功能核酸DNA水凝膠的理化特性及應(yīng)用進(jìn)展

馬翾,張洋子,許文濤,2*

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)(食用)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083

DNA作為一種多功能生物大分子，特殊的分子結(jié)構(gòu)決定其具有多種生物學(xué)性質(zhì)[1]。DNA簡單有序的分子結(jié)構(gòu)以及氫鍵、離子鍵等非共價(jià)鍵之間的相互作用，使DNA在機(jī)體的生理環(huán)境中保持高度穩(wěn)定性；DNA骨架上高電荷密度的磷酸基團(tuán)賦予了DNA優(yōu)異的靈活性和生物相容性；此外，堿基序列的可編程性和經(jīng)典的堿基互補(bǔ)配對原則賦予了DNA精確的識別能力和高通用性[2-4]。這些優(yōu)良屬性為DNA從生物化學(xué)領(lǐng)域拓展至納米材料領(lǐng)域提供了基礎(chǔ)，如將DNA引入水凝膠結(jié)構(gòu)可融合精確的可編程性，包括設(shè)計(jì)富鳥嘌呤(G)序列以提高水凝膠載體對金屬離子的敏感性，使攜有熒光基團(tuán)的隨機(jī)單鏈配對形成雙鏈成膠以實(shí)現(xiàn)響應(yīng)型檢測等[5]。

DNA水凝膠是一類高度交聯(lián)的多孔納米材料，三維網(wǎng)絡(luò)和多孔架構(gòu)賦予其高負(fù)荷容量、優(yōu)異的機(jī)械穩(wěn)定性和粘彈性等[6]。而且，隨著功能核酸的引入，尤其是借助能夠可逆控制的核酸結(jié)構(gòu)，使得DNA水凝膠獲得可設(shè)計(jì)的刺激響應(yīng)性能從而開發(fā)智能納米材料和形狀記憶裝置[7-8]。然而，由于體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜及成膠機(jī)理不清等問題，目前功能核酸DNA水凝膠在藥物和基因靶向遞送、生物傳感、仿生組織的制備中的研究與應(yīng)用仍處于初級階段，在設(shè)計(jì)、開發(fā)DNA水凝膠時(shí)還需要從多方面考慮其理化性質(zhì)[9-12]。如應(yīng)用于靶向藥物、基因遞送時(shí)，除了憑借功能核酸高度的靶向特性，納米材料的機(jī)械性能和降解速率也是完成有效遞送的關(guān)鍵因素[13]。

基于此，本文綜述了功能核酸DNA水凝膠的理化性質(zhì)，總結(jié)了DNA賦予水凝膠材料的特異性、靶向性、生物相容性、可降解性、特殊的形貌特征和一定的機(jī)械強(qiáng)度等獨(dú)特屬性，從而清晰地定位DNA作為納米材料的優(yōu)勢，以期為功能核酸DNA水凝膠的設(shè)計(jì)與組裝提供理論依據(jù)；并綜述了功能核酸DNA水凝膠目前在組織工程、生物傳感、納米開關(guān)、控釋系統(tǒng)和靶向響應(yīng)檢測等領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展，旨在更好地明確DNA水凝膠在分子檢測、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展方向。

1 DNA水凝膠的理化特性

功能核酸DNA水凝膠不僅憑借功能核酸良好的生物相容性、可降解性和特定的功能序列來傳遞和響應(yīng)環(huán)境信息、維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及調(diào)節(jié)水凝膠的收縮與膨脹等，而且還兼具了水凝膠材料的柔軟性和遇水溶脹性。對功能核酸DNA水凝膠理化特性的研究將為其在實(shí)際應(yīng)用中的設(shè)計(jì)提供重要依據(jù)。

1.1 可變的尺寸大小及形貌結(jié)構(gòu)

DNA水凝膠的尺寸大小和形貌特征依賴于DNA鏈的長短、濃度和序列設(shè)計(jì)，可使用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)、原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)和動(dòng)態(tài)光散射等表征手法確定DNA水凝膠的微觀形態(tài)和平均粒徑。DNA分子的堿基堆積力和雙螺旋結(jié)構(gòu)賦予其獨(dú)特的剛性，以此DNA水凝膠表現(xiàn)出長鏈分子的形貌柔軟性和構(gòu)象。如圖1所示，通過交聯(lián)制備的DNA水凝膠表面光滑且多孔，在SEM下還顯示出獨(dú)特的三維珊瑚狀結(jié)構(gòu)[14]。單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)因其剛性駐留長度僅為4 nm，相較于雙鏈DNA(double-strand DNA，dsDNA)(剛性駐留長度為50 nm)柔性更好，因此將dsDNA分子彎曲成圓形所需的能量大約是ssDNA的50倍[15-16]。所以，常采用大量ssDNA致密地連接成水凝膠，圖2中便是將合成的分子內(nèi)及分子間2種不同構(gòu)型的G-四聯(lián)體(G-quadruplex，G4)序列進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(rolling circle amplification，RCA)得到的長ssDNA，達(dá)到一定濃度后聚集產(chǎn)生緊密程度不同的DNA納米花，結(jié)果表明分子間G4水凝膠比分子內(nèi)的結(jié)構(gòu)更致密[17]。

