CRISPR-Cas生物傳感器研究進(jìn)展

李凱,羅云波,許文濤*

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100083;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(食用)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083

CRISPR系統(tǒng)源于細(xì)菌體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，能夠?qū)ν鈦砗怂岱肿舆M(jìn)行識別和剪切。由于CRISPR系統(tǒng)特異性的識別機(jī)制，研究人員將其開發(fā)成為新型的基因編輯技術(shù)，使其成為最熱的分子生物學(xué)工具。以CRISPR-Cas9體系為代表的編輯系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域，如用于建立新型育種方式、研制新型基因藥物以及探索生物體內(nèi)通路等。CRISPR應(yīng)用最多的為基因編輯領(lǐng)域，CRISPR技術(shù)能夠準(zhǔn)確的靶向目標(biāo)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)切割,促使胞內(nèi)自動修復(fù)系統(tǒng)完成對靶標(biāo)序列堿基的替換和缺失。近年來，雖然CRISPR技術(shù)脫靶效應(yīng)產(chǎn)生的潛在風(fēng)險逐漸被發(fā)現(xiàn)，但是隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，問題也會隨之逐步解決。CRISPR與靶標(biāo)序列的特異性結(jié)合方式成為了一種特殊的信號識別機(jī)制，可以應(yīng)用在生物傳感領(lǐng)域。越來越多的研究人員開始以CRISPR系統(tǒng)為基礎(chǔ)，與其他技術(shù)結(jié)合在一起，如等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification)、電化學(xué)傳感、光學(xué)顯色等,以建立特殊的生物傳感器。此類傳感器具有識別特異性強(qiáng)、檢測靈敏度高、簡單方便等特點(diǎn)。因此本文綜述了基于CRISPR-Cas生物傳感器的研究進(jìn)展，以期為生物傳感器的相關(guān)研究提供參考。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)

1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

CRISPR/Cas是來源于一類廣泛存在于細(xì)菌及古細(xì)菌中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。1987年，日本科學(xué)家Ishino等[1]克隆并測序了iap基因，該基因負(fù)責(zé)大腸桿菌中堿性磷酸酶同工酶的轉(zhuǎn)化。隨后他們在研究中克隆并測序發(fā)現(xiàn)，在iap的下游有一組由29個核苷酸組成的重復(fù)序列被非重復(fù)、類似的短序列分開，這是首次對CRISPR特殊結(jié)構(gòu)進(jìn)行報道。在2002年，Jansen等[2]創(chuàng)造了術(shù)語“CRISPR”以反映這些特定結(jié)構(gòu)。通常，重復(fù)簇之前是“前導(dǎo)”序列，AT富集區(qū)域有幾百個堿基對，具有種內(nèi)保守性，但不具有種間保守性。CRISPR保守蛋白編碼基因，通常存在于整個基因座的一側(cè)。對幾個CRISPR基因座中間隔序列的分析表明，間隔區(qū)匹配來自外源遺傳元件的序列，如噬菌體和質(zhì)粒[3]。2007年，Barrangou等[4]的一項(xiàng)開創(chuàng)性研究首次證明了CRISPR序列是一種適應(yīng)性免疫途徑，可保護(hù)嗜熱鏈球菌免受噬菌體感染。Cas位點(diǎn)編碼的多個核酸酶和解旋酶可以把入侵的噬菌體DNA 切割，然后整合到CRISPR 的重復(fù)序列中。當(dāng)下次再遇到相同噬菌體入侵時，細(xì)菌轉(zhuǎn)錄RNA-Cas 蛋白復(fù)合物利用這些與入侵噬菌體DNA 同源的RNA去切割外源的DNA，從而達(dá)到識別并對抗噬菌體感染的目的。

1.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)分類

CRISPR-Cas系統(tǒng)包含多種類型，CRISPR-Cas系統(tǒng)大致分為兩大類(圖1)：1類系統(tǒng)依賴于多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物共同作用，而2類系統(tǒng)利用單個蛋白質(zhì)。在這兩類系統(tǒng)中，根據(jù)能夠表達(dá)Cas蛋白的種類的不同，到目前為止可分為I型、II型、III型、IV型、V型和VI型(圖1未包含VI型)，其中I、III、IV屬于第一大類，II、V、VI屬于第二大類。隨著對細(xì)菌免疫系統(tǒng)基因組功能的不斷挖掘，新型的CRISPR-Cas系統(tǒng)也逐漸被認(rèn)識。

I型CRISPR-Cas系統(tǒng)中具有特殊的cas3基因，能夠編碼出同屬具有解旋酶活性以及DNase活性的大分子蛋白質(zhì)。I類系統(tǒng)中還具有編碼多種其他蛋白的基因包括cas5、cas6和cas7，這些基因表達(dá)出來的蛋白會與Cas3蛋白相互結(jié)合形成復(fù)雜復(fù)合體共同行使作用。此外，參與CRISPR-Cas功能的復(fù)合蛋白中可能還包括BH0338，這類大蛋白家族以及Cse1和Cse2這類小的α-螺旋蛋白。CRISPR-Cas系統(tǒng)中表達(dá)的串聯(lián)蛋白復(fù)合體能夠加工前體crRNA，使之轉(zhuǎn)化為成熟crRNA。

