黃芪多糖預(yù)處理對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠細(xì)胞凋亡的影響

王瑩

【摘 要】 目的：探討黃芪多糖預(yù)處理對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。方法：SD大鼠30只隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和黃芪多糖干預(yù)組，每組各10只。黃芪多糖干預(yù)組在建模前，每天給予黃芪多糖450 mg/kg灌胃，連續(xù)用藥10 d，1次/d;假手術(shù)組和模型組以相同方式灌胃等體積的生理鹽水。模型組與黃芪多糖干預(yù)組建模，假手術(shù)組只分離不建模，48 h后腎動(dòng)脈采血，立即處死大鼠并取腎臟組織。全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中的尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）含量，TUNEL法檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡，免疫組化檢測(cè)腎組織Bax和Bcl-2蛋白含量表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清BUN、Cr含量明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，黃芪多糖干預(yù)組大鼠血清BUN和Cr含量明顯下降（P<0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，黃芪多糖干預(yù)組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低（P<0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組腎臟Bax表達(dá)明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯下降（P<0.01）;與模型組比較，黃芪多糖干預(yù)組大鼠腎臟Bax表達(dá)明顯降低，Bcl-2表達(dá)明顯升高（P<0.01）。結(jié)論：黃芪多糖預(yù)處理具有減輕腎臟細(xì)胞凋亡，改善腎功能的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，以及上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 黃芪多糖;細(xì)胞凋亡;Bcl-2;Bax

【中圖分類號(hào)】R285.5 ??【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ???【文章編號(hào)】1007-8517（2019）18-0012-03

腎缺血再灌注損傷（Renal Ischemical Reperfusion Injury，RIRI）是指在腎缺血的基礎(chǔ)上，當(dāng)恢復(fù)血流灌注后，損傷不僅沒有改善，反而加重的現(xiàn)象[1]。RIRI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中繼發(fā)性的細(xì)胞凋亡可能起到重要作用[2]，通過抑制細(xì)胞凋亡來作為治療的靶點(diǎn)，為研究開發(fā)新型藥物開辟了新的途徑。從中醫(yī)學(xué)的角度來看，細(xì)胞凋亡與中醫(yī)正氣學(xué)說有密切聯(lián)系[3]。RIRI根據(jù)其臨床表現(xiàn)可將其歸于“關(guān)格”“虛勞”“溺毒”“癃閉”等范疇，其病因病機(jī)皆與脾腎有關(guān)，脾腎兩虛易致濁毒內(nèi)蘊(yùn)、邪氣增多[4]?！端貑枴ねㄔu(píng)虛實(shí)論》曰：“邪氣盛則實(shí)，精氣奪則虛”。

黃芪為豆科類植物膜莢黃芪或者蒙古黃芪干燥后的根，其味甘、性微溫，歸脾肺經(jīng)?！侗静輩R言》贊其為“補(bǔ)肺健脾，實(shí)衛(wèi)斂汗，驅(qū)風(fēng)運(yùn)毒之藥也”。國內(nèi)外研究表明其具有保護(hù)腎臟，對(duì)腎臟疾病具有治療作用[5]。黃芪多糖（Astragalus Polysac charides，APS）為黃芪的有效成分之一，在心肌[6]、腦[7]的缺血再灌注損傷中具有抗細(xì)胞凋亡的作用。腎臟作為缺血再灌注損傷的常見器官之一，APS是否通過抗細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對(duì)RIRI的保護(hù)作用，還未見相關(guān)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)擬通過在大鼠體內(nèi)復(fù)制RIRI模型，從抗細(xì)胞凋亡角度分析APS對(duì)RIRI作用的機(jī)制，以期為臨床APS的運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性成年S-D大鼠30只，體重200～300 g左右，購于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，編號(hào)：SXYK180605120。分組飼養(yǎng)，室溫控制在20～25 ℃，空氣濕度控制在50%～55%，飲食與飲水均標(biāo)準(zhǔn)化供給。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑 APS（批號(hào)：1803152230，上?？抵壅婢嗵枪荆?TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：18I03AJ，武漢博士德生物工程有限公司）;肌酐（Cr）試劑盒、尿素氮（BUN）試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所，批號(hào)皆為201809036;Bax（Bcl-2 associated X蛋白質(zhì)，批號(hào)：2343179）、Bcl-2（B淋巴細(xì)胞瘤-2基因，批號(hào)：185641）免疫組化試劑盒購自于武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 儀器 7020型全自動(dòng)生化分析儀（日本HITAHI公司）;TS-12U型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）;TDK-BMB型石蠟冰凍切片機(jī)（浙江金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠）;顯微鏡（日本尼康公司）;DMR+Q550型病理圖像分析儀（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模和分組 30只大鼠隨機(jī)分為3組：模型組、假手術(shù)組和APS干預(yù)組，每組10只。手術(shù)前12 h禁食不禁水，各組動(dòng)物以45 mL/kg劑量戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行全身麻醉。仰臥位固定，沿腹正中切開腹部，模型組大鼠游離雙側(cè)腎臟并分離腎動(dòng)脈，用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈60 min，然后松開動(dòng)脈夾，腎臟由紫黑色變?yōu)轷r紅，表明模型制備成功，如果松開動(dòng)脈夾5 min后，腎臟顏色沒有變?yōu)轷r紅色，說明模型制作失敗，這種大鼠被剔除。假手術(shù)組只沿腹正中切開腹部，并分離左右腎臟，不夾閉腎動(dòng)脈。APS干預(yù)組在模型制作前給予450 mg/kg APS灌胃，連續(xù)用藥10 d，1次/d，假手術(shù)組與模型組給予等量的生理鹽水灌胃。各組大鼠手術(shù)后單籠常規(guī)飼養(yǎng)，48 h后腎動(dòng)脈采血，然后處死大鼠并摘取腎臟組織。