圖1 在掃描電子顯微鏡下具有三維珊瑚狀結(jié)構(gòu)的多孔狀質(zhì)粒DNA水凝膠圖像[14]Fig.1 Scanning electron microscopy (SEM)images of the porous plasmid DNA hydrogel with three-dimensional coralline structure[14]

圖2 經(jīng)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)得到2種構(gòu)型的長ssDNA聚集而成的納米花SEM圖像[17]Fig.2 Nanoflowlers SEM images of two different configurations of long ssDNA assembled by rolling circle amplification[17]

基于DNA分子的彎曲性和序列可變性能夠設(shè)計(jì)出形狀可控型DNA水凝膠。在研究基因遞送載體時(shí)，Li等[18]通過使用2種Y形DNA單體(A單體和B單體)和DNA接頭在一步反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)自組裝，組成DNA水凝膠。DNA水凝膠尺寸的大小可以通過改變2種單體的濃度比例調(diào)節(jié)[19]。其中，A單體的3條ssDNA都具有粘性末端，作為結(jié)構(gòu)單元能夠與接頭雜交；B單體僅具有1條帶粘性末端和1條能與適配體特異性結(jié)合的鏈。而二硫鍵憑借能在血液循環(huán)中保持相對穩(wěn)定并被細(xì)胞溶質(zhì)中的還原劑谷胱甘肽(gutathione，GSH)切割裂解的功能性，成為在瓊脂糖凝膠中檢驗(yàn)DNA水凝膠在細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境中是否可降解的基礎(chǔ)[20]。將二硫鍵連接到Y(jié)形DNA單體和接頭中，一旦出現(xiàn)GSH，則通過自組裝形成尺寸為144 nm的球形DNA水凝膠，當(dāng)其尺寸過大時(shí)，可發(fā)生裂解，表明二硫鍵被GSH切割，從而促進(jìn)內(nèi)部治療基因的選擇性釋放。同時(shí)，借助指數(shù)富集后能靶向人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的適配體，通過將這些功能化適配體摻入構(gòu)建單元設(shè)計(jì)有效的基因遞送水凝膠[21]。

DNA水凝膠尺寸的快速調(diào)節(jié)是開發(fā)仿生裝置(如人工肌肉)的重要條件[22]。ssDNA在無任何化學(xué)修飾時(shí)隨機(jī)組裝纏結(jié)成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對鹽和酸堿度的變化有強(qiáng)烈的敏感反應(yīng)，即在生理?xiàng)l件下(pH 7，[Na+] = 0.15 mol/L)顯示出在長度上的快速響應(yīng)，這種反應(yīng)來自DNA磷酸基團(tuán)的靜電排斥和柔性DNA骨架上堿基對的疏水相互作用[23]。若開發(fā)具有合理響應(yīng)性的水凝膠，還需要了解其物理性質(zhì)。Simon等[24]向利用熒光基團(tuán)(紅色熒光)修飾的適配體構(gòu)建出的功能核酸水凝膠中嵌入直徑為210 nm～3.2 μm的熒光微珠，這種具有熒光特性DNA水凝膠的溶解時(shí)間隨微珠尺寸的增加而增加，并呈現(xiàn)出被搭載物的尺寸閾值釋放行為。此外，DNA水凝膠的尺寸是保證其在細(xì)胞中被攝取和輸送的一個(gè)關(guān)鍵特征，應(yīng)用于組裝工程的水凝膠孔隙需要控制在20～100 μm之間，而應(yīng)用于藥物遞送則需要更小的孔隙，以便小分子能在水凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)保持有效載荷[25-26]。

