夏枯草不同超聲時(shí)間后熊果酸和齊墩果酸的含量變化

向潤清 黃寬 張艷嬌

摘要：目的測定并分析夏枯草不同超聲時(shí)間后其同分異構(gòu)體熊果酸和齊墩果酸的含量變化。方法采用Thermo Acclaim C30（150 mm×21 mm，3 μm），流動(dòng)相為乙腈-02%乙酸水溶液（85：15），等度洗脫，檢測波長205 nm，柱溫18℃，流速為03 mL/min，測定熊果酸、齊墩果酸的含量變化。結(jié)果夏枯草中熊果酸在08～48 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到09997;齊墩果酸在096～576 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為09995。夏枯草中的熊果酸及齊墩果酸在超聲時(shí)間為60 min時(shí)含量均最高。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)以超聲時(shí)間對夏枯草中同分異構(gòu)體熊果酸和齊墩果酸含量的變化做出研究，隨著超聲時(shí)間的延長，兩者含量均逐步升高，這為夏枯草中部分五環(huán)三萜類成分的提取、分離、鑒定、制備提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：夏枯草;熊果酸;齊墩果酸;同分異構(gòu)體

中圖分類號：R9272文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1007-2349（2019）11-0074-04

Content Changes of Ursolic Acid and Oleanolic Acid in Prunella vulgaris L. after Different Ultrasonic Time

XIANG Run-qing1， HUANG Kuan1， ZHANG Yan-jiao1， FAN Yuan2

（1. School of Traditional Chinese Materia Medica， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China; 2. The Second Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650216， China）

【Abstract】Objective： To determine and analyze the content changes of isomers ursolic acid and oleanolic acid in Prunella vulgaris L. after different ultrasonic time. Methods： Thermo Acclaim C30 （150 mm × 2.1 mm， 3 μm） was used and mobile phase was acetonitrile-0.2% aqueous acetic acid （85：15）， with isocratic elution， detection wavelength 205 nm， column temperature 18° C and flow rate 0.3 mL/min. The content changes of ursolic acid and oleanolic acid was determined. Results： The ursolic acid in Prunella vulgaris L. showed a linear relationship in the range of 0.8 to 4.8 μg， and the correlation coefficient was 0.9997. The oleanolic acid showed a linear relationship in the range of 0.96 to 5.76 μg， and the correlation coefficient was 0.9995. The content of ursolic acid and oleanolic acid in Prunella vulgaris was highest at 60 min. Conclusion： In this experiment， the content changes of the isomers ursolic acid and oleanolic acid in Prunella vulgaris L. were studied by ultrasonic time. With the prolongation of ultrasonic time， the content of both were gradually increased. The study provides a certain reference for the extraction， separation， identification and preparation of some of the five-ring triterpenoids.

【Key words】Prunella vulgaris L.， ursolic acid， oleanolic acid， isomeride

夏枯草為唇形科（Lamiaceae）植物夏枯草Prunella vulgaris L的干燥果穗，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主要分布于云南、四川、貴州、湖北、湖南等地，其中硬毛夏枯草主產(chǎn)于云南，且被《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》收載。夏枯草味苦、辛，性寒，歸肝、膽經(jīng)，具有清火、明目、消腫、散結(jié)等功效，常用于治療目珠夜痛、目赤腫痛、頭痛眩暈、癭瘤、瘰疬、乳癖、乳癰、乳房脹痛等病癥[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明夏枯草具有降糖[2]、降壓[3]、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)作用[4]、抗氧化作用[5]、抗腫瘤、抑制病毒生長等[6-7]多種藥理作用，對目赤腫痛、畏光流淚、目珠夜痛、頭暈?zāi)垦?、瘰疬、癭瘤、乳腺癌、高血壓、淋巴結(jié)核、浸潤性肺結(jié)核、單純性甲狀腺腫、腮腺炎、急性黃疸型傳染性肝炎等多種疾病均有良好的臨床治療效果[8-9]。夏枯草中主要含有三萜及其苷類、甾醇及其苷類、黃酮類、香豆素、苯丙素、有機(jī)酸、揮發(fā)油及糖類等成分，其中以三萜類成分為主，主要類型為齊墩果烷型、烏蘇烷型和羽扇豆烷型，以齊墩果酸和熊果酸含量最高[10]。熊果酸與齊墩果酸互為同分異構(gòu)體，分子式均為C30H48O3，熊果酸分子量：45668 g/moL，齊墩果酸分子量：45671 g/moL，二者的化學(xué)結(jié)構(gòu)區(qū)別在于熊果酸在19和20位碳原子上各有一個(gè)甲基，而齊墩果酸的20位碳原子上有2個(gè)甲基，在19位碳原子上無甲基。因此，兩種天然化合物的理化性質(zhì)相似（兩者結(jié)構(gòu)式見圖1）。