圖1 CRISPR-Cas系統(tǒng)分類圖[5]Fig.1 Classification figure of CRISPR-Cas system[5]

II型CRISPR-Cas系統(tǒng)中最為人熟知的是CRISPR-Cas9。II類系統(tǒng)中包含特殊的cas9基因以及csn基因，根據(jù)csn的不同類型可將II類系統(tǒng)分為兩個亞型，分別包含csn2和csn4基因。Cas9蛋白是一種功能十分強(qiáng)大的蛋白質(zhì)，具有識別crRNA以及切割靶標(biāo)DNA的能力。Cas9蛋白具有兩個核酸內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)域，位于蛋白N端的RuvC和中部NHN，分別負(fù)責(zé)切割外源DNA與間隔序列的互補(bǔ)鏈和外源DNA的另外一條鏈。在整個切割過程中，首先tracrRNAs和前體crRNA中的重復(fù)序列雜交，再與Cas9蛋白進(jìn)行結(jié)合，通過RNaseIII對RNA復(fù)合體進(jìn)行切割，形成不同類型的成熟crRNA-tracrRNA-Cas9復(fù)合體。形成的成熟復(fù)合體再通過PAM序列識別進(jìn)行外源DNA切割。

III型CRISPR-Cas系統(tǒng)以cas10基因?yàn)闃?biāo)志基因，先前根據(jù)可以表達(dá)csm2和cmr5兩種亞基分為兩個亞型：III-A和III-B?，F(xiàn)已證明亞型III-A和亞型III-B CRISPR-Cas系統(tǒng)可以靶向RNA和DNA。后來研究人員發(fā)現(xiàn)了另外兩種III型系統(tǒng)：III-C和III-D。III-C亞型的顯著特征是Cas10蛋白的環(huán)化酶活結(jié)構(gòu)域的明顯失活。亞型III-D基因座通常編碼缺乏HD結(jié)構(gòu)域的Cas10蛋白，但它們還含有一種獨(dú)特的cas5基因，也稱為csx10。這兩種新亞型都缺少cas1和cas2基因，但整個系統(tǒng)具有完整的功能性。

IV型CRISPR-Cas系統(tǒng)是在不常見的幾種細(xì)菌的質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的一種新型CRISPR-Cas系統(tǒng)，csf1基因是該系統(tǒng)的標(biāo)志性基因。系統(tǒng)基因座的組成大部分與III-B亞型類似，缺少cas1和cas2基因。IV型系統(tǒng)可以編碼出最小的蛋白復(fù)合體對crRNA進(jìn)行加工，其中包括Csf1、Cas5和Cas7蛋白。IV型CRISPR-Cas系統(tǒng)有兩種不同的亞型，其中一種含有DinG家族解旋酶，第二種缺乏DinG但通常含有編碼小α-螺旋蛋白的基因，類似于亞型III-B系統(tǒng)，可以對多種重復(fù)回文系列進(jìn)行crRNA的加工。

V型CRISPR-Cas系統(tǒng)是基于在一種古細(xì)菌基因組發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特cpf1基因，后續(xù)也在幾種不同細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)了該系統(tǒng)的基因序列。該系統(tǒng)中cpf1基因與cas1、cas2、cas4和CRISPR序列相鄰，能夠表達(dá)Cpf1蛋白。Cpf1包含約1 300個氨基酸，具有跟Cas9相類似的RuvC結(jié)構(gòu)域，并且與精氨酸富集結(jié)構(gòu)和鋅指結(jié)構(gòu)相連接。雖然Cpf1缺乏Cas9蛋白中的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域，但V型系統(tǒng)能夠?qū)ν庠碊NA進(jìn)行準(zhǔn)確的識別和切割，從而對細(xì)菌起到保護(hù)防御的作用[6]。

VI型CRISPR-Cas系統(tǒng)是2015年張鋒與俄國科學(xué)家Koonin通過電腦分析得出的一種新型的CRISPR-Cas系統(tǒng)[7]，包括cas1、cas2、c2c2和CRISPR序列。該系統(tǒng)的特殊基因?yàn)閏2c2基因，能夠編碼C2C2蛋白。該蛋白具有兩個HEPN(higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding)結(jié)構(gòu)域，具有RNase活性能夠?qū)崿F(xiàn)對RNA的識別和剪切。通常認(rèn)為該系統(tǒng)是在細(xì)菌防御外源核酸入侵時，針對RNA設(shè)立的第二防線。