DNA構(gòu)建單元可進(jìn)行調(diào)整的主要原因有以下2點(diǎn):①水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)中以水為分散介質(zhì)，通過親水和疏水相互作用使得溶脹-收縮靈活;②作為水凝膠骨架或交聯(lián)劑的DNA鏈可通過擴(kuò)增過程調(diào)整產(chǎn)物的長短和濃度，使得網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的疏密程度不同，從而可用于包埋藥物及其體內(nèi)運(yùn)輸。

1.2 機(jī)械性能

DNA作為水凝膠構(gòu)建材料，除了具有序列可設(shè)計(jì)性、精確識別能力、高度相容性等特性，dsDNA的剛性結(jié)構(gòu)還賦予了DNA水凝膠較為優(yōu)異的機(jī)械性能。通過調(diào)節(jié)DNA濃度、膨脹率、粘度和交聯(lián)劑比例等組裝條件能夠獲得理想的水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和機(jī)械強(qiáng)度[18]。DNA水凝膠能夠應(yīng)用于細(xì)胞及體內(nèi)，與其機(jī)械性能密不可分，如模擬天然組織的彈性、基質(zhì)剛性都能決定小分子藥物在細(xì)胞內(nèi)的收縮、遷移和定殖[27]。在研究中，可通過酶促誘導(dǎo)使Y形DNA單體和接頭組裝形成DNA水凝膠，再通過改變Y形DNA單體和接頭的比例來精確調(diào)節(jié)水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度[28]。此外，溫度也被認(rèn)為是調(diào)節(jié)水凝膠機(jī)械性能的外在條件，如熱響應(yīng)的可切換水凝膠[29]。

DNA水凝膠的機(jī)械性能除了根據(jù)堿基序列和交聯(lián)結(jié)構(gòu)變化，在含水介質(zhì)中依賴于離子濃度和交聯(lián)劑的溶脹能力也能夠輔助包埋物釋放和適應(yīng)運(yùn)輸環(huán)境。Um等[13]在研究支鏈DNA單體組裝對DNA水凝膠理化性質(zhì)的影響時(shí)，利用X形、Y形和T形DNA單體(X-、Y-和T-DNA)作為構(gòu)建單元形成水凝膠，并分別在干燥條件和含水條件下測量了其外部和內(nèi)部性質(zhì)。結(jié)果顯示，溶脹的X-DNA水凝膠在所有DNA水凝膠中顯示出最強(qiáng)的拉伸模量和最低的拉伸強(qiáng)度，從而也反映出柔性X-DNA能強(qiáng)烈抵抗變形。結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)，交聯(lián)的DNA分子在給定應(yīng)力下更能抵抗恢復(fù)至原始形狀。同時(shí)，在設(shè)計(jì)熱和酶響應(yīng)型自組裝DNA水凝膠時(shí)，凝膠強(qiáng)度也隨著DNA濃度的增加而增強(qiáng)[28]。

1.3 特異性和靶向性

DNA水凝膠的特異性是指利用DNA可編程的堿基序列賦予其特定的遺傳信息或識別功能；靶向性則通過選擇不同的特異性DNA適配體作為靶向識別分子構(gòu)建DNA水凝膠，使DNA水凝膠成為靶向基因的遞送載體。在設(shè)計(jì)用于構(gòu)建DNA水凝膠的核酸序列時(shí)，可引入特異性的功能核酸序列，如具有優(yōu)異分子識別特性的核酸適配體、DNA核酶、G4、i-motif等[30]。通過功能核酸對外界環(huán)境(如pH、光、熱、磁和金屬離子等物理?xiàng)l件)的響應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)水凝膠在不同相態(tài)之間快速切換，這對于靶向控釋具有積極意義。Zhang等[10]將Y-DNA與凝血酶核酸適配體連接組裝成具有剛性空間的功能核酸DNA水凝膠，可用于包裹小型的金納米棒(Au nanorod，AuNR)。當(dāng)凝血酶存在時(shí)，適配體不再與DNA單體結(jié)合而導(dǎo)致DNA水凝膠分解，使帶負(fù)電的AuNR被釋放到溶液中與帶正電的量子點(diǎn)之間產(chǎn)生靜電相互作用，從而發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的淬滅現(xiàn)象以檢測血清系統(tǒng)中的凝血酶含量。此外，根據(jù)適配體的靶向作用，向大小可控的DNA水凝膠中直接添加對人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549有特異性的核酸適配體和治療基因，結(jié)果表明，該組裝系統(tǒng)不僅能夠特異性地靶向A549細(xì)胞，還能夠強(qiáng)烈抑制靶A549細(xì)胞的增殖和遷移[18]。

