎn)與消費第一大國，2017年全國西瓜播種面積 152 萬hm2，總產(chǎn)量6 314.7 萬t（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2019）。由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的西瓜立枯病是西瓜苗期的一種重要病害（Mirmajlessi et al.，2012），西瓜感染立枯病后表現(xiàn)出爛種、幼苗死亡、莖萎縮、根和果實腐爛，從而引起植株死亡和減產(chǎn)（Aiello et al.，2012）?；瘜W防治是防治西瓜立枯病的主要手段，但化學殺菌劑的長期使用會造成環(huán)境污染和生態(tài)的破壞，同時，使用單一殺菌劑必然會引起抗藥性。因此，需要開發(fā)更為安全有效的防治藥劑（于冰 等，2011）。諾沃霉素是由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和鑒定的全新結(jié)構(gòu)的32 元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯抗生素，對多種植物病原真菌具有良好的抑菌活性。筆者前期對諾沃霉素殺菌活性的研究多集中于葉面噴霧防治氣傳病害上（黃大野 等，2018，2019），本試驗首次通過浸種方式防控土傳病害，探討諾沃霉素作為種子處理劑的應用潛力。諾沃霉素有A 和B兩個結(jié)構(gòu)，A 和B 結(jié)構(gòu)相似，抑菌效果相當（黃大野 等，2018，2019），故本試驗只選取諾沃霉素A對西瓜立枯病的防治效果進行研究，為諾沃霉素在防治西瓜立枯病的田間應用和推廣方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：立枯絲核菌（R.solani）由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和保存，為多菌靈敏感菌株。

供試藥物：諾沃霉素A 原藥（含量95%），98%多菌靈原藥（安徽廣信農(nóng)化股份有限公司）。

西瓜品種為春秋花王，從湖北蔬谷農(nóng)業(yè)科技有限公司購種。

室內(nèi)試驗于2017 年4 月在湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 諾沃霉素A 對立枯絲核菌的抑菌活性 將立枯絲核菌從斜面活化至PDA 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)4 d 備用。將諾沃霉素A 原藥加入母液體積1%的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，隨后加入無菌水配制成100 μg·mL-1母液備用。采用梯度稀釋法對諾沃霉素A 進行稀釋，使其在PDA 培養(yǎng)基的終濃度為10、5、2.5、1.25 μg·mL-1和0.625 μg·mL-1。多菌靈母液配制方法同諾沃霉素A，多菌靈在PDA 平板終濃度為1、0.5、0.25、0.125 μg·mL-1和0.062 5 μg·mL-1。每個濃度設置3 次重復，以加入含1% DMF 無菌水作為對照。用4 mm打孔器打取立枯絲核菌菌餅接入PDA 平板中央，28 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測量每個培養(yǎng)皿內(nèi)菌落直徑，用 DPS 軟件求出諾沃霉素A 和多菌靈對立枯絲核菌生長的毒力回歸方程和抑制中濃度EC50。

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

將含10 μg·mL-1諾沃霉素A 的PDA 平板平鋪滅菌玻璃紙，隨后在平板中央轉(zhuǎn)入立枯絲核菌菌餅，以加入1%DMF 無菌水作為對照。培養(yǎng)36 h 后用無菌刀片挑取菌落邊緣菌絲置于載玻片，用40倍光學顯微鏡（OLYMPUS CX21，Tokyo，Japan）觀察處理和對照菌絲形態(tài)。

另將上述培養(yǎng)菌絲用2.5%戊二醛固定，4 ℃過夜，參照康振生（1995）的方法，在掃描電鏡下觀察處理和對照菌絲形態(tài)。

1.2.2 諾沃霉素A 對立枯絲核菌菌核形成的影響 按照1.2.1 的方法，將諾沃霉素A 配制成2.5、1.25、0.625 μg·mL-1和0.312 5 μg·mL-1濃 度 的PDA 平板，接入立枯絲核菌菌餅，在28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，待對照長出大量菌核后，記錄菌核數(shù)量并用電子天平測定每個平板產(chǎn)生的所有菌核質(zhì)量，每個處理3 次重復，以加入含1% DMF 無菌水作為對照。

1.2.3 諾沃霉素A 浸種防治西瓜立枯病的盆栽試驗 盆栽試驗于2017 年7 月在湖北省農(nóng)業(yè)科學院溫室內(nèi)進行。將活化好的立枯絲核菌塊置于PDB培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)7 d，取出菌絲用無菌水沖洗干凈，用電子天平測定質(zhì)量后用組織打碎機打碎。將菌絲按每千克基質(zhì)土3 g 菌絲的比例均勻拌入基質(zhì)土中備用（黃新琦 等，2012），基質(zhì)土配比為草炭∶蛭石∶珍珠巖=3V∶1V∶1V。按照1.2.1 的方法將諾沃霉素A 和多菌靈分別配制成4 000 μg·mL-1和1 000 μg·mL-1溶液。將西瓜種子用上述2 種藥劑浸種2 h 后播入帶菌土中，以1% DMF 無菌水浸種的處理作為對照，以1% DMF 無菌水浸種且播入不含立枯絲核菌的上述基質(zhì)土的處理作為空白對照，試驗設 3 次重復，每個重復 72 粒種子，溫室常規(guī)培養(yǎng)。10 d 后統(tǒng)計各處理出苗數(shù)，并計算防效。

