基于氣相色譜技術(shù)分析灘羊肉風(fēng)味物質(zhì)的研究
——飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用

馬小明12

1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 甘肅蘭州 730070 2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所 寧夏銀川 750002

灘羊是寧夏自治區(qū)發(fā)展羊產(chǎn)業(yè)的主要羊品種之一，也是寧夏農(nóng)業(yè)戰(zhàn)略主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)和優(yōu)質(zhì)牛羊肉產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的重要品種資源。寧夏回族自治區(qū)灘羊這一品種優(yōu)勢(shì)明顯，品牌美譽(yù)度較高，具有形成地緣優(yōu)勢(shì)農(nóng)產(chǎn)品的基礎(chǔ)條件，產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)潛力較大。灘羊以寧夏自治區(qū)為中心產(chǎn)區(qū)，具有鮮明的地域分布特色，近年來在自治區(qū)農(nóng)業(yè)特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)政策扶持下，灘羊產(chǎn)業(yè)提質(zhì)擴(kuò)量成效顯著，“鹽池灘羊”及“鹽池灘羊肉”商標(biāo)品牌價(jià)值凸顯，灘羊胴體精細(xì)化分割加工工藝及產(chǎn)品日趨成熟，以灘羊?yàn)橹匾е膬?yōu)質(zhì)牛羊肉產(chǎn)業(yè)已成為寧夏回族自治區(qū)農(nóng)業(yè)戰(zhàn)略主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。不斷發(fā)掘?yàn)┭蚣盀┭蛉獾膬?yōu)勢(shì)，做精、做強(qiáng)寧夏羊產(chǎn)業(yè)，對(duì)增加農(nóng)民收入、助力精準(zhǔn)扶貧工作也具有十分重要的意義。

灘羊公羊肉質(zhì)較膻，導(dǎo)致大多數(shù)人不喜食用。針對(duì)灘羊、羯羊肉香味美等特點(diǎn)，開展相關(guān)研究，以期探究灘羊公羊與羯羊差異代謝物的種類和物質(zhì)，助力灘羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇鹽池縣農(nóng)戶飼養(yǎng)的成年灘羊羯羊、公羊各3只，共6只組織樣本。并于早晨空腹屠宰后采集背最長(zhǎng)肌100g，切成肉丁,分別裝入玻璃瓶中密封并貼標(biāo),然后冷凍保存,待測(cè)。

1.2 試驗(yàn)方法

將樣本低溫研碎，稱取樣本2.5g于20mL頂空瓶中，再加入1μL 2-辛醇為內(nèi)標(biāo)；隨機(jī)順序GC-MS檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

2-辛醇(2-Octanol)，6169-06-8，≥99.5%，TCI。

1.4 試驗(yàn)儀器

氣相色譜，型號(hào) 7890A,Agilent；

質(zhì)譜儀,型號(hào)5975C,Agilent；

色譜柱，型號(hào)DB-Wax(30m×250μm×0.25μm)，Agilent。

1.5 上機(jī)檢測(cè)

Agilent 7890氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配有Agilent DB-Wax毛細(xì)管柱(30m×250μm×0.25μm,J&W Scientific,Folsom,CA,USA)，GC-MS具體分析條件如下。

萃取溫度(Incubate Temperature)，65℃；

預(yù)熱時(shí)間(Preheat Time)，20min；

萃取時(shí)間(Incubate Time)，40min；

解析時(shí)間(Desorption time)，4min；

分流模式(Front Inlet Mode)，Splitless Mode；

隔墊吹掃流速(Front Inlet Septum Purge Flow)，3mL/min；

載氣(Carrier Gas)，Helium；

色譜柱(Column)，DB-Wax(30m×250μm×0.25μm)；

柱流速(Column Flow)，1mL/min；

柱箱升溫程序(Oven Temperature Ramp)，40℃ hold on 5min, raised to 250℃ at a rate of 5℃/min, hold on 5min；

前進(jìn)樣口溫度(Front Injection Temperature)，260℃；

傳輸線溫度(Transfer Line Temperature)，260℃；

離子源溫度(Ion Source Temperature)，230℃；

四級(jí)桿溫度(Quad Temperature)，150℃；

電離電壓(Electron Energy)，-70eV；

質(zhì)量范圍(Mass Range)，m/z 20～500；

掃描模式(Scan Mode)，Scan；

溶劑延遲(Solvent Delay)，0min。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Chroma TOF軟件(V4.3x，LECO)和NIST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對(duì)齊、質(zhì)譜匹配等分析[2]。