1.4 生物相容性和可降解性

生物相容性是生物材料應(yīng)用于生物體最關(guān)鍵的因素。對于純DNA水凝膠來說，其唯一組分是從天然生物中提取的DNA基因組，其降解產(chǎn)物核苷酸是人類所需的天然化合物，因此，純DNA水凝膠在體內(nèi)應(yīng)用對宿主無毒無害，且不引發(fā)任何刺激性炎癥反應(yīng)?；贒NA本身良好的生物相容性和可降解性，DNA水凝膠可用于組織工程中細(xì)胞的增殖和遷移或?yàn)檠芙櫶峁┛臻g；同時(shí)，DNA水凝膠具有良好的降解速率，從而可控制藥物隨時(shí)間緩慢釋放[31]。通常，水凝膠機(jī)械性質(zhì)與降解速率之間的平衡是保證DNA水凝膠在有效時(shí)間跨度內(nèi)發(fā)揮功能的重要因素，在這一方面，純DNA水凝膠要優(yōu)于雜化DNA水凝膠。Um等[13]在生理?xiàng)l件下使用分叉狀DNA單體經(jīng)酶促連接構(gòu)建的DNA水凝膠，可用于原位包封蛋白質(zhì)在內(nèi)的藥物，甚至可將活哺乳動(dòng)物細(xì)胞包封在液相中，從而消除了載藥步驟，也避免了變性的條件。同時(shí),可以通過微調(diào)DNA單體的濃度和結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)DNA水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度,以助力于藥物控釋。而Previtera和Langrana[32]開發(fā)了一種DNA與聚丙烯酰胺交聯(lián)形成的雜化DNA水凝膠，與純DNA水凝膠的柔軟性能不同，聚丙烯酰胺作為靜態(tài)底物，制備后在沒有刺激的情況下會(huì)增加凝膠硬度，從而導(dǎo)致彈性降低，增大了調(diào)節(jié)降解速率的難度。此外，DNA-聚丙烯酰胺水凝膠在體內(nèi)進(jìn)行藥物釋放時(shí)可能存在有毒物質(zhì)(如丙烯酰胺單體)殘留的隱患。

1.5 穩(wěn)定性

DNA水凝膠的穩(wěn)定性不僅依賴于DNA穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，還需要凝膠態(tài)的機(jī)械強(qiáng)度維持。dsDNA的穩(wěn)定性來源于G和胞嘧啶(C)的數(shù)值含量以及互補(bǔ)堿基間的氫鍵。dsDNA易在高溫下分解形成單鏈，導(dǎo)致水凝膠網(wǎng)絡(luò)的解體，但是隨著dsDNA的增長，破壞其所需的能量越大、解鏈溫度越高。因此，可以通過功能核酸形成特殊的、空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的DNA水凝膠，也可以通過核酸擴(kuò)增的方法獲得較長的ssDNA，降低DNA水凝膠解鏈的可能。此外，水凝膠材料通過疏水或親水作用交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有一定的穩(wěn)定性，因而能夠包裹大量的水，但同樣能在pH、溫度、光照、磁和離子濃度等外部刺激下發(fā)生溶膠-凝膠的相變。如通過加入酶或調(diào)節(jié)pH可使G4與i-motif結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的DNA鏈折疊，說明誘導(dǎo)因素能夠影響DNA水凝膠的穩(wěn)定性[33]。但也可以利用反平行G4結(jié)構(gòu)提供足夠的交聯(lián)力以形成致密的水凝膠，研究顯示G4-DNA水凝膠表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性，可在室溫下保護(hù)氯高鐵血紅素(hemin)不被降解[17]。Lu等[33]設(shè)計(jì)了一種pH調(diào)控的雙向功能核酸DNA水凝膠，即能夠在pH調(diào)控下可逆自組裝，并在水凝膠中引入熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)以監(jiān)測自組裝過程。在Lu等[33]的研究中，引入了2個(gè)質(zhì)子化胞嘧啶-鳥嘌呤-胞嘧啶(C-G·C+)和胸腺嘧啶-腺嘌呤-胸腺嘧啶(T-A·T)的三核酸，其中，質(zhì)子化的C-G·C+三核酸結(jié)構(gòu)在pH 5.0時(shí)形成水凝膠，在pH 7.0時(shí)分解；而基于T-A·T的三核酸結(jié)構(gòu)在pH 7.0時(shí)形成水凝膠，在pH 10.0時(shí)分解，從而實(shí)現(xiàn)凝膠與液態(tài)的可逆轉(zhuǎn)換。刺激響應(yīng)型DNA水凝膠利用外界因素實(shí)現(xiàn)了水凝膠形成和解離間的平衡，表明可以通過精確控制輔助增強(qiáng)DNA水凝膠的穩(wěn)定性。