發(fā)病率=（播種種子數(shù)量-正常苗數(shù)量）/播種種子數(shù)×100%

防治效果=（對照發(fā)病率-處理發(fā)病率）/對照發(fā)病率×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0（SPSS，USA）軟件進行統(tǒng)計學分析。采用單因素方差分析及LSD 多重比較法對不同處理下菌核數(shù)、菌絲質(zhì)量、發(fā)病率和防效進行差異顯著性分析，采用獨立樣品T 檢驗對不同處理下防效進行差異顯著性分析，所有統(tǒng)計分析以P＜0.05 為差異顯著性標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾沃霉素A 對立枯絲核菌的抑菌活性

室內(nèi)抑菌試驗表明，諾沃霉素A 對立枯絲核菌菌絲生長具有強烈的抑制作用，各試驗濃度對立枯絲核菌均具有一定的抑菌作用，抑菌作用隨濃度降低而下降（圖1）。抑制中濃度為1.726 0 μg·mL-1，對照藥劑多菌靈抑制中濃度為0.234 7 μg·mL-1，諾沃霉素A 的抑菌活性略低于對照藥劑（表1）。

圖1 諾沃霉素A 對立枯絲核菌離體抑菌效果

表1 諾沃霉素A 對立枯絲核菌的抑菌活性

經(jīng)10 μg·mL-1諾沃霉素A 處理后，通過光學顯微鏡觀察，與對照相比，立枯絲核菌菌絲發(fā)生斷裂、扭曲和變形（圖2）；掃描電鏡觀察顯示，與對照相比，立枯絲核菌菌絲表面出現(xiàn)干癟、塌陷和扭曲皺縮（圖3）。

2.2 諾沃霉素A 對立枯絲核菌菌核形成的影響

諾沃霉素A 能有效抑制立枯絲核菌菌核的產(chǎn)生，其中2.5 μg·mL-1和1.25 μg·mL-1能完全抑制菌核的產(chǎn)生（表2）。

圖2 顯微鏡下諾沃霉素A 對立枯絲核菌菌絲生長的影響（物鏡40 倍）

圖3 掃描電鏡下諾沃霉素A 對立枯絲核菌菌絲生長的影響

2.3 諾沃霉素A 對西瓜立枯病的防治效果

在活體盆栽條件下，諾沃霉素A 和多菌靈浸種處理均能有效防治西瓜立枯病。4 000 μg·mL-1諾沃霉素A 對西瓜立枯病防效為91.83%，1 000 μg·mL-1多菌靈對西瓜立枯病防效為95.20%。在試驗濃度下諾沃霉素A 與多菌靈的防效均達90%以上（表3）。

表2 諾沃霉素A 對立枯絲核菌菌核形成的影響

表3 諾沃霉素A 浸種防治西瓜立枯病盆栽效果

3 結(jié)論與討論

本試驗通過生長速率法測定諾沃霉素A 對擔子菌立枯絲核菌EC50為1.726 0 μg·mL-1，于冰等（2011）報道了一種核苷類抗生素豐加霉素對黃瓜立枯絲核菌EC50為1.670 μg·mL-1，兩種抗生素對立枯絲核菌的抑菌活性相似。之前研究表明，諾沃霉素A 對灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和茶擬盤多毛孢（Pestalotiopsis theae）EC50分別為0.631、2.110 μg·mL-1，其對立枯絲核菌殺菌活性介于兩者之間（黃大野 等，2018，2019）。

立枯絲核菌主要以營養(yǎng)菌絲體和菌核形式存在（Zheng et al.，2013），立枯絲核菌的病害循環(huán)對于病害的防治至關(guān)重要，本試驗結(jié)果表明，諾沃霉素能有效抑制立枯絲核菌的菌絲生長和菌核產(chǎn)生，對于西瓜枯萎病的田間防治至關(guān)重要。1.25 μg·mL-1諾沃霉素A 能完全抑制菌核的產(chǎn)生，而2.20 μg·mL-1豐加霉素濃度下才能完全抑制菌核產(chǎn)生（于冰 等，2011）。

種子處理和噴淋苗床是防治作物苗期病害的兩種主要施藥方式（楊宇紅 等，2015；宋順華 等，2017），盆栽試驗結(jié)果表明，4 000 μg·mL-1諾沃霉素A 浸種對西瓜立枯病防效為91.83%，而噴淋苗床等施藥方式對西瓜立枯病的防治效果需要進一步研究。由于盆栽試驗和田間試驗具有一定差異，諾沃霉素A 對西瓜立枯病的田間防治效果還需要進一步驗證。同時，還需要對諾沃霉素A的抗性風險、田間使用劑量等進行更深入的研究，為諾沃霉素A的田間應用和推廣奠定基礎(chǔ)。