1.2.2 血清BUN、Cr含量測(cè)定 將采集的血液，以3000 r/min離心15 min后提取血清。參照說明書通過全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中的BUN、Cr含量。

1.2.3 TUNEL法檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡 取腎組織固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，嚴(yán)格參照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)腎臟凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。光鏡下凋亡細(xì)胞核染色為棕黃色。在顯微鏡（×400）下，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)非重疊視野進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目，取平均值，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)，具體公式為：細(xì)胞凋亡指數(shù)=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%

1.2.4 免疫組化檢測(cè)腎組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 制備腎組織切片，用SABC免疫組化染色法檢測(cè)Bax、Bcl-2的表達(dá)，操作步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書。Bax和Bcl-2表達(dá)陽性結(jié)果為胞漿染色呈棕色，不著色者為陰性。在顯微鏡（×400）下，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)非重疊視野進(jìn)行觀察，計(jì)算陽性反應(yīng)區(qū)域面積的平均光密度值（OD）。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0分析處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清BUN、Cr水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清BUN和Cr含量明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，APS干預(yù)組大鼠血清BUN和Cr含量明顯下降（P<0.01）。具體結(jié)果見表1。

2.2 各組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 與假手術(shù)組比較，模型組腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，APS干預(yù)組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低（P<0.01）。具體結(jié)果見表2、圖1。

2.3 各組大鼠腎組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組腎臟Bax表達(dá)明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯下降（P<0.01）;與模型組比較，APS干預(yù)組大鼠腎臟Bax表達(dá)明顯降低，Bcl-2表達(dá)明顯升高（P<0.01）。具體結(jié)果見表3、圖2。

3 討論

RIRI是因腎供血障礙后血流再灌注而導(dǎo)致的常見的應(yīng)激性疾病，臨床最常見于腎移植術(shù)后[8]。RIRI導(dǎo)致腎臟血管損傷，引發(fā)腎小管代謝紊亂甚至壞死，進(jìn)而影響腎血流，最終導(dǎo)致腎細(xì)胞凋亡、壞死，直至腎功能衰竭。通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清BUN和Cr含量明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，APS干預(yù)組大鼠血清BUN和Cr含量明顯下降（P<0.01）。提示RIRI大鼠腎功能下降，通過APS干預(yù)作用后腎功能得到改善，說明APS對(duì)RIRI大鼠腎臟具有保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定生理或病理?xiàng)l件下，通過啟動(dòng)內(nèi)部自身機(jī)制，激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶而引起自身細(xì)胞死亡的現(xiàn)象[9]，其在RIRI病理生理中發(fā)揮重要作用[10]。細(xì)胞凋亡與多種基因表達(dá)有關(guān)，其中Bcl-2家族為現(xiàn)在研究較為深入的調(diào)控基因之一。迄今已發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族包括20多種成員，按其功能可分為抑制凋亡的亞家族（包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、mcl-1、A1/Bfl-1等）和促進(jìn)凋亡的Bax亞家族（包括Bax、Bcl-XS、Bad、Bik、Bak、Bid、Hrk等），其中Bcl-2和Bax是最主要的成員。Bcl-2具有抗細(xì)胞凋亡作用，而Bax具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，在正常情況下Bcl-2與Bax調(diào)控作用保持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)Bcl-2表達(dá)程度升高或者Bax的表達(dá)程度受到抑制時(shí)，就會(huì)抑制細(xì)胞凋亡[11]，這種抑制的機(jī)理包括以下幾種可能：①對(duì)促細(xì)胞凋亡基因信號(hào)傳達(dá)產(chǎn)生阻隔作用，或使得相關(guān)基因失效[12];②Ca2+內(nèi)流在細(xì)胞中發(fā)生變化，使凋亡受到抑制;③抑制氧自由基的產(chǎn)生，減少氧化應(yīng)激等。而Bax表達(dá)的增強(qiáng)，使線粒體通透性增大，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)引入大量的細(xì)胞色素C，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。通過本研究顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高，且Bax表達(dá)明顯升高、Bcl-2表達(dá)明顯下降（P<0.01）;與模型組比較，APS干預(yù)組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低，且Bax表達(dá)明顯降低、Bcl-2表達(dá)明顯升高（P<0.01）。說明APS通過對(duì)凋亡基因進(jìn)行調(diào)節(jié)的作用，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)腎臟，避免產(chǎn)生腎損傷。