2 DNA水凝膠的應(yīng)用

2.1 藥物遞送和靶向治療

DNA分子高度交聯(lián)形成的水凝膠作為重要的生物醫(yī)用材料備受關(guān)注。在藥物遞送時(shí)負(fù)載的藥物可以通過化學(xué)附著或物理包裹結(jié)合到功能核酸水凝膠網(wǎng)絡(luò)中，隨后通過對凝膠網(wǎng)絡(luò)施加刺激因素使其經(jīng)歷特定的物理、化學(xué)或生物變化，從而使負(fù)載的藥物被釋放。

2006年，Um等[13]通過T4 DNA連接酶將X-、Y-、T-DNA彼此雜交連接形成構(gòu)建單元，再經(jīng)自組裝制備成三維網(wǎng)狀DNA水凝膠。通過調(diào)節(jié)DNA單體的初始濃度和結(jié)構(gòu)可實(shí)現(xiàn)水凝膠的不同溶脹特性，結(jié)果顯示單體的初始濃度越高，其水凝膠的溶脹程度越高。X-DNA水凝膠的溶脹程度高于Y-DNA和T-DNA水凝膠。同時(shí)X-DNA水凝膠僅在生理?xiàng)l件下就能形成，便于包封小分子藥物、無機(jī)納米粒子并成功加載于活哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。通過在DNA水凝膠中封裝豬胰島素(porcine insulin)和喜樹堿(camptothecin，CPT)，驗(yàn)證了降解過程由DNA水凝膠內(nèi)部的結(jié)構(gòu)(如X-DNA比T-DNA和Y-DNA抵抗降解能力更強(qiáng))、負(fù)載藥物的性質(zhì)(如與DNA分子親和力高的藥物能保護(hù)DNA水凝膠在體內(nèi)不被降解)以及環(huán)境(如核酸酶存在時(shí)更易降解)等因素決定[13]。基于功能核酸DNA水凝膠的生物相容性、生物可降解性、制造成本低、易于成型等特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了其在藥物包埋與遞送中的應(yīng)用。

為了在上述研究的基礎(chǔ)上改進(jìn)藥物包封的速度，實(shí)現(xiàn)快速包封和藥物釋放，可以借助i-motif結(jié)構(gòu)對酸度敏感的特征進(jìn)行快速折疊與解折疊。如Cheng等[34]通過Y-DNA交聯(lián)獲得了pH快速響應(yīng)型DNA水凝膠，同時(shí)，使用13 nm的AuNR作為“示蹤劑”。在微酸性環(huán)境下，富C序列由于氫鍵作用形成i-motif四聯(lián)體結(jié)構(gòu),并快速連接Y-DNA交聯(lián)成膠，使得AuNR被捕獲在DNA水凝膠內(nèi)；而在微堿性環(huán)境下，由于靜電斥力隔離Y-DNA單體使得AuNR在1 min內(nèi)迅速釋放并分散到整個(gè)溶液中。然而，該方法雖然能實(shí)現(xiàn)快速響應(yīng)，但在生理?xiàng)l件下不穩(wěn)定，因而限制了其在體內(nèi)的應(yīng)用。

為了解決不穩(wěn)定因素，2017年，Zhang等[35]將具有光穩(wěn)定性、高量子產(chǎn)率和光譜可調(diào)性的量子點(diǎn)(quantum dots，QDs)作為“熒光標(biāo)記”摻入DNA水凝膠中，在生理?xiàng)l件下快速形成量子點(diǎn)DNA水凝膠，實(shí)現(xiàn)酶應(yīng)答藥物遞送和特異性細(xì)胞靶向。該水凝膠在體外pH 5.0～9.0環(huán)境內(nèi)能夠保持穩(wěn)定。一旦進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后接觸核酸酶，由DNA組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)會(huì)被降解。此時(shí)，水凝膠轉(zhuǎn)化為溶膠狀態(tài)并開始釋放包埋藥物。鑒于此，研究人員將QDs-DNA水凝膠用來遞送藥物多柔比星(doxorubicin，DXR)到癌細(xì)胞，相對于無QDs，DXR對抗癌細(xì)胞的功效提高了9倍。同時(shí)，在QDs上引入了適配體靶向特定CCL-119白血病細(xì)胞，并通過小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)的傳遞來調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平，隨后還在患有異種移植乳腺癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明了水凝膠的可追蹤性和體內(nèi)治療功效。