2 試驗(yàn)結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)中共檢出了108個(gè)峰，詳見圖1。

3 數(shù)據(jù)分析

3.1 原始數(shù)據(jù)預(yù)處理

原始數(shù)據(jù)包含0個(gè)質(zhì)控(quality control,QC)樣本和6個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本，從中提取108個(gè)Peak，為了更好地分析數(shù)據(jù)，我們對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列的準(zhǔn)備和整理(data management)。主要包括以下步驟：對(duì)單個(gè)Peak進(jìn)行過濾以便能去除噪音。基于四分位數(shù)距(interquartile range)對(duì)偏離值進(jìn)行過濾。對(duì)單個(gè)Peak進(jìn)行過濾。只保留單組空值不多于50%或所有組中空值不多于50%的峰面積數(shù)據(jù)。對(duì)原始數(shù)據(jù)中的缺失值進(jìn)行模擬(missing value recoding)。數(shù)值模擬方法為最小值二分之一法進(jìn)行填補(bǔ)。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理(normalization)。利用內(nèi)標(biāo)(internal standard,IS)進(jìn)行歸一化。經(jīng)過預(yù)處理后107個(gè)Peak被保留。

3.2 主成分分析(PCA)

在獲得整理好的數(shù)據(jù)之后，我們對(duì)其進(jìn)行一系列的多元變量模式識(shí)別分析，首先是主成分分析。主成分分析(principalcomponent analysis, PCA)是將一組觀測(cè)的可能相關(guān)變量，通過正交變換轉(zhuǎn)換為線性不相關(guān)變量(即主成分)的統(tǒng)計(jì)方法。

PCA可以揭示數(shù)據(jù)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而更好的解釋數(shù)據(jù)變量。代謝組數(shù)據(jù)可以被認(rèn)為是一個(gè)多元數(shù)據(jù)集，能夠在一個(gè)高維數(shù)據(jù)空間坐標(biāo)系中被顯現(xiàn)出來，那么PCA就能夠提供一幅比較低維度的圖像(二維或三維)，展示即為在包含信息最多的點(diǎn)上對(duì)原對(duì)象的“投影”，有效地利用少量的主成分使得數(shù)據(jù)的維度降低[2～7]。

使用SIMCA軟件(V14.1,Sartorius Stedim Data Analytics AB, Umea,Sweden)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)(LOG)轉(zhuǎn)換加中心化(CTR)格式化處理，然后進(jìn)行自動(dòng)建模分析。PCA模型的相關(guān)參數(shù)見表1“PCA模型參數(shù)表”。

表1 PCA模型參數(shù)表

表1內(nèi)各列內(nèi)容解釋如下。

Model：SIMCA軟件建模的模型編號(hào)，該編號(hào)會(huì)對(duì)應(yīng)到結(jié)果文件。

Type：SIMCA的模型類型，PCA-X表示對(duì)樣本建立PCA模型。

A：模型的主成分個(gè)數(shù)。

N：模型的觀測(cè)個(gè)數(shù)(此處即為樣本數(shù))。

R X(cum)：代表模型對(duì)X變量的解釋性。

Title：該模型對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)對(duì)象。

全部樣本的PCA得分散點(diǎn)圖(score scatter plot)如圖2所示。

圖2中橫坐標(biāo)PC[1]和縱坐標(biāo)PC[2]分別表示排名第一和第二的主成分的得分，散點(diǎn)顏色和形狀表示樣本的實(shí)驗(yàn)分組。樣本全部處于95%置信區(qū)間(Hotelling’s T-squared ellipse)內(nèi)。樣本間的對(duì)比分析以Class2組對(duì)Class1組為例：Class2組對(duì)Class1組的PCA得分散點(diǎn)圖如圖3所示。

