基于表面等離子體共振和電化學聯(lián)用的DNA傳感器研究進展

張玉昆,安娜,劉衛(wèi)曉,宛煜嵩,金蕪軍,李亮*,張曉

1.長春理工大學生命科學技術學院,長春 130022;2.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所,北京 100081

脫氧核糖核酸(DNA)是已知的主要且最有研究意義的生物有機化合物，具有生物相容性和生物可降解性[1-2]，因此，DNA雜交反應在分子檢測領域具有很重要的研究價值。了解非生物表面與功能性生物分子(如蛋白質(zhì)、DNA、適體等)之間存在的相互作用，在開發(fā)用于生物傳感器和分子傳遞等的功能性生物界面方面起著至關重要的作用。例如，生物傳感器的發(fā)展需要各個生物分子識別元件的適當分配、定向和改變構(gòu)象，以實現(xiàn)最佳活性、結(jié)合親和力和長期穩(wěn)定性[3-6]。然而，由于待結(jié)合分子的復雜性和異質(zhì)性，研究界面是具有挑戰(zhàn)的。固體基質(zhì)上的固定/定位方法和較弱的親和力導致動力學檢測的不穩(wěn)定性[7-8]。

在過去的幾十年中，隨著納米材料的研發(fā)和聯(lián)用技術的飛速發(fā)展，研究界面性質(zhì)的先進光譜電化學方法越來越受到關注。納米技術與納米材料科學的新成就，使不同大小(1～100nm)、形狀與組成(成分)的眾多納米材料介入生物傳感領域。納米粒子的小體積突破了結(jié)構(gòu)微型化的限制，導致了更低的檢測限，甚至可達到zmol(1 zmol=10-21mol)的水平。而且，生物功能化納米粒子可以產(chǎn)生催化性能、傳導性能與生物相容性能的協(xié)同作用，并加快信號傳導。更為重要的是，納米材料與環(huán)境直接接觸，可以直接作為化學與生物傳感器，實現(xiàn)生物分子的單分子檢測，從而使其廣泛應用于生物體系。納米生物傳感的進一步發(fā)展也為多種生物技術的聯(lián)用提供了有用工具。

光譜電化學可以通過電化學(electrochemical，EC)和光學技術的結(jié)合實現(xiàn)原位界面表征。單獨的電化學方法通常不適合識別界面上發(fā)生的結(jié)合事件和構(gòu)象變化，因此需要額外的光學技術，例如表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)。SPR作為無標記技術，便于研究界面上的相互作用[9-13]。然而，它對低濃度、小分子的檢測和非特異性結(jié)合的識別存在限制[14-17]。另外，由于衰減長度的限制，SPR僅對距離金表面幾百納米距離內(nèi)的折射率變化具有檢測效應。EC的設備簡單，試驗成本低。然而，對于許多生物分子，在電極上沒有發(fā)生直接的電子轉(zhuǎn)移，因此需要通過標記分子的間接電子轉(zhuǎn)移，這增加了檢測的復雜性和費用。同時，與法拉第電流一起產(chǎn)生的電容電流也會導致信號干擾。此外，EC難以鑒定中間體或產(chǎn)物的未知物質(zhì)。而SPR與電化學的耦合通常有利于它們相互彌補這些缺陷。因此，以SPR為主的EC-SPR聯(lián)用引起了極大的關注。本文綜述了近年來SPR和EC聯(lián)用的DNA傳感器應用研究進展，包括技術原理、聯(lián)用方法(CV-SPR、EIS-SPR、CV/EIS-SPR)與未來展望，以期為相關研究提供參考。

1 電化學/表面等離子體共振(EC-SPR)技術基本原理

1.1 SPR基本原理

SPR光譜法是一種光學技術，可監(jiān)測固體表面上的折射變化，并與其他小分子或生物分子一起進行修飾。折射率的變化反映了溶液中的分析物與固定在表面上的與配體結(jié)合的分析物質(zhì)的量[18]。SPR原理如圖1所示。

圖1 表面等離子共振(SPR)原理圖[18]Fig.1 Theory of surface plasmon resonance (SPR)[18].