此外，依靠設(shè)計(jì)特殊序列也能使藥物達(dá)到良好的靶向效應(yīng)。2017年，Wang等[6]構(gòu)建了裝載有DXR且具有特定胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(cytosine-phosphate-guanine，CpG)序列的X-DNA水凝膠。CpG序列賦予了DNA水凝膠免疫活性，在血清中核酸酶緩慢降解DNA水凝膠時(shí)，DXR和CpG免疫刺激信號也被緩慢釋放。同時(shí)，在患有結(jié)腸癌的小鼠體內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果反映出良好的腫瘤抑制現(xiàn)象，也證明了DXR能有效殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)增強(qiáng)CpG-DNA水凝膠的免疫活性。

2.2 生物傳感

應(yīng)用于生物傳感的DNA水凝膠是監(jiān)測生物醫(yī)學(xué)和生物化學(xué)變化的一種具有便攜性、高靈敏度和高選擇性等優(yōu)勢的新型納米材料。功能核酸DNA水凝膠可響應(yīng)特定環(huán)境因素的刺激，從而特異性識別靶物質(zhì)并將自身轉(zhuǎn)變?yōu)樾盘栠M(jìn)行檢測。將DNA水凝膠引入生物傳感，不僅能將傳統(tǒng)的液相反應(yīng)體系轉(zhuǎn)入3D網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，從而提高分析物的負(fù)載能力，還可以將分析物轉(zhuǎn)換為易于處理的傳感信號以便檢測[6,36]。通常檢測物質(zhì)包括離子、活細(xì)胞、蛋白質(zhì)、病毒或細(xì)菌等[26]。

基于功能核酸DNA水凝膠的生物傳感器通過對體內(nèi)靶標(biāo)的高度親和力來檢測生物分子。Zhang等[10]使用AuNR和QDs作為指示劑包封在水凝膠中，設(shè)計(jì)了Y-DNA和適配體接頭，二者粘性末端彼此互補(bǔ)，可相互交聯(lián)形成功能核酸DNA水凝膠。在沒有靶物質(zhì)的情況下，可觀察到上層溶液無色而下層含AuNR的凝膠呈紅色。加入凝血酶后，它將與接頭適配體競爭性結(jié)合，導(dǎo)致DNA水凝膠的崩解，這時(shí)AuNR從凝膠中釋放到上層溶液用于可視化檢測凝血酶，靶標(biāo)在0.075～12.500 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為67 nmol/L。此方法在復(fù)雜血清中具有良好的可行性，并為蛋白質(zhì)的檢測提供了基本概念。

除了可對體內(nèi)活性物質(zhì)進(jìn)行快速檢測，基于DNA水凝膠高含水量的優(yōu)點(diǎn)，其還能在體外溶液中建立生物分析的表面?zhèn)鞲衅鳌ao等[11]在液-固界面上設(shè)計(jì)制造了穩(wěn)定的DNA水凝膠3D支架，然后將其固定在固體透明氧化銦錫(indium-tin oxide，ITO)電極表面。在3D水凝膠材料的表面張力和重力作用下，通過長DNA鏈交聯(lián)包裹辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)而非傳統(tǒng)的化學(xué)鍵或生物親和力固定，保持了蛋白酶本身的獨(dú)立性，有利于酶的回收，還提供了用于電化學(xué)或比色分析的3D催化系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，包裹有HRP的水凝膠具有良好的穩(wěn)定性和負(fù)載能力。由于分子篩效應(yīng)，DNA水凝膠在傳感過程中將酶與水凝膠外的大分子干擾物分離，阻止其向外部擴(kuò)散，可用于血清中過氧化氫和膽紅素的直接比色和電化學(xué)檢測。通過比色分析血清中的過氧化氫，檢出限為22 nmol/L，電化學(xué)測量的檢出限為13 nmol/L；通過水凝膠中包裹膽紅素氧化酶進(jìn)行光譜分析，膽紅素的檢出限為32 nmol/L，可用于黃疸的極限診斷。當(dāng)測定結(jié)束時(shí)，將ITO電極與表面固定的HRP@DNA水凝膠一起洗滌并在空氣中干燥。將其再次放入緩沖溶液后功能可迅速恢復(fù)，由此實(shí)現(xiàn)基于功能核酸DNA水凝膠的生物傳感系統(tǒng)的再循環(huán)[11]。

