沙塵暴PM2.5 顆粒致大鼠炎癥反應(yīng)和心臟損傷的研究

李星輝 雷林峰 喬燕 聶芳菲 馬婧 王晨晨 王立君

沙塵暴是全世界干旱地區(qū)較為常見的一種災(zāi)害性天氣現(xiàn)象，指強(qiáng)風(fēng)將地面塵沙吹起使空氣混濁，水平能見度＜1km，沙塵暴天氣易誘導(dǎo)發(fā)生各種疾病[1]。沙塵暴顆粒物中的有毒物質(zhì)及病菌可經(jīng)呼吸道進(jìn)入人體，對機(jī)體健康造成損害，損害程度與沙塵暴顆粒物的來源、直徑及化學(xué)成分有關(guān)。目前，沙塵暴顆粒物已成為危害人類健康的主要因素之一，2002 年世界衛(wèi)生組織的估算結(jié)果表明，全球城市每年因顆粒物污染至少造成100 萬居民死亡和740 萬居民傷殘調(diào)整生命年的損失，而東南亞、東亞（包括中國）、南亞國家約承擔(dān)一半的損失，因為該地區(qū)顆粒物污染嚴(yán)重[2]。以往對沙塵暴顆粒物的研究多聚集在呼吸系統(tǒng)，對沙塵暴顆粒物在心血管系統(tǒng)的影響及其機(jī)制研究甚少，目前沙塵暴顆粒物污染與人群心血管系統(tǒng)疾病發(fā)病及死亡的關(guān)系已逐漸成為研究熱點之一。相關(guān)學(xué)者已提出沙塵暴顆粒物致心血管系統(tǒng)疾病的可能機(jī)制，包括損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、激發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、引起血管舒縮功能及脂質(zhì)功能障礙、促進(jìn)血栓形成、促進(jìn)動脈粥樣硬化病變的發(fā)生和發(fā)展等，這些過程又相互關(guān)聯(lián)，最終導(dǎo)致心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展[3-4]。本研究通過采集甘肅河西走廊沙塵暴顆粒，研究不同暴露劑量的沙塵暴PM2.5 對Wistar 大鼠心臟損傷的影響，闡述沙塵暴PM2.5 對心臟的炎性損傷反應(yīng)，現(xiàn)報道如下。

1 實驗對象和方法

1.1 實驗對象及材料 32 只6 周齡SPF 級健康雄性Wistar 大鼠，體重180～200g，常規(guī)條件喂養(yǎng)2 周。實驗所用沙塵暴PM2.5 由甘肅省河西走廊地區(qū)武威市環(huán)境保護(hù)局監(jiān)測中心提供。使用TEOM1405D 雙通道顆粒物監(jiān)測儀來保證沙塵暴PM2.5 的粒徑大小，對于粒徑＜10μm 的顆粒物先經(jīng)頂端的PM10 切割頭進(jìn)入采樣系統(tǒng)，再被虛擬沖擊器分離為PMc 和PM2.5，進(jìn)入雙通道的顆粒物分別聚積在系統(tǒng)可更換的TEOM 濾膜上。實驗所用沙塵暴顆粒物PM2.5均來自這些更換后的濾膜。

1.2 方法

1.2.1 沙塵暴PM2.5 溶液的配制 將采有沙塵暴PM2.5 的濾膜取出并裁剪成1cm×3cm 大小，浸入超純水中，超聲震蕩30min，共3 次，震蕩液用紗布過濾，濾液經(jīng)冷凍真空干燥后得到沙塵暴PM2.5 粉末，置入-20℃冰箱保存。用電子天平稱取各暴露組所需沙塵暴顆粒物PM2.5 的量（低暴露組、中暴露組、高暴露組PM2.5 的量分別按1.5、6.0、24.0mg/kg 進(jìn)行計算），并用無菌0.9%氯化鈉溶液配制成各暴露組所需的濃度，之后經(jīng)超聲震蕩15min 混勻后備用。

