哮喘患者IL-4基因單核苷酸多態(tài)性的病例對照研究

史喜玉 孫金霞 馬桂芳 楊李 潘夢丹

摘 ?要：目的 ?分析過敏性哮喘（簡稱哮喘）患者IL-4的表達及IL-4基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）與哮喘遺傳易感性的關系。方法 ?應用ELISA法檢測67例過敏性哮喘患者和85例對照組的血清中IL-4的表達情況，采用測序的方法檢測兩組中IL-4基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）rs2227284、rs2070874、rs4986964、rs2243250位點的基因分型情況，并進行統(tǒng)計學分析。結果 ?實驗組患者血清IL-4的表達增高，P<0.05;4個SNP各基因型在實驗組和對照組中沒有明顯差異，P>0.05。結論 ?患者血清中IL-4的表達增高，rs2227284、rs2070874、rs4986964、rs2243250多態(tài)性與IL-4的表達增高沒有明顯關聯(lián)。

關鍵詞：哮喘 ?IL-4 ?ELISA ?SNP ?測序

中圖分類號：R562.25 ? 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2019）10（c）-0218-03

過敏性哮喘是一種嚴重的過敏性疾病，是最常見慢性病之一。它的特點是氣管支氣管對多重刺激的反應性增加，各種炎癥細胞特別是嗜酸性粒細胞浸潤增加，氣道上皮細胞損傷、氣道平滑肌肥厚，且血清總IgE升高。哮喘往往在夜間加劇，可進展為嚴重的氣流阻塞、呼吸急促、呼吸困難和吸氧不足。如不及時治療，會發(fā)生嚴重的后果，如缺氧癲癇發(fā)作，呼吸衰竭，甚至死亡[1]，它也是當今世界上最常見的慢性氣道炎癥性疾病。流行病學研究表明，全世界范圍內呼吸道過敏的患病率高達15%～30%[1]，哮喘影響了3.5%～20%的人群[2]。

家系和雙子研究顯示哮喘的發(fā)病具有家族聚集性和明顯的遺傳傾向[3]，其遺傳度可達60%～80%。IL-4是Th2細胞分泌的，常見哮喘患者IL-4表達增高。目前國際上有多篇文獻報道IL-4的單核苷酸多態(tài)性（SNP）和哮喘的相關研究，但結果存在分歧。該研究設計對照病例研究，挑選IL-4基因的啟動子區(qū)rs2243250（-589T/C）和rs2227284、 rs2070874、rs4986964四個SNP位點進行分析研究，探討IL-4基因多態(tài)性多哮喘遺傳易感性的影響。

1 ?材料與方法

1.1 材料

研究材料為哮喘患者或正常對照外周血，取自鹽城周邊地區(qū)人群，病例組67例，平均年齡43.2±16.27，患者符合2009年中華醫(yī)學會呼吸病學會哮喘學組制定的診斷標準。正常對照組85例，平均年齡42.97±19.86，為同期健康體檢人員，無哮喘史，無過敏史。

1.2 方法

1.2.1 提取基因組DNA

每例全血3～5mL，3000rpm，10min分離上清，血清轉移至離心管，-20℃儲存?zhèn)溆谩ＪＳ嘌毎?，采用全血DNA提取試劑盒（三博遠志，離心柱型SG012）提取標本血細胞DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ELISA法檢測血清IL-4的表達

每孔加100?L實驗血清，密封并室溫下孵化2h;加入二抗，密封并室溫下培養(yǎng)1h;洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。加入生物素化抗體工作液100?L/孔，密封并室溫下孵化60min;洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。加入酶結合工作液100?L/孔，用封板膠紙封住反應孔，避光室溫孵育20min。洗板5次，最后一次置厚吸水紙上拍干。加入顯色劑TMB100?L/孔，避光室溫孵育20min;加入終止液50?L/孔，混勻后，用酶標儀（450nm，Bio-Rad iMark） 即刻測定光密度（OD）值，測量OD450，并分析數(shù)據(jù)。應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