偏振光以一定角度范圍入射到鍍在玻璃表面的薄膜上發(fā)生全反射，會形成消逝波進入光疏介質(zhì)，而在光疏介質(zhì)中又存在等離子波，當符合表面等離子體共振波的激發(fā)條件時，兩波相遇就可能發(fā)生共振(圖1)。入射光的能量被吸收，使反射光能量急劇下降，在反射光譜上出現(xiàn)反射強度最低值，即共振吸收峰，所對應的波長為共振波長，對應的入射角為共振角，當金屬薄膜表面介質(zhì)不同時，共振角或共振波長將改變，由此可獲得相關信息。SPR對附著在金屬薄膜表面的介質(zhì)折射率非常敏感，當表面介質(zhì)的屬性改變或者附著量改變時，共振角會發(fā)生變化。因此，SPR譜(共振角的變化vs時間)能夠反映與金屬膜表面接觸的體系的變化[9-13]。

1.2 EC基本原理

EC檢測依托于三電極體系：工作電極(working electrode)、參比電極(reference electrode)和對電極(auxiliary electrode)。在電化學反應中，反應物在電解液或電極修飾層溶液的界面中得失電子，其大多是一種界面反應。電極電流可以看作工作電位的函數(shù)，工作電極的電位相對于參比電極，電流流經(jīng)工作電極和對電極(圖2)。

1.3 EC-SPR聯(lián)用

在EC-SPR中,玻璃或石英基底上的金膜既被用來產(chǎn)生表面等離子體共振的介質(zhì)，又可以用作電化學測試的工作電極。在產(chǎn)生電化學反應的時候，電極溶液界面內(nèi)發(fā)生的任何性質(zhì)的變化都會引起SPR共振角(折射率)發(fā)生變化,這就是EC-SPR技術的基本原理(圖2)[19-21]。

圖2 EC-SPR原理圖[21]Fig.2 Theory of electrochemical surface plasmon resonance[21].

2 EC-SPR在DNA分析及其他方面的應用進展

2.1 循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry，CV)與SPR聯(lián)用在DNA檢測中的應用研究

CV除了作為定量分析方法外，更主要的是作為電化學方法，可用于研究電極反應的性質(zhì)、機理及電極過程中的動力學參數(shù)等。在一個典型的循環(huán)伏安實驗中，工作電極一般為浸在溶液中的固定電極。為了盡可能降低歐姆電阻，建議采用三電極系統(tǒng)。在三電極系統(tǒng)中，電流流經(jīng)工作電極和對電極。工作電極電位是一個分開的參比電極(如飽和甘汞電極，SCE)為基準的相對電位。在循環(huán)伏安測試實驗中，工作電極的電位以10～200 mV/s的掃描速度隨時間線性變化，與此同時記錄在不同電位下的電流。表面等離子共振技術旨在檢測表面附近折射率的變化。眾所周知，SPR是一種無標記、實時、靈敏和快速的方法，用于研究分子相互作用[22-25]的動力學和效率常數(shù)、大分子的構(gòu)象變化[26-27]等。傳統(tǒng)的SPR由于無法測量折射率的極小變化而在超靈敏檢測中的應用受到限制。而這兩者的結(jié)合，可以監(jiān)測電化學反應中的大范圍氧化還原反應過程，不但可以研究聚合物的電化學行為，還可以分析電極表面的結(jié)合、解離和擴散過程。Liu等[28]報道了一種基于二茂鐵-鏈霉抗生物素蛋白(Fc-Stv)綴合物的靈敏方法，用于將EC和SPR的DNA靶標同時雜交至金表面修飾的肽核酸上。Fc-Stv與生物素化的互補靶DNA的連接不僅放大了SPR信號，而且由于每個Stv具有許多Fc標記物，也增強了電化學信號。二茂鐵氧化還原峰電流隨靶DNA濃度的增加而增加。因此，可以通過CV估計雜交的靶DNA的量。該傳感器還顯示出高選擇性(在單堿基錯配水平下)和良好的重現(xiàn)性。Patskovsky等[29]以亞甲基藍(MB)有機染料為例，通過CV進行表征，研究了電化學SPR(ESPR)傳感的理論和實驗參數(shù)。他們還評估了在溶液中以及在由標記有MB的莖環(huán)寡核苷酸形成的均勻界面薄膜中用于MB傳感的最佳ESPR實驗方法。光學SPR響應的電化學激活依賴于局部MB濃度，可用于設計敏感和高選擇性的生物傳感方法。

