超聲微泡介導(dǎo)MaFGF 對(duì)阿霉素心力衰竭大鼠心功能的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

倪賢偉 田新橋 趙應(yīng)征 鄭磊 李劍敏

Lefrak 于1973 年率先報(bào)道阿霉素具備心臟毒性，提出其危險(xiǎn)性相較腎臟毒性、消化道不良反應(yīng)、骨髓抑制等更高[1]。阿霉素療法存在致心臟毒性風(fēng)險(xiǎn)，最嚴(yán)重的一類并發(fā)癥為心力衰竭（簡稱心衰）。改構(gòu)型酸性成纖維細(xì)胞生長因子（modified acidic fibroblast growth factor，MaFGF）是通過基因工程技術(shù)去除酸性成纖維細(xì)胞生長因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）促分裂活性并保留非促分裂活性的突變體[2]，與aFGF 具有同等的心肌保護(hù)效應(yīng)[3]，如抵抗氧化應(yīng)激、抑制心肌細(xì)胞凋亡等[4]。本研究應(yīng)用超聲靶向微泡擊破技術(shù)（ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD）靶向介導(dǎo)MaFGF 對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷大鼠進(jìn)行干預(yù)，采用超聲心動(dòng)圖檢查，測(cè)定心肌丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）含量，通過Masson 膠原染色及透射電鏡等檢查評(píng)價(jià)該方法對(duì)阿霉素心衰大鼠心功能的保護(hù)作用并探討其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF 級(jí)SD 大鼠共40只，鼠齡40～50d，體重（210±24）g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 超聲診斷系統(tǒng)為Acuson Sequoia 512C（美國Siemens 公司），探頭：15L8w-S線陣，頻率：12～14MHz，內(nèi)部配裝RT-MCE 造影軟件。MaFGF 凍干粉為溫州醫(yī)科大學(xué)生物和天然藥物開發(fā)中心有限公司提供；微泡造影劑采用SonoVue微泡（意大利Bracco 公司）；鹽酸阿霉素購自大連美侖生物有限公司；SOD 與MDA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司；Masson 三色染色液購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SonoVue-MaFGF 混懸液配制 稱量MaFGF凍干粉30μg，添加0.9%氧化鈉溶液5ml，小幅振搖使徹底溶解，即得到MaFGF 溶液，然后移入SonoVue瓶（已含SonoVue 凍干粉）內(nèi)，待混合，于室溫中進(jìn)行10～20min 靜置孵育處理，此過程中小幅振蕩若干次，最后得到SonoVue-MaFGF 混懸液[5]。參考課題組以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此項(xiàng)目所制備的SonoVue-MaFGF 混懸液所含MaFGF 量控制為6μg/ml。

1.3.2 動(dòng)物造模及分組 40 只SD 大鼠通過隨機(jī)區(qū)組法歸入以下4 組：正常對(duì)照組、HF 模型組、MaFGF組、MaFGF+UTMD 組，每組10 只。后3 組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物根據(jù)體重，將3mg/kg 鹽酸阿霉素由腹腔注入體內(nèi)，每周1 次，共6 周，注射量合計(jì)為18mg/kg，正常對(duì)照組注射等容積的0.9%氯化鈉溶液。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均得到溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)處理 MaFGF+UTMD 組大鼠腹腔注入戊巴比妥鈉（3%）麻醉，之后剃除心前區(qū)毛發(fā)，將探頭放在其心前區(qū)，超聲切面為乳頭肌水平左心室短軸，設(shè)定3.5～4.0cm 聚焦深度，分別經(jīng)尾靜脈注射0.1ml SonoVue-MaFGF 混懸液，當(dāng)數(shù)量可觀的微泡充盈心肌內(nèi)部時(shí)，借助設(shè)備自帶微泡爆破功能對(duì)微泡實(shí)施若干次重復(fù)爆破處理，期間機(jī)械指數(shù)（MI）設(shè)定為1.9，待微泡徹底消失結(jié)束。MaFGF 組大鼠經(jīng)尾靜脈注入MaFGF 溶液0.1ml。正常對(duì)照組和HF 模型組大鼠尾靜脈注入0.1ml 0.9%氯化鈉溶液，每周分別在注入鹽酸阿霉素后的第4、6 天實(shí)施上述干預(yù)，共6 周。