從PCA得分圖3的結(jié)果可以看出，樣本全部處于95%置信區(qū)間(Hotelling’s T-squared ellipse)內(nèi)。

交叉驗(yàn)證后得到的R Y(模型對(duì)分類變量Y的可解釋性)和Q(模型的可預(yù)測(cè)性)對(duì)模型有效性進(jìn)行評(píng)判；最后通過置換檢驗(yàn)(permutation test)，隨機(jī)多次改變分類變量Y的排列順序得到不同的隨機(jī)Q 值，對(duì)模型有效性做進(jìn)一步的檢驗(yàn)。各組對(duì)比OPLS-DA模型的模型累積解釋率見“OPLS-DA模型參數(shù)表”。

3.3 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)

基于GC-MS的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)具有高維(檢測(cè)出代謝物種類多)，小樣本(檢測(cè)樣本量偏少)的特性，在這些變量中既包含與分類變量相關(guān)的差異變量，也包含大量互相之間可能存在關(guān)聯(lián)的無(wú)差異變量。這導(dǎo)致如果我們使用PCA模型或PLS模型進(jìn)行分析，由于相關(guān)變量的影響，差異變量會(huì)分散到更多的主成分上，無(wú)法進(jìn)行更好的可視化和后續(xù)分析[8]。所以我們采用正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis, OPLS-DA)的統(tǒng)計(jì)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。通過OPLS-DA分析，我們可以過濾掉代謝物中，與分類變量不相關(guān)的正交變量，并對(duì)非正交變量和正交變量分別分析，從而獲取更加可靠的代謝物的組間差異與實(shí)驗(yàn)組的相關(guān)程度信息。使用SIMCA軟件(V14.1,Sartorius Stedim Data Analytics AB, Umea,Sweden對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)(LOG)轉(zhuǎn)換加UV格式化處理，首先對(duì)第一主成分進(jìn)行OPLS-DA建模分析，模型的質(zhì)量用7折交叉驗(yàn)證(7-fold cross validation)進(jìn)行檢驗(yàn)；然后用交叉驗(yàn)證后得到的R Y(模型對(duì)分類變量Y的可解釋性)和Q(模型的可預(yù)測(cè)性)對(duì)模型有效性進(jìn)行評(píng)判；最后通過置換檢驗(yàn)(permutation test)，隨機(jī)多次改變分類變量Y的排列順序得到不同的隨機(jī)Q值，對(duì)模型有效性做進(jìn)一步的檢驗(yàn)。各組對(duì)比OPLS-DA模型的模型累積解釋率見表2“OPLS-DA模型參數(shù)表”。

表2 OPLS-DA模型參數(shù)表

Model：SIMCA軟件建模的模型編號(hào)，該編號(hào)會(huì)對(duì)應(yīng)到結(jié)果文件。

Type：SIMCA的模型類型，OPLS-DA表示建立OPLS-DA模型。

A：模型的主成分個(gè)數(shù)。

N：模型的觀測(cè)個(gè)數(shù)(此處即為樣本數(shù))。

R X(cum)：代表模型對(duì)X變量的解釋性。

R Y(cum)：代表模型對(duì)Y變量的解釋性。

Q (cum)：模型的可預(yù)測(cè)性。

Title：該模型對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)對(duì)象。

樣本間的對(duì)比分析以Class2組對(duì)Class1組為例，對(duì)OPLS-DA結(jié)果進(jìn)行解釋。

3.3.1 OPLS-DA得分散點(diǎn)圖

Class2組對(duì)Class1組的OPLS-DA模型得分散點(diǎn)圖如圖4所示。

圖中橫坐標(biāo)t[1]P表示第一主成分的預(yù)測(cè)主成分得分，縱坐標(biāo)t[1]O表示正交主成分得分，散點(diǎn)形狀和顏色表示不同的實(shí)驗(yàn)分組。從OPLS-DA得分圖的結(jié)果可以看出，兩組樣本區(qū)分非常顯著，樣本全部處于95%置信區(qū)間(Hotelling’s T-squaredellipse)內(nèi)。