1.2.2 沙塵暴PM2.5 暴露模型的建立 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4 組，即沙塵暴PM2.5 低劑量暴露組（低暴露組）、中劑量暴露組（中暴露組）、高劑量暴露組（高暴露組）及空白對照組。以3ml/kg、10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸部備皮，碘伏消毒，行頸前正中切口約1cm，分離皮下和肌肉組織暴露氣管，用6 號針頭與氣管稍呈角度刺入，經(jīng)氣管緩慢滴入0.5ml 不同濃度的沙塵暴PM2.5，共滴注3 次，1 次/d，即暴露3 次?？瞻讓φ战M滴注等量0.9%氯化鈉溶液。每次沙塵暴PM2.5 暴露前及氣管滴注后24、48、72h 稱量記錄每只大鼠的體重。

1.2.3 大鼠血清炎癥因子的檢測及心臟組織的病理形態(tài)學(xué)觀察 建模成功后，采用先前的麻醉方法，剖開腹腔，暴露腹主動脈采血，靜置凝固后離心，3 000r/min，4℃，10min，置-20℃冰箱備用。采血完成后立即脫頸椎處死，充分暴露胸腔，剪去大血管，取出心臟組織，清洗后標(biāo)記置凍存管備用。（1）采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法分別測定4 組大鼠血清炎癥因子C反應(yīng)蛋白（c-reactive protein，CRP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素（IL）-1、IL-6、IL-8 和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）水平。具體方法為：取樣；標(biāo)準(zhǔn)品加樣；空白孔和待測樣品孔加樣；加酶；溫育；洗滌；顯色；終止；測定；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算。（2）組織切片制作及蘇木精-伊紅（HE）染色：固定；脫水；透明；透蠟；包埋；切片；貼片；染色；封固；顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組大鼠的體重變化比較 見表1。

由表1 可見，與暴露前比較，空白對照組大鼠體重在第1 次暴露后未見明顯減輕，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。第1 次暴露后的高暴露組，第2 次暴露后的中、高暴露組，第3 次暴露后的低、中、高暴露組的大鼠體重均較空白對照組下降明顯（P＜0.05或0.01）。同時各暴露組大鼠毛發(fā)漸失去順滑感且光澤漸消失、呼吸急促、活動量減少、進(jìn)食及飲水量明顯減少，而空白對照組大鼠上述變化不明顯。

2.2 4 組大鼠暴露72h 后炎癥因子比較 見表2。

由表2 可見，與空白對照組比較，低暴露組、中暴露組及高暴露組大鼠CRP、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MIP-2 水平均呈劑量依賴性升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 4 組大鼠心臟組織病理形態(tài)學(xué)變化 見圖1。

由圖1 可見，與空白對照組相比，低、中暴露組大鼠心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞間質(zhì)變窄，但兩組未見明顯差異；而高暴露組大鼠心肌細(xì)胞明顯肥大，細(xì)胞間質(zhì)明顯變窄；空白對照組未發(fā)現(xiàn)上述改變。4 組大鼠心臟組織切片未觀察到明顯的炎性細(xì)胞浸潤。