黃芪作為傳統(tǒng)名貴中藥，有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、行水消腫和托毒生肌的功效，有“補(bǔ)氣諸藥之最”之稱。APS作為黃芪中最重要的一種藥用物質(zhì)，大量實(shí)驗(yàn)證明其具有抗細(xì)胞凋亡的作用。綜上所述，APS預(yù)處理具有減輕腎臟細(xì)胞凋亡，改善RIRI腎功能的作用，其機(jī)制可能與Bax蛋白表達(dá)下調(diào)，以及Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]Mitaka C， Si MK， Tulafu M， et al. Effects of atrial natriuretic peptide on inter-organ crosstalk among the kidney， lung， and heart in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury[J]. Intensive Care Med Exp， 2014， 2（1）： 28-29.

[2]胡紅林，王共先. 腎缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（15）：2279-2283.

[3]莊欣. 細(xì)胞凋亡與中醫(yī)正氣學(xué)說辨析[J]. 中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22（1）：97.

[4]王麗榮，馬曉燕. 中醫(yī)藥治療慢性腎衰研究進(jìn)展[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志，2017，38（10）：81-83.

[5]汪衛(wèi)紅，許燁，李志明，等. 黃芪水提取物對(duì)慢性腎功能衰竭模型大鼠的改善作用及其對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響[J]. 中國藥房，2019，30（10）：1386-1392.

[6]范宗靜，謝連娣，崔杰，等. 黃芪多糖后處理通過抑制線粒體損傷介導(dǎo)的凋亡保護(hù)心肌缺血再灌注損傷[J]. 遼寧中醫(yī)雜志，2018，45（7）：1357-1360.

[7]蘇韞，劉永琦，顏春魯，等. 黃芪多糖對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織Bcl-2、Bax蛋白及NO含量的影響[J]. 西部中醫(yī)藥，2016，29（3）：10-13.

[8]BAO D S， WU Y K， FU S J， et al. Hyperbaric oxygenation protects againsts ischemia-resperfusion injury in transplanted rat kidneys by triggering autophagy and inhibiting inflammatory response[J]. Ann Transplant， 2017， 2（10）： 75-82.

[9]范宗靜，唐杰，謝連娣，等. 人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷Fas/FasL系統(tǒng)的表達(dá)及黃芪多糖的干預(yù)研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（11）：4672-4674.

[10]許瑞瑞，宋年華，徐巖，等. 腎缺血再灌注損傷對(duì)細(xì)胞凋亡的影響[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，51（1）：29-32.

[11]GUO J， WANG J L， SONG S， et al. Sphallerocarpus gracilis polysaccharide protects pancreatic β-cells via regulation of the bax/bcl-2， caspase-3， pdx-1 and insulin signalling pathways[J]. Int J Bio Macromol， 2016， 93（PtA）： 829-836.

[12]ZHENG X R， WEI R B， SHI S Z， et al. Effect of Fufang Shenhua Tablet on the expression of Toll-like receptors during acute kidney injury induced by ischemia-reperfusion in rats[J]. Chin J Integr Med，2012，18（12）：918-924.

[13]王紅祥，徐彬，萬海同.黃芪對(duì)腦缺血-再灌注損傷大鼠MMP-9 和 IL-1β 的影響[J]. 海峽藥學(xué)，2013，25（4）：17-19.

（收稿日期：2019-07-09 編輯：陶希睿）