1.2.3 設計引物

IL-4基因4個單核苷酸多態(tài)性SNP位點rs2227284、rs2070874、rs4986964、rs2243250位點，設計相應的引物，交由上海生工生物有限公司合成引物。

1.2.4 PCR反應進行待測位點擴增

PCR反應體系為：模板1μL，引物F1μL，引物R1μL，10mMdNTP1μL，TaqBuffer5μL，25mMMgCl25μL，5U/μLTaq酶l0.5μL，水35.5μL。PCR反應條件為預變性95℃，3min，變性94℃，30s，退火55℃～60℃，35s;延伸72℃，40～50s，修復延伸72℃，循環(huán)35次。最后1%瓊脂糖電泳，150V、100m、A20min電泳觀察。采用PCR產物純化回收試劑盒（生工SK1141），然后進行基因測序，鑒定位點的基因型。

1.3 統(tǒng)計學分析

將病例組和對照組基因型頻數(shù)進行哈代-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）檢驗，之后進行采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有的統(tǒng)計檢驗均為雙側概率檢驗，P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

2 ?結果

2.1 DNA提取后電泳結果

收集哮喘患者及正常人體檢血液標本，分離血清，血細胞。血清至于離心管中，-20℃保存。剩余血細胞，采用全血DNA提取試劑盒提取標本血細胞DNA，電泳鑒定見圖1。

2.2 ELISA法檢測患者及對照組血清IL-4的表達

ELISA法檢測67例患者及85例對照IL-4的蛋白表達，結果見表1。實驗組IL-4的表達值為（0.75±0.19）pg/mL，對照組表達值為（0.39±0.13）pg/mL，P<0.05。

2.3 IL-4基因SNP篩選及測序鑒定鑒定

根據(jù)rs2227284、rs2070874、rs4986964、rs2243250位點的DNA序列，設計相應的引物，結果見表2。之后進行PCR反應，電泳驗證后，用PCR產物純化回收試劑盒（生工SK1141），測序并分析（見表3）。在4個SNP位點在實驗組和對照組中無明顯差異，P>0.05。

3 ?討論

基因多態(tài)性是指在人群中個體間基因的核苷酸序列存在差異，即人類染色體的某個位點上單個核苷酸變異，且在人群的發(fā)生頻率超過1%，稱為單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。人類基因組中SNP數(shù)量眾多，平均每300～1000個堿基中就存在一個SNP。由于SNP分布廣泛并且相對穩(wěn)定，是人類個體差異主要的分子標記，因此，常用于反應個體表型差異、不同個體對疾病易感性以及不同個體對藥物敏感性的研究[4]。

哮喘的主要免疫特征是過度的Th2反應的Th1/Th2平衡紊亂作為重要的Th2因子，IL-4可以直接促進IgE合成，因此在哮喘的病理生理過程中扮演重要角色[5]。

該研究通過病例對照研究，發(fā)現(xiàn)患者血清IL-4的表達增高，通過檢測IL-4的4個多態(tài)性位點的基因型，發(fā)現(xiàn)在病例和對照中無明顯差異。但此次研究樣本量偏少，頻率低的基因位點檢測結果可能有偏頗，擴大樣本量能更好地反映實際情況。

參考文獻

[1] 孫金霞，周鷹，楊李，等.粉塵螨變應原Der f Mal f 6的克隆、表達及生物信息學分析[J].中國病原生物學雜志，2013，8（6）：530-534.

[2] 孫金霞，崔玉寶.哮喘的遺傳學研究進展[J].醫(yī)學綜述，2014，20（1）：3-7.

[3] 楊李，周鷹，王運剛，等.粉塵螨變應原第1組分原核表達質粒pCold-TF-Der f 1構建及鑒定[J].中國媒介生物學及控制雜志，2012，23（4）：289-291.

[4] DA， Srinivasan M， Egholm M. The complete genome of an individual by massively parallel DNA sequeneing[J].Nature，2008，452（7189）：872-876.

[5] EI Biaze M，Boniface S，Koscher V，et al. T cell activation， from atopy to asthma： more a paradox than a paradigm[J].Allergy，2003，58（9）：844-853.