1.3 CRISPR-Cas生物傳感器在檢測成像中的應(yīng)用前景

核酸作為重要的生物標(biāo)志物，其在體內(nèi)的含量信息和位置信息都是相關(guān)疾病診斷中重要的參考條件。針對于DNA或者RNA檢測成像技術(shù)的開發(fā)，已經(jīng)成為重要的研究領(lǐng)域之一。以往的檢測成像技術(shù)以體外擴(kuò)增、蛋白雜交、微矩陣等技術(shù)為基礎(chǔ)，雖然可以實(shí)現(xiàn)對于靶標(biāo)的檢測成像要求，但是在時間、成本、精準(zhǔn)度、靈敏性方面都存在著一定的缺陷，所以需要建立更加快速準(zhǔn)確的檢測成像新手段。

隨著CRISPR-Cas在細(xì)菌免疫過程中的相關(guān)機(jī)制研究越來越清晰，以及多種類型的Cas蛋白不斷發(fā)現(xiàn)，CRISPR-Cas復(fù)合體對于外源DNA和RNA的高效特異性識別機(jī)制引起了研究者們的關(guān)注。例如雙鏈DNA序列特異性的Cas9蛋白酶、Cas12a蛋白酶，以及RNA序列特異性的Cas13a蛋白酶等。通過對CRISPR的體外定向修飾，建立了一定的邏輯機(jī)制，再結(jié)合不同剪切屬性的Cas酶可以建立起一系列基于CRISPR-Cas技術(shù)的檢測和成像傳感器，此類傳感器利用CRISPR-Cas高特異性的識別機(jī)制，能夠滿足高精準(zhǔn)檢測成像要求，在疾病預(yù)防診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 CRISPR-Cas9生物傳感器介導(dǎo)的檢測技術(shù)

CRISPR-Cas9系統(tǒng)由于Cas9蛋白的多功能特性，利用其DNA靶向剪切產(chǎn)物進(jìn)行循環(huán)放大以及信號輸出的方式可以對DNA核酸進(jìn)行高效檢測。東南大學(xué)生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王進(jìn)科教授團(tuán)隊(duì)利用Cas9蛋白的這一性質(zhì)，建立了CRISPR-PCR檢測方法靶向檢測人乳頭瘤病毒DNA[8]。在人乳頭瘤病毒保守序列上選取兩處sgRNA (single guide RNA)識別區(qū)域，建立sgRNA-Cas9復(fù)合物。首先利用PCR技術(shù)將該保守序列進(jìn)行初步擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物中加入sgRNA-Cas9復(fù)合物進(jìn)行特異性切割，剪切產(chǎn)物利用Taq酶在末端鏈接鳥苷酸，并將剪切產(chǎn)物連接到T載體上，最后利用含有T載體以及切割產(chǎn)物序列的特異性引物對連接好的質(zhì)粒進(jìn)行PCR，最終實(shí)現(xiàn)5 ng靶標(biāo)DNA的檢測(圖2)。該方法還同樣適用于qPCR進(jìn)行實(shí)時熒光檢測。

與上述方法原理類似，王進(jìn)科教授團(tuán)隊(duì)還建立了一種基于CRISPR-Cas9技術(shù)的反向PCR技術(shù)應(yīng)用于DNA檢測[9]。該方法在靶標(biāo)DNA片段上游、下游分別設(shè)計(jì)一條sgRNA，當(dāng)Cas9蛋白發(fā)生特異性剪切后會形成雙鏈片段，利用雙鏈片段設(shè)計(jì)的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增可以使剪切產(chǎn)品進(jìn)行分子內(nèi)成環(huán)或形成多片段產(chǎn)物(實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證產(chǎn)物為環(huán)狀結(jié)構(gòu))，在通過電泳或者qPCR熒光進(jìn)行結(jié)果的信號輸出(圖3)。該方法可以在1.5 h內(nèi)檢測到0.02 ng的樣品。

圖2 CRISPR-PCR檢測原理圖[8]Fig.2 The detection principle of CRISPR-PCR[8]