熊果酸（ursolic acid UA），又名烏索酸、烏蘇酸，以游離形式或與糖結(jié)合成苷，是夏枯草中的主要化學(xué)成分之一，熊果酸具有廣泛的生物學(xué)特性，通常用于抗菌、抗病毒、抗腫瘤和保肝等[11-13]治療，如UA在HEPG2、7721和Huh7人肝癌細(xì)胞系中，可降低轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的下游靶基因（例如Bcl-2，Bcl-xl）的表達(dá)，抑制腫瘤生長[14];齊墩果酸（Oleanolic acid OA）為齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物，具有保肝、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[15-18]，如OA作用于K562細(xì)胞后，可以增加其Bax mRNA的水平，降低Bcl-xL mRNA的水平，從而調(diào)整Bcl-2家族相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的比例來誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[19]。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)夏枯草中五環(huán)三萜類成分同分異構(gòu)體熊果酸和齊墩果酸的理化性質(zhì)，應(yīng)用Thermo Acclaim C30色譜柱，測定夏枯草中熊果酸和齊墩果酸在不同超聲時(shí)間下含量的變化。

1材料與儀器

11材料乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）均購自默克化工技術(shù)（上海）有限公司、乙酸（分析純）、甲醇（分析純）均購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq181217），齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq181026），夏枯草果穗（云南羅平，批號：P20180930）。

12儀器Agilent 1200 高效液相色譜儀（VWD檢測器），F(xiàn)A1004N 型萬分之一分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），語路超聲波清洗機(jī)、DFY-600 搖擺式高速萬能粉碎機(jī)（永康式速鋒工貿(mào)有限公司），T-1000 型電子天平（上海浦春計(jì)量儀器有限公司），D2KW-D 電熱恒溫水浴鍋。

2方法與結(jié)果

21夏枯草粉末的制備干燥的夏枯草果穗，用打粉機(jī)打碎，過40目篩即得。

22熊果酸和齊墩果酸混合對照品溶液的制備精密稱定熊果酸對照品40 mg，齊墩果酸對照品48 mg置10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，制成熊果酸和齊墩果酸濃度分別為04 mg·mL-1、048 mg·mL-1的溶液，備用。

23供試品溶液的制備精密稱取夏枯草粉末約10 g分別置于5個(gè)帶塞錐形瓶中，分別加入20 mL甲醇，密塞，超聲處理20、30、40、50、60 min后取出，放冷，搖勻，過濾，取濾液，過045 μm微孔濾膜，即得供試品溶液，備用。

24色譜條件色譜柱：Thermo Acclaim C30（150 mm×21 mm，3 μm），流動(dòng)相為乙腈-02%乙酸水溶液（85：15），等度洗脫，檢測波長205 nm，柱溫18℃，流速為03 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

25熊果酸、齊墩果酸對照品、夏枯草供試品溶液的高效液相色譜（HPLC）圖譜分別見圖2～3（A：齊墩果酸，B：熊果酸）。

26線性關(guān)系考察

261標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取“22”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，經(jīng)045 μm的微孔濾膜過濾后，按“24”項(xiàng)下色譜條件分別取2、4、6、8、10、12 μl進(jìn)樣，以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y（mAU *s）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到熊果酸、齊墩果酸的回歸方程分別為：y=18744x-13911，R2=09997;y=y=23405x-20622，R2=09995，結(jié)果表明，熊果酸、齊墩果酸分別在08～48 μg，096～576 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，見圖4～5。

262精密度考察取“22”項(xiàng)下的混合對照品溶液10 μL，按“24”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，按峰面積計(jì)算熊果酸、齊墩果酸的RSD值分別為：161%、161%，表明儀器精密度良好。

263穩(wěn)定性考察取“23”項(xiàng)下超聲30 min的夏枯草樣品溶液，按“24”色譜條件，分別在0，2，4，6，8，10 h進(jìn)樣，分別計(jì)算熊果酸、齊墩果酸峰面積的RSD值為：036%、072%，夏枯草提取液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

264重復(fù)性試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取夏枯草粉末6份，按“23”項(xiàng)下相同方法制得夏枯草超聲30 min的提取液，按“24”項(xiàng)下的色譜條件，每份進(jìn)樣10 μL，以熊果酸、齊墩果酸峰面積計(jì)算，其峰面積RSD值分別為071%、084%，表明樣品重復(fù)性良好。

27夏枯草不同超聲時(shí)間后熊果酸和齊墩果酸的含量變化見表1和圖6。

3討論

31實(shí)驗(yàn)結(jié)果從表1、圖6的結(jié)果中看出：在線性范圍內(nèi)，熊果酸和齊墩果酸的含量均隨著超聲時(shí)間的延長而升高，熊果酸含量在20 min～40 min之間變化比較平緩，40 min～50 min之間含量變化趨勢最大，50 min～60 min之間熊果酸含量幾乎不變;齊墩果酸含量在20 min～40 min之間變化趨勢比較平緩，40 min～50 min之間含量變化趨勢較大，但沒有熊果酸的變化趨勢大，50 min～60 min之間齊墩果酸含量也幾乎不變，趨于穩(wěn)定，即兩種成分含量在相同時(shí)間段內(nèi)變化趨勢一致。