2.2 電化學阻抗譜(electrochemical impedance spectroscopy，EIS)與SPR聯(lián)用在DNA檢測中的應用研究

EIS描述了系統(tǒng)對周期性小幅度交流信號的應用的響應，用于分析由表面上帶電生物分子結(jié)合誘導的修飾電極和半導體的界面特性的變化，是SPR的一個有用的無標記檢測工具。EIS可以在導電聚合物[30-31]、金屬[32-37]、半導體界面[37-41]以及異質(zhì)結(jié)構(gòu)如半導體/介電界面(例如硅/二氧化硅)[40,42-45]上進行。Vogt等[46]在兩個鍍金的SPR玻片上單獨進行了EIS和SPR聯(lián)合測量，證明了從FeRi/亞鐵氰化物氧化還原偶中釋放的游離CN-會蝕刻金表面的猜測。Wang等[47]報道了一種基于石墨烯的無標記、再生和靈敏的表面等離子共振(SPR)和電化學適體傳感器，用于檢測α-凝血酶。無標記的EIS適體傳感器表現(xiàn)出高選擇性，證實了適體傳感器良好的靈敏度和選擇性，可用于制備靈敏的EIS適體傳感器檢測α-凝血酶，從而為設計高性能電化學適體傳感器提供了一種新方法。值得一提的是，與CV相比，EIS的優(yōu)勢在于其非侵入性[48]。在CV的情況下應用潛在的斜坡會導致與表面相連的分子發(fā)生不可逆的氧化。因此，通過研究氧化還原探針在緩沖溶液中的擴散或通過記錄雜交前后DNA層的阻抗變化，EIS已成功應用于DNA雜交研究[49-50]。但是在EIS中經(jīng)常遇到的一個問題是難以確定從實驗數(shù)據(jù)獲得的電路模型的唯一性。與SPR測量(SPR/EIS)的聯(lián)合應用有助于克服這一缺陷。因此，使用EIS檢測雙分子的相互作用已被應用于生物傳感器的開發(fā)[51-52]。

2.3 CV/EIS與SPR聯(lián)用在DNA檢測中的應用研究

CV和EIS都是研究電極過程的最常用方法，除了單獨和SPR技術聯(lián)用外，近些年來CV、EIS共同與SPR聯(lián)用的方法也逐漸成為研究的熱點。Lee等[53]利用電化學方法(EC)和局域表面等離子體共振(LSPR)方法，通過CV/EIS技術在Au納米晶體(AuNC)上制備了由多功能DNA(MF-DNA)組成的雙模心肌鈣蛋白I(CTnI)生物傳感器。這種簡單的納米結(jié)構(gòu)提供了更高的表面覆蓋率，便于增加固定化時間，以實現(xiàn)更大的靶標-生物探針結(jié)合。此外，該工藝不需要復雜的生物傳感器制造方法，最終減少了生物傳感器的制造時間。Zhang等[54]報道了CV/EIS與SPR聯(lián)用方法在檢測大腸桿菌細胞表面上貼壁細胞和DNA吸收的應用，通過原子力顯微鏡(AFM)、CV和EIS表征活細胞在表面上的附著，并計算CV和SPR信號獲得吸收的動態(tài)參數(shù)。在這項工作中，利用多肽RGD對金顆粒的結(jié)合特異性，將大腸桿菌細胞靶向結(jié)合在金表面。然后通過電化學方法以及該固定化方案的表面等離子體共振光譜研究細胞外鯡魚精子DNA在大腸桿菌上的吸附動力學。重要的是，這是第一項使用電化學方法表達大腸桿菌對DNA吸附作用的研究。最終結(jié)果表明，聯(lián)用方法適用于檢測微生物表面上的DNA結(jié)合，并且平衡常數(shù)的結(jié)果是精確可靠的。

2.4 EC-SPR在其他方面的應用

綜上，可以看出電化學和SPR兩種技術的聯(lián)用呈現(xiàn)出多樣化的趨勢，隨著EC-SPR研究的不斷深入,應用范圍也在逐漸擴大。本小節(jié)將根據(jù)EC-SPR在研究細胞色素C(Cyt C)的氧化還原對和細胞色素C氧化酶(COX)之間的相互作用、癌細胞以及水中氨芐青霉素的檢測等方面的應用對其研究進展進行評述。