1.3.4 超聲心動(dòng)圖檢查 干預(yù)6 周后，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依次接受麻醉（經(jīng)腹腔注入3%戊巴比妥鈉）、胸前區(qū)剃毛處理，使其呈左側(cè)臥位，并在固定板上固定，將探頭放在其心前區(qū)，行超聲心動(dòng)圖檢查，測(cè)量各組大鼠左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室短軸縮短率（LVFS）以及左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.3.5 MDA、SOD 水平測(cè)定 處死大鼠后，取部分大鼠左心室心肌組織，加入冷0.9%氯化鈉溶液，使0.9%氯化鈉溶液總體積：心肌組織重量為9∶1（1g可換算為1ml），借助眼科小剪刀迅速剪碎組織塊，接著于碎冰內(nèi)對(duì)組織實(shí)施研磨。對(duì)完成配制10%組織勻漿實(shí)施10min 離心處理，3 000r/min、4℃，取適量上清液待檢測(cè)。采用BCA 試劑盒測(cè)定心肌總蛋白含量，根據(jù)MDA、SOD 兩試劑盒所示操作測(cè)定心肌組織MDA 和SOD 水平。

1.3.6 Masson 膠原染色 收集大鼠心臟組織，接著實(shí)施1d 固定（固定液為4%多聚甲醛），之后石蠟包埋，切片（厚度為5μm），進(jìn)行Masson 膠原染色，置于高分辨率光學(xué)顯微鏡下觀察心肌纖維化狀況，各組12 張切片，隨機(jī)選擇各切片內(nèi)20 個(gè)400 倍視野，應(yīng)用IPP 6.0 軟件測(cè)量心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）、血管周圍膠原面積（PVCA）/血管腔面積（LA）比值。

1.3.7 透射電鏡觀察 大鼠心肌組織采用鋨酸固定，丙酮梯度脫水（70%、80%、90%），環(huán)氧樹脂浸透包埋、聚合，通過超薄切片機(jī)得到超薄切片，通過透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），方差齊性者兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊者進(jìn)行Dunnet’sT檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果比較 見表1。

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果比較

由表1 可見，HF 模型組LVESd、LVEDd 較正常對(duì)照組升高，LVEF、LVFS 則降低（均P＜0.05）；經(jīng)過6 周干預(yù)，MaFGF 組、MaFGF+UTMD 組LVEF、LVFS較HF 模型組均升高，LVESd、LVEDd 則降低（均P＜0.05）；MaFGF+UTMD 組LVEF、LVFS 較MaFGF組均升高（均P＜0.05）。

2.2 各組大鼠心肌組織MDA、SOD 水平比較 見表2。

表2 各組大鼠心肌組織MDA、SOD 水平比較

由表2 可見，HF 模型組心肌組織SOD 水平較正常對(duì)照組降低，MDA 則升高（均P＜0.05），MaFGF組及MaFGF+UTMD 組心肌組織MDA 水平較HF模型組下降、SOD 則升高（均P＜0.05）。與MaFGF組相比，MaFGF+UTMD 組心肌組織SOD 水平升高（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠心肌組織Masson 膠原染色結(jié)果 見插頁圖1、2 及表3。

表3 各組大鼠心肌組織CVF 與PVCA/LA 比較

由插頁圖1、2 可見，紅細(xì)胞、纖維束與肌纖維均顯紅色，心肌膠原纖維則顯藍(lán)色。與正常對(duì)照組比較，HF 模型組CVF、PVCA/LA 均升高（均P＜0.05），MaFGF 及MaFGF+UTMD 組心肌組織CVF 和PVCA/LA 較HF 模型組下降（均P＜0.05），而與MaFGF 組相比，MaFGF+UTMD 組心肌組織CVF 和PVCA/LA 下降更明顯（均P＜0.05）。

2.4 各組大鼠心肌組織透射電鏡檢測(cè)結(jié)果 見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織透射電鏡結(jié)果（A：正常對(duì)照組；B：HF 模型組；C：MaFGF 組；D：MaFGF+UTMD 組；×10 000）