3.3.2 OPLS-DA置換檢驗(yàn)

置換檢驗(yàn)通過隨機(jī)改變分類變量Y的排列順序，多次(次數(shù)n=200)建立對(duì)應(yīng)的OPLS-DA模型以獲取隨機(jī)模型的R Y和Q值，在避免檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪^擬合以及評(píng)估模型的統(tǒng)計(jì)顯著性上有重要作用[9]。Class2組對(duì)Class1組OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5中橫坐標(biāo)表示置換檢驗(yàn)的置換保留度(與原模型Y變量順序一致的比例，置換保留度等于1處的點(diǎn)即為原模型的R Y和Q值)，縱坐標(biāo)表示R Y或Q的取值，綠色圓點(diǎn)表示置換檢驗(yàn)得到的R Y值，藍(lán)色方點(diǎn)表示置換檢驗(yàn)得到的Q值，兩條虛線分別表示R Y和Q的回歸線。原模型R Y非常接近1，說明建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實(shí)情況；原模型Q比較接近1，說明如果有新樣本加入模型，會(huì)得到比較近似的分布情況，總的來說原模型可以比較好地解釋兩組樣本之間的差異。同時(shí)隨著置換保留度逐漸降低，置換的Y變量比例增大，隨機(jī)模型的Q逐漸下降。說明原模型具有良好的穩(wěn)健性，不存在過擬合現(xiàn)象。

3.4 單變量統(tǒng)計(jì)分析(UVA)，差異代謝物的篩選和火山圖

基于GC-MS的代謝組數(shù)據(jù)的固有特性要求我們使用多元變量統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。相比與傳統(tǒng)的單變量統(tǒng)計(jì)分析方法(univariate analysis, UVA)如學(xué)生氏t檢驗(yàn)、方差分析(analysis of variance, ANOVA)等更加注重代謝物水平的獨(dú)立變化，多元變量統(tǒng)計(jì)分析更加注重代謝物之間的關(guān)系以及它們?cè)谏镞^程中的促進(jìn)/拮抗關(guān)系。同時(shí)考量?jī)深惤y(tǒng)計(jì)分析方法的結(jié)果，有助于我們從不同角度觀察數(shù)據(jù)，得出結(jié)論，也可以幫助我們避免只使用一類統(tǒng)計(jì)分析方法帶來的假陽(yáng)性錯(cuò)誤或模型過擬合[10]。本研究使用的卡值標(biāo)準(zhǔn)為學(xué)生t檢驗(yàn)(Student’s t-test)的P值(P-value)小于0.05，同時(shí)OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(Variable Importance in the Projection, VIP)大于1。差異代謝物篩選的結(jié)果以Class2組對(duì)Class1組為例進(jìn)行說明，差異代謝物篩選結(jié)果示例如下表3。

表3 差異代謝物篩選表(前7行,digits=2)

差異代謝物篩選表的主要內(nèi)容包括下列內(nèi)容。Id，代謝物在本數(shù)據(jù)庫(kù)中的序號(hào)；Peak，物質(zhì)在Fiehn數(shù)據(jù)庫(kù)中的名稱；Similarity，該物質(zhì)與質(zhì)譜檢測(cè)峰的匹配度打分；VIP，來自O(shè)PLS-DA模型的VIP值；P-VALUE，來自t-test的P值；FOLD-CHANGE，兩組實(shí)驗(yàn)物質(zhì)定量的比值；LOG-FOLDCHANGE，F(xiàn)OLD CHANGE取以2為底的對(duì)數(shù)。表中Similarity打分的取值范圍為[0,1 000]，分?jǐn)?shù)越高匹配度越好，依據(jù)Similarity及其他信息，我們將一些物質(zhì)進(jìn)行刪減和合并，并以analyte和unknown代替。我們將篩選差異代謝物的結(jié)果以火山圖(volcano plot)的形式進(jìn)行可視化，Class2組對(duì)Class1組的結(jié)果如圖6所示。

火山圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)代謝物，橫坐標(biāo)代表該組對(duì)比各物質(zhì)的倍數(shù)變化(取以2為底的對(duì)數(shù))，縱坐標(biāo)表示學(xué)生t檢驗(yàn)的P-value(取以10為底對(duì)數(shù)的負(fù)數(shù))，散點(diǎn)大小代表OPLS-DA模型的VIP值，散點(diǎn)越大VIP值越大。散點(diǎn)顏色代表最終的篩選結(jié)果，顯著上調(diào)的代謝物以紅色表示，顯著下調(diào)的代謝物以藍(lán)色表示，非顯著差異的代謝物為灰色。