由于CRISPR-Cas9在識別基因組低拷貝靶標(biāo)基因時，其識別以及剪切的效率較低，為將靶標(biāo)含量提高到CRISPR-Cas9有效范圍內(nèi)，往往會在進(jìn)行Cas9剪切之前利用PCR或等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行靶標(biāo)的初步擴(kuò)增，CRISPR-Cas9系統(tǒng)僅用于終點(diǎn)分析，這在很大程度上限制了檢測技術(shù)的發(fā)展。鑒于此，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院生物醫(yī)學(xué)材料與界面中心喻學(xué)鋒研究員團(tuán)隊(duì)，建立了CRISPR-Cas9觸發(fā)的切口核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的SDA(strand displacement amplification)方法(CRISDA)，用于靈敏擴(kuò)增和檢測雙鏈DNA[10]。CRISDA技術(shù)充分利用了具有高靈敏度、高特異性和高獨(dú)特性的CRISPR-Cas系統(tǒng)識別靶DNA并釋放單鏈結(jié)構(gòu)的特性，結(jié)合穩(wěn)健的肽核酸(PNA)介導(dǎo)的終點(diǎn)測量，在復(fù)雜樣品背景下實(shí)現(xiàn)了amol級檢測和單堿基檢測。在進(jìn)行了一系列概念驗(yàn)證后，CRISDA能夠在人體基因組、轉(zhuǎn)基因玉米基因組等復(fù)雜背景條件下實(shí)現(xiàn)靶向的超靈敏檢測。首先，設(shè)計(jì)一對sgRNA(sgUPS/DNS)與Cas9蛋白結(jié)合，識別靶DNA的每個邊界并在兩個非靶標(biāo)鏈中誘導(dǎo)一對切口(圖4，步驟1)。隨后，引入一對引物以啟動SDA反應(yīng)(起始引物對，IPUPS/DNS)并與暴露的非靶標(biāo)鏈雜交(步驟2)。每個IP引物含有5′Nb.BbvCI核酸內(nèi)切酶切口位點(diǎn)，與暴露的非靶鏈互補(bǔ)的中間雜交區(qū)和與非靶鏈的雙鏈區(qū)互補(bǔ)的3′突出端。加入SDA混合物后，DNA聚合酶在單鏈DNA結(jié)合蛋白TP32的幫助下沿非靶鏈延伸IP引物。同時，暴露的非靶鏈也通過DNA聚合酶從Cas9誘導(dǎo)的切口位點(diǎn)延伸到退火的IP引物的5′末端，產(chǎn)生雙鏈Nb.BbvCI核酸內(nèi)切酶切口位點(diǎn)。另外，Nb.BbvC、聚合酶和SSB一起反Cas9結(jié)合位作用以沿著靶DNA給予相點(diǎn)的線性鏈置換反應(yīng)(步驟3)。然后，將線性置換的單鏈Strand-For和Strand-Rev分別與引物IPDNS和IPUPS退火，進(jìn)一步在90 min內(nèi)誘導(dǎo)所選靶序列的指數(shù)擴(kuò)增，得到產(chǎn)物1～3(步驟4)。最后，添加靶向擴(kuò)增子的生物素標(biāo)記和Cy5標(biāo)記的PNA探針，并在簡單的磁性下拉后通過Cy5的熒光強(qiáng)度定量測定擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA(步驟5)。

圖3 CRISPR介導(dǎo)的反向PCR檢測原理圖[9]Fig.3 The principle of reverse PCR detection based on CRISPR[9]

圖4 CRISDA超靈敏檢測DNA原理圖[10]Fig.4 The principle of ultrasensitive DNA detection based on CRISDA[10]

CRISPR-Cas9系統(tǒng)與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合可以有效提高檢測靈敏度，實(shí)現(xiàn)超靈敏檢測。但是，在實(shí)際基因組DNA檢測中，PAM位置的不可選擇性為建立CRISPR-Cas9切割位點(diǎn)制造了障礙。不過有報道稱，Cas9-sgRNA復(fù)合物在有PAM獨(dú)立單鏈存在的條件下，就可以對ssDNA或者ssRNA進(jìn)行特異性識別和剪切[11-12]。根據(jù)這個特點(diǎn)，華南師范大學(xué)邢達(dá)教授團(tuán)隊(duì)在利用人為添加PAM序列的基礎(chǔ)上，將CRISPR-Cas9系統(tǒng)與恒溫指數(shù)擴(kuò)增(isothermal exponential amplification reaction,EXPAR)相結(jié)合建立了CAS-EXPAR核酸檢測模型[13]。整個反應(yīng)原理如圖5A，使用與PAM序列互補(bǔ)的李斯特菌溶血素基因片段作為靶模型。首先，sgRNA被設(shè)計(jì)為包含三個區(qū)段：20 nt指引序列、30 nt雙鏈互補(bǔ)區(qū)域和3個tracrRNA莖環(huán)。sgRNA可以與Cas9結(jié)合以形成活化的Cas9/sgRNA復(fù)合物，其可以進(jìn)行靶標(biāo)的位點(diǎn)特異性切割。其次，設(shè)計(jì)EXPAR模板(T)以執(zhí)行隨后的指數(shù)擴(kuò)增，其中心位置具有NEase識別序列，兩段式能夠與Cas9切割的靶片段(X)互補(bǔ)的側(cè)翼區(qū)(X′)。通過這些設(shè)計(jì)，X與T的3′末端區(qū)域的X′雜交形成復(fù)合物(TX)，并作為DNA聚合酶的引物，合成具有完整識別序列的雙鏈DNA。然后，NEase在形成的dsDNA中切割T的互補(bǔ)鏈，并且DNA聚合酶可以依次延伸切割的dsDNA，同時置換X。釋放的X可以與另一個T雜交以再次觸發(fā)擴(kuò)增。通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的切割、NEase切割、聚合酶延伸和鏈置換的反應(yīng)，可以產(chǎn)生大量的dsDNA。結(jié)果表明，該方法的檢出限為0.82 amol，并且在鑒別單堿基錯配方面表現(xiàn)出極佳的特異性。利用相同原理，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉英菊教授團(tuán)隊(duì)建立了基于CRISPR-Cas9技術(shù)的比色傳感器并成功用于鑒定致病疫霉基因組DNA[14]。該方法利用CRISPR-Cas9特異性切割出發(fā)擴(kuò)增反應(yīng)并將金納米顆粒(AuNPs)作為光學(xué)探針，最后通過AuNPs的聚散程度導(dǎo)致顏色從酒紅色到紫色的變化進(jìn)行判斷(圖5B)?？梢暬瘷z測極限為2 pmol，通過吸光度測量值判斷的線性范圍在0.2 pmol/L～20 nmol/L之間。