2.3 生物材料

長期以來，由于很難滿足人工組織或器官結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、精密度、細(xì)胞活力和可擴(kuò)展的構(gòu)建要求，制備三維組織結(jié)構(gòu)一直是組織工程上的挑戰(zhàn)[37]。Wang等[38]采取了一種新的“由磚到墻”策略，將靶細(xì)胞包封在由Y-DNA和接頭組裝的功能核酸DNA水凝膠中，首先通過人工操作或3D生物打印的方法產(chǎn)生微米精度的細(xì)胞磚，再將靶細(xì)胞接種于細(xì)胞磚中培養(yǎng)48 h以觀察細(xì)胞的生物活性。為了防止最終靶細(xì)胞失去活性導(dǎo)致后續(xù)組織工程失敗，在組裝結(jié)構(gòu)之前通過顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)并及時(shí)清除受損的細(xì)胞磚。隨后基于堿基互補(bǔ)配對原則賦予水凝膠特殊的“自我修復(fù)”特性，將包封細(xì)胞的水凝膠磚放在一起，相鄰的磚能在幾秒鐘內(nèi)開始融合，邊界在數(shù)分鐘內(nèi)消失，從而實(shí)現(xiàn)了3D組織結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)組裝。基于DNA水凝膠出色的生物相容性和可調(diào)節(jié)的機(jī)械性能，其能提供與細(xì)胞外基質(zhì)相當(dāng)?shù)臐B透環(huán)境以保證3D組織結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞活力。Wang等[38]在實(shí)驗(yàn)中將“磚”堆疊在一起形成三維宏觀結(jié)構(gòu)后，通過Transwell細(xì)胞行為實(shí)驗(yàn)評估了由水凝膠中的信號觸發(fā)的細(xì)胞行為，驗(yàn)證了這種“由磚到墻”的策略可以輕松避免制造過程中構(gòu)建單元的損壞，并且能夠與自動(dòng)制造過程兼容，適用于構(gòu)建復(fù)雜的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，還可用于大規(guī)模生產(chǎn)人造組織。

2.4 其他領(lǐng)域

功能核酸DNA水凝膠除了在藥物遞送和靶向治療、生物傳感以及生物材料的構(gòu)建等方面應(yīng)用較多，在其他方面也具有應(yīng)用價(jià)值，如蛋白質(zhì)的生產(chǎn)、水處理和環(huán)境分析等多元化應(yīng)用，為DNA水凝膠的發(fā)展開辟了新的方向[6,38]。

DNA可作為模板儲(chǔ)存遺傳信息，通過轉(zhuǎn)錄合成信使RNA(messenger RNA，mRNA)，而以mRNA為模板可以翻譯成蛋白質(zhì)。根據(jù)分子生物學(xué)中心法則，使X-DNA與線性質(zhì)粒依靠T4 DNA連接酶的作用共價(jià)交聯(lián)形成無細(xì)胞產(chǎn)蛋白質(zhì)DNA水凝膠(cell-free protein-producing hydrogel)，簡稱P-凝膠[13]。P-凝膠能響應(yīng)葡萄糖、酶、抗原、核酸、三磷酸腺苷等多種物質(zhì)的刺激[39]。在裂解物或聚合酶的刺激下，P-凝膠可立即接受刺激開始轉(zhuǎn)錄，最終能產(chǎn)生16種蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，P-凝膠表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)率高達(dá)5 mg/mL，高出傳統(tǒng)的液相體系約300倍[40-41]。目前，P-凝膠已成功應(yīng)用于大腸桿菌、小麥胚芽和由兔網(wǎng)織紅細(xì)胞制得的裂解液等幾種不同無細(xì)胞系統(tǒng)[39-42]。

DNA水凝膠在微觀上為親水聚合物網(wǎng)絡(luò)，具有多孔微結(jié)構(gòu)和大表面積，從而具有強(qiáng)大的富集能力以捕獲或維持目標(biāo)穩(wěn)定性，因此可定位為凈化微污染水層的多功能平臺(tái)和特異性識別痕量污染物的有效材料。微污染水層指含有少量污染物的各種水源，如輕污染飲用水、雨、雪和地下水。與常用的碳基材料、粘土礦物和金屬材料等廢水處理材料相比，純DNA水凝膠的高安全性更適合于微污染水層的處理。Wang等[43]利用了純DNA水凝膠的酶響應(yīng)性，將Y-DNA和含有限制性酶切位點(diǎn)的接頭通過堿基互補(bǔ)配對在3 min內(nèi)形成水凝膠。與疏水性高分子有機(jī)硅聚二甲基硅氧烷膜相比，DNA水凝膠具有很強(qiáng)的滲透性和細(xì)胞安全性，同時(shí)，在對生物分子的包封和固定上，水凝膠微孔中單細(xì)胞的包封和釋放可以在很大程度上解決污水處理中污泥堵塞、污水再生等問題。目前，DNA水凝膠在水處理上已被用作吸附劑、催化劑、封裝載體和傳感器，實(shí)現(xiàn)了直接或間接處理、分析低濃度污染物，尤其是重金屬和持久性有機(jī)污染物[44-46]。