32色譜柱和流動(dòng)相洗脫程序的選擇本實(shí)驗(yàn)先后考察了Agilent ZORBAX SB-C18（46 mm×250 mm，5 μm）和Thermo Acclaim C30（150 mm×21 mm，3 μm）色譜柱，以及流動(dòng)相乙腈-乙酸水溶液（01-05%）、乙腈：磷酸水溶液（01-05%）的比例變化，最后發(fā)現(xiàn)用色譜柱Thermo Acclaim C30（150 mm×21 mm，3 μm），流動(dòng)相為乙腈-02%乙酸水溶液（85：15）的條件下，更有利于同分異構(gòu)體熊果酸和齊墩果酸兩種成分的分離。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RP-HPLC法測得夏枯草中同分異構(gòu)體熊果酸和齊墩果酸均隨著超聲時(shí)間的延長而增加，含量變化趨勢一致，且在60 min時(shí)含量最高，以上結(jié)果提示：中藥材中同分異構(gòu)體類成分的含量可能隨著超聲時(shí)間的一定延長而逐步升高，且相同時(shí)間段呈現(xiàn)出相同的變化趨勢。本實(shí)驗(yàn)為夏枯草和其他中藥材中五環(huán)三萜類成分的提取、分離、鑒定、制備提供一定的參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會中國藥典2015年版.北京：化工出版社，2015：280

[2]Raafat K，Wurglics M，Schubert-Zsilavecz MPrunella vulgaris Lactive components and their hypoglycemic and antinociceptive effects in alloxan-induced diabetic mice[J].Biomedicine & Pharmacotherapy，2016，84：1008-1018

[3]Zhang W，F(xiàn)an JM，Tang Y，et alStudies on Characterization of Active Constituents in Prunella vulgaris Land Mechanism of their Antihypertensive Effect[J].Asian Journal of Chemistry，2014，26（18）：5967-5969

[4]Lu J，Qin R，Ye S，et alPrunella vulgaris Lextract improves cellular immunity in MDR-TB challenged rats[J].Journal of Medical Colleges of PLA，2011，26（4）：230-237

[5]Chen Y，Zhang X，Guo Q，et alPlant morphology，physiological characteristics，accumulation of secondary metabolites and antioxidant activities of Prunella vulgaris，Lunder UV solar exclusion[J].Biological Research，2019，52（1）：2-12

[6]Li C，Huang Q，Xiao J，et alPreparation of Prunella vulgaris polysaccharide-zinc complex and its antiproliferative activity in HepG2 cells[J].International Journal of Biological Macromolecules，2016，91：671-679

[7]Oh C S，Price J，Brindley M A，et alInhibition of HIV-1 infection by aqueous extracts of Prunella vulgaris L[J].Virology Journal，2011，8（1）：188-188

[8]孫宬夏枯草的藥理作用和研究進(jìn)展[J].中醫(yī)臨床研究，2016（26）：146-148

[9]趙秀梅中藥夏枯草的藥理作用研究現(xiàn)狀[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2016（12）：120-122

[10]Gu X，Li Y，Mu J，et alChemical constituents of Prunella vulgaris[J].Environ Sci，2013（1）：161-163

[11]Mu D，Zhou G，Li J，et alUrsolic acid activates the apoptosis of prostate cancer via ROCK/PTEN mediated mitochondrial translocation of cofilin-1[J].Oncology Letters，2018，15（3）：3202-3206

[12]Meng Y，Lin Z M，Ge N，et alUrsolic Acid Induces Apoptosis of Prostate Cancer Cells via the PI3K/Akt/mTOR Pathway[J].The American Journal of Chinese Medicine，2015，43（7）：1471-1486

[HJ1.9mm][SD1，1][FQ（12*2。175mm，X，DY-W][CD=175mm]

[13]張男男，戈娜熊果酸對實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用研究進(jìn)展[J].華夏醫(yī)學(xué)，2018，31（4）：173-177

[14]Liu T，Ma H，Shi W，et alInhibition of STAT3 signaling pathway by ursolic acid suppresses growth of hepatocellular carcinoma[J].International Journal of Oncology，2017，51（2）：555-562

[15]Akl M R，Elsayed H E，Ebrahim H Y，et al3-O-[N-（p-fluorobenzenesulfonyl）-carbamoyl]-oleanolic acid，a semisynthetic analog of oleanolic acid，induces apoptosis in breast cancer cells[J].European Journal of Pharmacology，2014，740：209-217

[16]張明發(fā)，沈雅琴齊墩果酸和熊果酸保肝藥理作用的研究進(jìn)展[J].抗感染藥學(xué)，2012，9（1）：13-19

[17]蔣惠娣齊墩果酸體外對感染HIV的人單核細(xì)胞的抗病毒作用[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2003，18（1）：24-24

[18]Mu D W，Guo H Q，Zhou G B，et alOleanolic acid suppresses the proliferation of human bladder cancer by Akt/mTOR/S6K and ERK1/2 signaling[J].International Journal of Clinical & Experimental Pathology，2015，8（11）：13864-13870

[19]Liese J，Abhari B A，F(xiàn)ulda SSmac mimetic and oleanolic acid synergize to induce cell death in human hepatocellular carcinoma cells[J].Cancer Letters，2015，365（1）：47-56

（收稿日期：2019-07-19）