4 討論

本次實(shí)驗(yàn)中共檢出108個(gè)峰，經(jīng)過我們對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列的處理后，107個(gè)峰值被保留，經(jīng)兩組樣品對(duì)比分析，我們共得到顯著上調(diào)的代謝物12種，顯著下調(diào)的代謝物2種，主要的差異代謝物有：丙酮、辛烷、2,3,4三甲基己烷、戊酸-5羥基-2,雙丁基苯基酯、鄰苯二甲酸環(huán)丁基葵旨、2,2,4,6,6-五甲基庚烷。

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的快速發(fā)展，居民生活水平顯著提高，食品消費(fèi)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)整，使得畜產(chǎn)品越來越受到消費(fèi)者的青睞，特別是以低膽固醇、高蛋白含量為代表的羊肉產(chǎn)品需求不斷加大，羊肉、羊肉卷等特色產(chǎn)品早已成為人們餐桌上的美食，特別是北方人，吃火鍋的時(shí)候少不了來一盤羊肉(卷)，這也為我國(guó)肉羊等草食性畜牧產(chǎn)業(yè)的繁榮發(fā)展提供了強(qiáng)勁的外源動(dòng)力，也促使肉羊產(chǎn)業(yè)成為畜牧產(chǎn)業(yè)中迅速發(fā)展的新興產(chǎn)業(yè)。羊肉不僅是部分民族地區(qū)居民的重要肉類食品，其在改善我國(guó)城鄉(xiāng)居民膳食結(jié)構(gòu)、提高國(guó)人身體素質(zhì)、優(yōu)化生活品質(zhì)等諸多方面發(fā)揮作用。羊肉除了作為居民的重要肉類食物以外，在西北，其所帶動(dòng)的養(yǎng)羊業(yè)同樣肩負(fù)著帶動(dòng)縣域經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，增加農(nóng)牧民收入，脫貧攻堅(jiān)的重要抓手。

膻味物質(zhì)一直是影響人們是否喜食羊肉的主要原因之一，膻味絕大多數(shù)情況下是指來自綿羊或山羊肉所散發(fā)出的使人不愉快的異味。羊肉風(fēng)味中較難接受的味道分別為“mutton flavor”和“pastoral”2種風(fēng)味。Watkins等研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生“mutton flavor”風(fēng)味的物質(zhì)目前比較確定的為支鏈脂肪酸，主要為4-甲基辛酸(4-methyl octylic acid，MOA)、4-乙基辛酸(4-ethyl octylic acid，EOA)和4-甲基壬酸(4-methyl nonyl acid，MNA)，3種支鏈脂肪酸產(chǎn)生“mutton flavor”的閾值分別為20、6、650μg/kg；而產(chǎn)生“pastoral”風(fēng)味的物質(zhì)主要為3-甲基吲哚(3-methylindole，MI)和4-甲基苯酚(4-methyl phenol，MP)，MI和MP產(chǎn)生“pastoral”風(fēng)味的閾值分別為50.0、0.2 μg/kg[11]。而本研究并未檢測(cè)出這幾種物質(zhì)，據(jù)報(bào)道，羊肉膻味的幾類物質(zhì)主要存在與羊肉的脂肪組織中，脂肪組織是最明顯的風(fēng)味物質(zhì)的來源，特別是其中的4-辛烷和4-甲基九烷。某些脂溶性物質(zhì)在風(fēng)味和膻味形成中發(fā)揮著重要作用，但在肌肉中這類含量相對(duì)較少[12～18]。因此，本研究正好也印證了相關(guān)研究結(jié)果。

羊肉具有高蛋白、低脂肪和低膽固醇等特點(diǎn)，是中國(guó)傳統(tǒng)的肉類食品，鹽池灘羊肉，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、膻味輕、味美，受到廣大消費(fèi)者的喜愛，氣譜-質(zhì)譜方法已普遍應(yīng)用到了羊肉風(fēng)味物質(zhì)的研究中[19～21]，雖然影響羊肉風(fēng)味的因素是多樣的，但對(duì)于闡明其主要的代謝物質(zhì)對(duì)進(jìn)一步提高和改善灘羊肉品質(zhì)具有一定的意義，因此，因進(jìn)一步開展相關(guān)研究，助推灘羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展。