3 展望

目前，DNA的研究與應(yīng)用已經(jīng)不再局限于其在遺傳學(xué)中的作用。功能核酸DNA水凝膠作為一種新型的納米功能材料已在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有所建樹，目前多用于電化學(xué)生物傳感器、比色生物傳感器等少數(shù)幾種生物傳感器的開發(fā)中，而在分子檢測中與多種生物傳感器的搭建、生物成像技術(shù)的研發(fā)以及組織工程中仿生材料的構(gòu)建等方面尚未得到廣泛的發(fā)展與應(yīng)用。因此，如何利用其凝膠態(tài)的優(yōu)勢拓展功能核酸水凝膠的應(yīng)用范圍，實(shí)現(xiàn)甚至超越在液相或固相體系中的研究成果，將是功能核酸水凝膠在未來亟待突破的難點(diǎn)之一。

如今，僅以核酸作為原料形成的水凝膠功能性質(zhì)單一、機(jī)械性能較低，已無法滿足日漸拓寬的應(yīng)用需求，因此已開展復(fù)合型功能核酸水凝膠的研發(fā)，這將是功能核酸水凝膠發(fā)展的重要方向之一。復(fù)合型功能核酸水凝膠的開發(fā)主要從2個(gè)方面實(shí)現(xiàn)。一方面，在制備時(shí)引入其他聚合物作為骨架，不僅能降低核酸的使用量，緩解核酸原料的合成成本，而且還賦予了水凝膠聚合物的性質(zhì)，從而極大地增強(qiáng)了水凝膠的機(jī)械性能與交聯(lián)度，提高了成膠速率，甚至為其增添了多重可控性。除目前使用最多的聚丙烯酰胺外，聚乙烯亞胺、聚乙二醇以及具有熱敏性質(zhì)的聚異丙基丙烯酰胺等高分子聚合物都已被開發(fā)用于復(fù)合型核酸水凝膠的制備。以后可更多地拓展天然聚合物及無毒無害的合成聚合物的使用，如殼聚糖、多聚賴氨酸以及羧甲基纖維素等，降低復(fù)合型水凝膠材料的毒性，便于開發(fā)水凝膠在細(xì)胞及體內(nèi)中的應(yīng)用。另一方面，新型材料的引入對開發(fā)復(fù)合型功能核酸水凝膠具有前瞻性意義，不但有助于提高功能核酸DNA水凝膠的理化性質(zhì)，而且顯著拓展其功能性。如金納米顆粒能夠賦予水凝膠額外的熱穩(wěn)定性；氧化石墨烯的摻入使水凝膠具有高機(jī)械強(qiáng)度、高吸附能力和抵抗體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的能力；摻入磁納米顆粒、量子點(diǎn)等納米材料為水凝膠提供更多刺激響應(yīng)因素，有助于開發(fā)多響應(yīng)、多功能的核酸水凝膠材料[10,47～50]。

最后，功能核酸水凝膠的大小及形貌與其在藥物裝載及遞送等相關(guān)應(yīng)用中有著密切的聯(lián)系。在將包封藥物的核酸水凝膠靶向進(jìn)入細(xì)胞前，通常細(xì)胞的直徑介于20～100 μm之間，應(yīng)確保其尺寸能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。另外，水凝膠微觀形貌也對其中藥物的裝載率、包封效果及釋放速率具有顯著影響。然而，如基于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的水凝膠具有的DNA納米花結(jié)構(gòu)[17]，其花瓣致密度、球形納米花的疏密程度等均尚未實(shí)現(xiàn)精確調(diào)控。因此，功能核酸的結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)應(yīng)為水凝膠在宏觀與微觀結(jié)構(gòu)中的尺寸及形貌提供更多的刺激響應(yīng)因素及可調(diào)控機(jī)制，從而有利于提高功能核酸水凝膠作為藥物或生物活性分子的載體在細(xì)胞及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的成功率。