表1 4 組大鼠的體重變化比較（g）

表2 4 組大鼠暴露72h 后炎癥因子比較

圖1 4 組大鼠心臟組織病理圖（A：低暴露組；B：中暴露組；C：高暴露組；D：空白對照組；HE 染色，×200）

3 討論

我國西北地區(qū)由于獨特的自然環(huán)境和地理條件，屬于沙塵暴頻發(fā)帶，甘肅河西走廊地區(qū)是中國北方沙塵暴的第二大源區(qū)。筆者發(fā)現(xiàn)每當(dāng)沙塵暴高發(fā)時期，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院因心血管疾病就診率、住院率及病死率均有所增高，因此選取此地區(qū)沙塵標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)動物實驗。已有研究揭示了人類和動物暴露于顆粒物與全身促炎反應(yīng)具有相關(guān)性，從而造成心血管系統(tǒng)的損害[5-7]。研究表明，炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生及炎性因子的釋放在心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的作用[8]。在本實驗中，我們選擇測量大鼠血 清 炎 癥 因 子 CRP、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MIP-2 水平來評估暴露于沙塵暴PM2.5 導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。CRP 是全身炎癥的敏感標(biāo)志物和心血管事件有價值的預(yù)測指標(biāo)，TNF-α、IL-6、MIP-2 均具有促進(jìn)炎癥發(fā)生和發(fā)展的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)暴露于PM2.5，可引起血清CRP、IL-1、IL-6 水平升高，且IL-6 的升高水平與PM2.5 的暴露劑量呈正相關(guān)關(guān)系[9-10]。將小鼠暴露于顆粒物中，其血清MIP-2 的水平逐漸升高，在暴露后24h 炎癥反應(yīng)程度最大[11]，顆粒物暴露也會導(dǎo)致TNF-α 水平升高[12]。研究發(fā)現(xiàn)暴露于不同濃度的PM2.5，24h 后血清中IL-1 的水平呈劑量依賴性升高，且48h 后IL-8 的水平隨暴露劑量的增加而逐漸升高[10，13]。上述研究結(jié)果與本實驗發(fā)現(xiàn)相吻合。

研究發(fā)現(xiàn)顆粒物誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生依賴于活性氧的生成和核因子-κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活化[14]。暴露于不同濃度的PM2.5，NF-κB 蛋白表達(dá)量顯著增加，而NF-κB 抑制蛋白α 表 達(dá) 量 顯 著 下 降，NF-κB 可 通 過 控 制IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α 和一氧化氮合酶（iNOS）的直接或間接表達(dá)來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[15-16]。核因子IκBα 可以抑制NF-κB 從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運，因此IκBα的下調(diào)被認(rèn)為是NF-κB 活化的標(biāo)志物[17]。以后的研究應(yīng)圍繞顆粒物誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行。

本實驗發(fā)現(xiàn)成年Wistar 大鼠暴露于沙塵暴PM2.5 后，可出現(xiàn)暴露組大鼠體重明顯減輕，推測可能是皮膚切開對大鼠屬于外傷性刺激，可直接導(dǎo)致氣管滴注后大鼠進(jìn)食和飲水量的減少，從而引起大鼠體重下降，但由于隨顆粒物暴露劑量的增加而減輕明顯，也不能排外暴露于沙塵暴PM2.5 后產(chǎn)生的毒性反應(yīng)所致。在本研究中，各組大鼠心臟組織切片經(jīng)HE 染色后，在光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)暴露組大鼠心肌細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的肥大。中暴露組與低暴露組相比，心肌細(xì)胞肥大程度未見明顯差異，可能與兩組PM2.5 暴露劑量相差不大有關(guān)，而高暴露組心肌細(xì)胞明顯肥大，細(xì)胞間質(zhì)明顯變窄，推測與暴露時間、濃度相關(guān)。而上述各組大鼠心臟組織切片均未觀察到明顯的炎性細(xì)胞浸潤。已有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠暴露于顆粒物中2d 后，僅在心臟右心室組織切片中觀察到心肌細(xì)胞肥大及炎癥細(xì)胞浸潤[18]。但也有部分研究者發(fā)現(xiàn)，Wistar 大鼠經(jīng)氣管滴注PM10 2d 后，在大鼠心臟組織切片中未觀察到心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)改變[19]。究其原因，可能與本實驗中采用心臟的心尖部分作HE 染色切片有關(guān)，而心尖組織大部分屬于左心室，可能也與顆粒物暴露時間長短有一定的關(guān)聯(lián)。

總之，暴露于沙塵暴PM2.5 可誘導(dǎo)血清炎癥因子CRP、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MIP-2 的產(chǎn)生及心臟的炎性損傷，從而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。本實驗未對沙塵暴顆粒物的成分及理化性質(zhì)等進(jìn)行研究，這些因素也會對上述實驗結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，今后的實驗中應(yīng)進(jìn)一步改進(jìn)。