A：CRISPR-EXPAR反應(yīng)原理圖；B：CRISPR識別機(jī)制偶聯(lián)RCA滾環(huán)擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)核酸顯色檢測 a—CRISPR-Cas識別、剪切特異性位點(diǎn)；b—EXAPR實(shí)現(xiàn)單鏈富集并觸發(fā)RCA滾環(huán)擴(kuò)增；c—金納米富集產(chǎn)生顏色變化。圖5 CRISPR-EXPAR反應(yīng)原理與CRISPR識別機(jī)制偶聯(lián)RCA滾環(huán)擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)核酸顯色檢測[13-14]Fig.5 The principle of CRISPR-EXPAR and color method of DNA detection based on CRISPR-EXPAR assay[13-14]

3 CRISPR-dCas9生物傳感器介導(dǎo)的檢測技術(shù)

CRISPR-dCas9系統(tǒng)是將Cas9蛋白的RuvC和NHN兩個核酸酶活性區(qū)域同時進(jìn)行了突變，成為剪切功能去除后的突變體，該突變體不具有核酸酶活性但是仍然保留了高特異的識別能力。研究人員已經(jīng)將這種功能蛋白有效的利用在識別和成像等領(lǐng)域。

韓國蔚山大學(xué)醫(yī)學(xué)院Yong Shin教授將CRISPR-dCas9系統(tǒng)、RPA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)以及硅微環(huán)諧振器(silicon mirroring resonator,SMR)相結(jié)合，在硅微環(huán)諧振器上完成核酸的檢測[15]。為了能夠同時擴(kuò)增和檢測核酸，該方法將靶序列特異性引物固定在SMR生物傳感器表面，引物在恒定溫度條件下進(jìn)行RPA等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(圖6)。對于DNA，引物結(jié)合重組酶以延伸DNA；對于RNA，通過RT-RPA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物中含有能夠被dCas9-sgRNA復(fù)合體識別的序列，dCas9與傳感器表面上的擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合并增加傳感器表面的分子量，從而通過增加折射率變化來增加檢測靈敏度。該方法在20 min內(nèi)可以完成對靶標(biāo)的檢測，通過對蜱傳相關(guān)疾病檢測應(yīng)用，可以達(dá)到0.54 amol，這種檢測靈敏度比RT-PCR檢測靈敏度高100倍。

圖6 CRISPR介導(dǎo)的SMR傳感器原理圖[15]Fig.6 The principle of of SMR biosensor mediated by CRISPR[15]

國防科技大學(xué)朱凌云團(tuán)隊(duì)將CRISPR-dCas9系統(tǒng)與滾環(huán)體外核酸擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用到生物傳感器中建立了RCA-CRISPR-split-HRP傳感器，實(shí)現(xiàn)了對miRNA的快速高效檢測[16]。其原理是靶標(biāo)miRNA促發(fā)RCA擴(kuò)增形成多種發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)，再通過sgRNA-dCas9系統(tǒng)將批量的HRP酶活蛋白重新靠近產(chǎn)生活性，最后通過加入TMB發(fā)生顯色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)miRNA的檢測(圖7A)。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)fmol級別、單堿基差異的miRNA檢測。該團(tuán)隊(duì)還利用上述方法制作試劑盒，該試劑盒在實(shí)地檢驗(yàn)過程中可以在37℃條件下對于血液樣品4 h內(nèi)完成，并且試劑盒保質(zhì)期可以達(dá)到一年(圖7B)。

dCas9-sgRNA復(fù)合體能夠通過堿基互補(bǔ)配對與靶標(biāo)進(jìn)行結(jié)合，這種結(jié)合方式與抗原抗體免疫結(jié)合相類似。利用這種識別機(jī)制，韓國生物科學(xué)與生物技術(shù)研究所Juyeon Jung研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了基于dCas9-sgRNA的核酸熒光原位雜交顯色傳感器用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)的檢測[17]。體外表達(dá)的dCas9一端連接磁性納米顆粒，通過與sgRNA結(jié)合后對MRSA基因組特異性片段識別(反應(yīng)時間30 min)。結(jié)合后，通過磁力進(jìn)行吸附洗脫，若樣品中含有靶標(biāo)序列，dCas9-sgRNA-靶標(biāo)-磁珠復(fù)合物將吸附停留在檢測池，加入DNA雙鏈熒光染料SYBR Green I，通過判斷是否產(chǎn)生綠色進(jìn)行MRSA的可視化檢測(圖8)。通過測得溶液熒光強(qiáng)度可以進(jìn)行定量檢測，檢測限為10 CFU/mL。該方法舍去了常用檢測方法中對于靶標(biāo)序列的擴(kuò)增過程，有效減少了時間。結(jié)果通過顏色變化能夠更加直觀的體現(xiàn)結(jié)果，從而有效的實(shí)現(xiàn)MRSA病原菌的現(xiàn)場快速檢測。