Hou[55]等通過電化學表面等離子共振(EC-SPR)系統(tǒng)在模擬氧化還原調(diào)節(jié)的界面上研究細胞色素C(Cyt C)的氧化還原對和細胞色素C氧化酶(COX)之間的相互作用。在該研究中，原位EC-SPR有望更好地模擬COX嵌入線粒體內(nèi)膜的體內(nèi)條件。而且，利用Cyt C在流動相中充當電子穿梭物，是研究氧化還原依賴性生物分子相互作用的有效方法。Wu等[56]采用EC-SPR研究的策略來評估在SPR芯片界面上用DNR處理的癌細胞。從SPR記錄的信號變化是由吸附的HepG2細胞的形態(tài)和質(zhì)量變化以及培養(yǎng)基溶液的折射率變化引起的。培養(yǎng)基中細胞外的DNR殘留濃度可通過電化學方法測定。光學顯微鏡圖像和MTT測試的結(jié)果還證明,相關細胞的釋放或解吸是由DNR處理后癌細胞的凋亡引起的。SPR信號幅度的降低與細胞存活率線性相關。觀察表明SPR與電化學研究的組合可用于評估細胞中生物活性劑的治療效率。因此，這種無標記的實時EC-SPR方法在監(jiān)測相關臨床治療過程和藥物分析方面具有巨大的應用潛力。Wu等[57]建立了一種基于SPR的檢測方法，應用EC對氨芐青霉素檢測中使用的適體平臺進行精制和表征?；贏PT修飾的金芯片的新型SPR方法被開發(fā)用于AMP的選擇性、靈敏、實時和無標記測定。通過潛在的脈沖電化學方法改善了在特定APT的金芯片上的固定。通過SPR、CV、EIS和石英晶體微天平分析表征了適體傳感器精制的每個步驟。經(jīng)開發(fā)的適體傳感器被證明對AMP檢測具有選擇性，且?guī)缀醪皇芷渌股睾退幬锏挠绊?，并已成功用于河水中AMP的檢測。

3 展望

SPR對金屬膜上發(fā)生的各種反應高度敏感，并且已經(jīng)成為研究在表面上發(fā)生的分子結(jié)合過程的強有力的無標記方法。另一個重要但較少探索的應用領域是使用EC-SPR聯(lián)合，該方法將EC與光學方法結(jié)合，使EC和SPR技術特點相互補充，雖然二者都是研究界面及界面附近物質(zhì)的變化，但信號的來源各不相同，EC為電子轉(zhuǎn)移過程，SPR為折射率的變化。EC-SPR聯(lián)用技術相比于單一技術，能夠得到綜合且全面的信息。而SPR芯片的金膜又可以作為EC的工作電極，通過對樣品流動池的簡單改造便可搭建三電極電化學池。兩種技術聯(lián)用對于研究在電極表面上發(fā)生的非均相反應，以及用于測量反應物質(zhì)的光學性質(zhì)具有獨特的優(yōu)勢，這可以幫助識別反應機理從而更好地監(jiān)測和理解生化過程。同時，EC-SPR聯(lián)合跳出了SPR聯(lián)用技術中簡單結(jié)合的思路，能夠在更深層次上認識SPR信號與EC信號的關系，搭建起兩種信號之間的紐帶。

值得一提的是，近期SPR技術相關的研究多數(shù)依賴于成熟的商業(yè)化設備，由于此類設備系統(tǒng)較為封閉，且芯片試劑等材料均為設備公司提供，阻礙了EC-SPR聯(lián)用方面的研究，且儀器昂貴，不便于推廣。隨著功能納米材料微型化、新特性和新功能的需求日益增長，多技術聯(lián)用方面的應用前景越來越廣闊。EC-SPR和其他技術(例如：高效液相色譜、光學顯微技術、原子顯微鏡等)進一步聯(lián)用的相關研究會逐步深入，EC-SPR的應用范圍也會進一步擴大。接下來EC-SPR的儀器集成化、微型化和檢驗自動化或?qū)⒊蔀槲磥黹_發(fā)的重點。