A：CRISPR-Cas9介導(dǎo)的RCA等溫?cái)U(kuò)增生物傳感器原理；B：CRISPR-RCA試劑盒制作流程。圖7 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的RCA等溫?cái)U(kuò)增生物傳感器原理與CRISPR-RCA試劑盒制作流程[16]Fig.7 The principle of RCA amplification biosensor mediated by CRISPR and the production progress of CRSIPR-RCA reaction kit[16]

A：CRISPR-dCas9介導(dǎo)FISH方法檢測MRSA原理圖；B：芯片原位顯色方法。圖8 CRISPR-dCas9介導(dǎo)FISH方法檢測MRSA原理圖與芯片原位顯色方法Fig.8 The principle of MRSA detection by CRSIPR-dCas9 mediated FISH biosensor and in situ detection method on chip

CRISPR-dCas9系統(tǒng)作為一種核酸特異性識別工具，通常需要對目標(biāo)進(jìn)行一定的擴(kuò)增富集后才能更好的行使作用[18-19]。為了建立更加簡便的一步完成靶標(biāo)識別的方法，研究人員開始引入納米材料構(gòu)建方法。納米材料由于其優(yōu)越的物理性質(zhì)，可以通過靈敏的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行信號輸出。荷蘭代爾夫特理工大學(xué)Kavli納米科學(xué)研究所的Cees Dekker團(tuán)隊(duì)建立了基于CRISPR-dCas9的固態(tài)納米孔對DNA進(jìn)行檢測[20]。該方法首先將靶RNA與dCas9預(yù)孵育，然后與靶標(biāo)DNA樣品混合(圖9A)。使結(jié)合CRISPR-dCas9的DNA通過固態(tài)納米孔，其中dCas9蛋白結(jié)合的DNA信號能夠產(chǎn)生明顯的特征，從而鑒定特定的DNA序列(圖9B，C)。并且，該團(tuán)隊(duì)還驗(yàn)證了在高鹽濃度下，該體系仍然適用。由于dCas9蛋白增大了流體動力學(xué)半徑，使得靶標(biāo)信號增強(qiáng)，即使在大孔徑條件下仍然可以實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)檢測。該團(tuán)隊(duì)成功應(yīng)用該方法對DNA進(jìn)行了分型，并且預(yù)測該方法可以應(yīng)用到疾病菌株的快速鑒定、抗生素抗性檢測以及基因組的分型中。

A:CRISPR-sgRNA結(jié)合靶DNA；B:CRSIPR識別復(fù)合體通過固態(tài)納米孔；C:電流變化實(shí)現(xiàn)DNA檢測圖9 基于CRISPR-dCas9的固態(tài)納米孔檢測DNA[20]Fig.9 DNA detection of solid state nanopore biosensor based on CRSIPR-dCas9[20]

4 CRISPR-Cas12a生物傳感器介導(dǎo)的檢測技術(shù)

CRISPR-Cas12a蛋白也叫做Cpf1蛋白，屬于第二大類，第V型系統(tǒng)。該蛋白在RNA指導(dǎo)下，能夠結(jié)合并切割外源DNA，也是細(xì)菌免疫系統(tǒng)的組分。RNA引導(dǎo)的Cas12a結(jié)合DNA后具有切割任意單鏈DNA的活性，完全降解ssDNA分子。加州大學(xué)伯克利分校Jennifer A.Doudna教授發(fā)現(xiàn)Cas12a擁有這種特殊性質(zhì)之后，通過將Cas12a與等溫?cái)U(kuò)增相結(jié)合，創(chuàng)建了一種名為DETECTR(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter)的方法[21]。首先將血液樣本進(jìn)行前處理，之后進(jìn)行RPA的初步擴(kuò)增。再將crRNA-Cas12a復(fù)合物以及進(jìn)行熒光淬滅的ssDNA探針一起加入，當(dāng)與雙鏈DNA特異性結(jié)合之后，活化Cas12a會無差別的切割ssDNA探針，從而釋放熒光信號(圖10)。該方法實(shí)現(xiàn)了對DNA在μmol級的檢測，并且DETECTR能夠快速、特異地檢測到患者樣本中的人乳頭瘤病毒，為分子診斷提供了一個簡單的平臺。

5 CRISPR-Cas13a系統(tǒng)介導(dǎo)的檢測技術(shù)

Cas13a蛋白又叫做C2C2蛋白，屬于第二大類的VI型CRISPR-Cas系統(tǒng)，是2015年張鋒和Koonin利用RNA測序技術(shù)分析得出新一類VI型CRISPR-Cas系統(tǒng)的代表[19]。Cas13a蛋白在與sgRNA形成功能性復(fù)合物后，再與靶RNA識別可以在形態(tài)學(xué)上激活Cas13a的非特異性反式核糖核酸酶活性，能夠?qū)θ我鈫捂淩NA進(jìn)行剪切。CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的出現(xiàn)掀起了針對RNA靶標(biāo)的新型基因編輯應(yīng)用浪潮。

圖10 DETECTR檢測雙鏈DNA原理圖[21]Fig.10 DNA detection principle by DETECTR biosensor[21]

根據(jù)以上性質(zhì)，2017年張鋒團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了基于CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的傳感器,稱為SHERLOCK(specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking),實(shí)現(xiàn)了對DNA快速、廉價、高靈敏的檢測[19]。由于Cas13a/sgRNA系統(tǒng)識別底物為RNA序列，所以在進(jìn)行DNA檢測時，需要后續(xù)進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄過程。SHERLOCK技術(shù)首先利用了RPA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)將樣品中的靶標(biāo)DNA進(jìn)行富集，經(jīng)過T7轉(zhuǎn)錄法將DNA轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA(圖11)。將構(gòu)建好的crRNA-Cas13a復(fù)合體以及熒光RNA探針與樣品RNA混合，當(dāng)樣品中存在與crRNA堿基互補(bǔ)的序列時，Cas13a的RNase酶活性激活會對周圍熒光淬滅RNA探針進(jìn)行剪切從而釋放熒光信號。該團(tuán)隊(duì)利用CRISPR-Cas13a傳感器實(shí)現(xiàn)了體外μmol級別的檢測并且可以識別單堿基的錯配，同時應(yīng)用于寨卡病毒和登革熱病毒中特定菌株的檢測、區(qū)分致病菌、人類DNA基因分型，及鑒定無細(xì)胞腫瘤DNA突變等。此外，SHERLOCK反應(yīng)試劑可以冷凍干燥，以實(shí)現(xiàn)長期儲存，并可在紙上輕松復(fù)原，為現(xiàn)場檢測應(yīng)用提供了方法基礎(chǔ)。東南大學(xué)何農(nóng)越教授團(tuán)隊(duì)利用該技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了對禽流感H7N9病毒的現(xiàn)場檢測[22]，在5 min內(nèi)可以檢到1 nmol級的RNA模板，與RT-RPA結(jié)合50 min內(nèi)可以檢測到1 fmol級的DNA模板。

鑒于Cas13a對RNA的專屬識別機(jī)制，利用其建立針對miRNA的檢測方法更加準(zhǔn)確、方便。邢達(dá)教授團(tuán)隊(duì)首次利用纖毛菌體內(nèi)的Cas13a建立了miRNA的檢測傳感器(圖12)[23]。該方法擺脫了對靶標(biāo)序列預(yù)擴(kuò)增的過程，有效的避免了基因組DNA污染的影響。該方法的高特異性不僅來源于crRNA與模板的堿基互補(bǔ)配對，Cas13a蛋白酶的高保真度使該方法能夠區(qū)分存在于miRNA末端的單核苷酸突變。利用此方法檢測miRNA，檢測線可達(dá)到4.5 amol級別，并且線性范圍跨越4個數(shù)量級，從10 amol級到100 fmol級。此外，在面對復(fù)雜生物樣品(血清)時，該方法也表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用效果。

圖11 SHERLOCK檢測核酸原理圖[19]Fig.11 Detection principle of SHERLOCK biosensor[19]

圖12 CRISPR-Cas13a檢測miRNA原理圖[23]Fig.12 miRNA detection principle of CRSIPR-Cas13a biosensor[23]

6 CRISPR-Cas系統(tǒng)在胞內(nèi)成像中的應(yīng)用

細(xì)胞中，基因組DNA呈現(xiàn)高度折疊狀態(tài)并存在于三維空間中。細(xì)胞核中染色質(zhì)的空間組織和不同染色質(zhì)區(qū)域的相對位置關(guān)系與正常發(fā)育和疾病中的基因調(diào)控緊密相關(guān)。通過對胞內(nèi)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域或基因進(jìn)行可視化定位，能夠進(jìn)一步用于疾病相關(guān)研究和診斷。傳統(tǒng)的胞內(nèi)核酸成像多利用探針雜交技術(shù)，例如DNA熒光原位雜交技術(shù)。但傳統(tǒng)方法需要首先對基因組進(jìn)行物理或者化學(xué)處理，例如通過熱和甲酰胺進(jìn)行嚴(yán)格處理以使dsDNA變性以允許探針雜交，因此該方法存在影響生物結(jié)構(gòu)和基因組組織完整性的風(fēng)險，并且寡核苷酸探針的高成本也是傳統(tǒng)方法的一大缺陷。因此，開發(fā)更簡單有效、成本低廉和穩(wěn)健的成像技術(shù)具有重要意義。

CRIPSR系統(tǒng)對于核酸序列的特異性結(jié)合方式為建立新型識別機(jī)制提供了新方法，并且Cas蛋白的生物相容性也為該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)成像提供了生物安全保證。核酸酶缺陷型Cas9衍生物(dCas9)常常被用于胞內(nèi)核酸物質(zhì)的識別，通過結(jié)合不同熒光基團(tuán)實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)的實(shí)時成像和原位成像。早在2013年，加州大學(xué)舊金山分校的黃波教授團(tuán)隊(duì)通過優(yōu)化的CRISPR-Cas系統(tǒng)對活細(xì)胞中的基因組基因座進(jìn)行動態(tài)成像[24]。利用EGFP標(biāo)記的dCas9和結(jié)構(gòu)優(yōu)化的sgRNA，成功的對端粒中重復(fù)元件和活細(xì)胞中編碼基因進(jìn)行穩(wěn)定成像(圖13A)。美國霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的Robert H.Singer研究員團(tuán)隊(duì)將此方法進(jìn)行了改進(jìn)[25]，在dCas9上連接不同熒光基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)對胞內(nèi)基因組兩個基因座的原位成像(圖13B)。

以上幾種方式都是將熒光基團(tuán)修飾在dCas9蛋白末端，信號的富集主要由胞內(nèi)基因組上靶標(biāo)序列的重復(fù)性決定。所以上述方法在建立時，都是針對于染色體著絲粒前端多重復(fù)系列進(jìn)行設(shè)計(jì)成像的，在面對靶標(biāo)序列為低重復(fù)甚至單拷貝時具有很大的局限性。研究人員后續(xù)利用CRISPR-dCas9進(jìn)行了進(jìn)一步的改良[26-27]，通過設(shè)計(jì)具有特殊發(fā)卡結(jié)構(gòu)的sgRNA，將不同熒光蛋白連接到相應(yīng)發(fā)卡位置，能夠?qū)崿F(xiàn)熒光信號的富集，再通過與靶標(biāo)序列結(jié)合，完成胞內(nèi)核酸序列的成像(圖13C，D)。

A：EGFP標(biāo)記的dCas9對端粒中重復(fù)序列的準(zhǔn)確成像；B：雙熒光標(biāo)記的dCas9實(shí)現(xiàn)基因組雙基因座成像；C,D：熒光標(biāo)記sgRNA實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)核酸成像圖13 基于CRISPR-dCas9技術(shù)的胞內(nèi)核酸成像[24-27]Fig.13 Intracellular nucleic acid imaging by biosensor based on CRSIRP-dCas9[24-27]

7 展望

CRISPR-Cas技術(shù)作為當(dāng)下最常用的基因編輯工具，被廣泛的用于新品種培育、基因通路研究以及基因藥物研制等領(lǐng)域，并取得了巨大的成功。但是，關(guān)于CRISPR技術(shù)的負(fù)面報道也經(jīng)常出現(xiàn)，最受關(guān)注的即CRSIPR技術(shù)的脫靶效應(yīng)問題。一些報道指出，CIRSPR系統(tǒng)介導(dǎo)的體內(nèi)編輯基因組DNA雙鏈斷裂修復(fù)會產(chǎn)生大量脫靶效應(yīng)，極有可能造成切割位點(diǎn)遠(yuǎn)端DNA大片段丟失、乃至其他更為復(fù)雜的基因突變[28-29]。雖然，有些研究報道后被撤回，但關(guān)于CRISPR技術(shù)的潛在風(fēng)險引起了人們對于該技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的擔(dān)憂。此外，該技術(shù)應(yīng)用于體內(nèi)還面臨著很多挑戰(zhàn)，如編輯效率以及遞送方式等問題。但是，毫無疑問的是CRIPSR的時代已經(jīng)來臨，越來越多的研究人員已經(jīng)投入到此項(xiàng)技術(shù)的改進(jìn)和完善工作中。多種基于新型CRISPR系統(tǒng)的編輯工具逐漸被開發(fā)出來。為了避開其潛在的風(fēng)險，我們可以利用這種新型的技術(shù)應(yīng)用于疾病相關(guān)檢測、成像領(lǐng)域。通過多種跨學(xué)科技術(shù)的聯(lián)用建立生物傳感器，將CRIPSR系統(tǒng)的優(yōu)勢發(fā)揮到最大。建立多重邏輯關(guān)系，通過核酸實(shí)現(xiàn)多種疾病標(biāo)志物的檢測，從而在分子水平上實(shí)現(xiàn)更高精確度和可靠性的疾病診斷。