由圖3 可見，正常對(duì)照組各肌絲分布整齊，未見異常線粒體形態(tài)，為單行分布，附近無明顯空泡產(chǎn)生。與正常對(duì)照組比較，HF 模型組經(jīng)6 周干預(yù)，心肌各肌絲分布喪失齊整性，且線粒體無規(guī)律分布，腫脹變形，附近存在空泡；但是經(jīng)過6 周MaFGF 干預(yù)，心臟微觀逐漸好轉(zhuǎn)，尤其MaFGF+UTMD 組心臟肌絲與肌纖維分布較為整齊，未見異常線粒體形態(tài)，且規(guī)則分布，肌絲附近空泡量大幅下降。

3 討論

心衰是阿霉素療法危險(xiǎn)性最大的一類并發(fā)癥，臨床雖有包括心臟移植、支持治療在內(nèi)的若干治療方案，但心衰患者無法得到良好預(yù)后，且存在較高致死率。而由鹽酸阿霉素誘導(dǎo)的心衰發(fā)生的具體發(fā)病機(jī)制還未完全闡明，現(xiàn)今認(rèn)為是由諸多因素（包括氧化應(yīng)激、溶酶體改變、炎性反應(yīng)、心肌電解質(zhì)紊亂等）協(xié)同作用所致[6]。然而，由氧自由基（oxygen free radical，OFR）產(chǎn)生所致氧化應(yīng)激提升一直被視作阿霉素導(dǎo)致心衰的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。因此，減少氧自由基產(chǎn)生和抗氧化應(yīng)激治療成為防治心衰的重要策略。

已有研究發(fā)現(xiàn)，aFGF 高表達(dá)于心臟組織，在心臟發(fā)育、心肌細(xì)胞凋亡受抑、增強(qiáng)心肌細(xì)胞增生分化、抗氧化應(yīng)激、促心肌毛細(xì)血管產(chǎn)生[7]等方面發(fā)揮一定作用，所以，在治療心臟病變方面應(yīng)用aFGF 具備潛在價(jià)值。然而鑒于在促有絲分裂方面的廣譜性特征，aFGF 促進(jìn)正常細(xì)胞有序增殖的同時(shí)也誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞大量增殖。借助基因工程技術(shù)，MaFGF 是能夠消除aFGF 促分裂性能，同時(shí)將無促分裂能力留存下來的突變體[2]，發(fā)揮與aFGF 等效的心肌保護(hù)作用[3]，還可在一定程度上避免不良反應(yīng)的發(fā)生。但MaFGF 分子量很大，穩(wěn)定性較差，在體外存在極大氧化失活風(fēng)險(xiǎn)，全身給藥被快速滅活，因此半衰期短，生物利用率不高，同時(shí)不具備可控性、安全性與高效性的心肌靶向傳輸載體和技術(shù)，采取直接心肌注射MaFGF 法，在操作復(fù)雜性、有創(chuàng)性等方面有所不足，使得其臨床應(yīng)用受限。

將超聲微泡當(dāng)作造影劑對(duì)靶向組織實(shí)施超聲顯影，受到治療或診斷性超聲波能量刺激，超聲微泡爆破所致空化效應(yīng)與機(jī)械作用可使暫時(shí)性開放小孔見于局部內(nèi)皮細(xì)胞膜和毛細(xì)血管上[8-9]，經(jīng)由此類小孔，藥物能夠向組織內(nèi)轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)靶向輸送藥物的目的。此次研究在配制SonoVue-MaFGF 基礎(chǔ)上，超聲能量作用下于心肌組織對(duì)SonoVue-MaFGF 施以靶向爆破處理，由此完成MaFGF 向心肌組織的輸送，并釋放效能。通過超聲心動(dòng)圖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HF 模型組LVESd、LVEDd 均較對(duì)照組顯著升高，而LVEF、LVFS 則明顯降低；接受了6 周MaFGF 靶向干預(yù)后，相比HF 模型組，MaFGF+UTMD 組LVFS、LVEF 明顯升高，LVESd、LVEDd 則明顯下降?？梢姲⒚顾氐男募《拘钥蓪?dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心腔大幅擴(kuò)張，明顯損傷左心室收縮功能，同時(shí)由UTMD 介導(dǎo)的MaFGF 對(duì)于心衰大鼠左心室收縮功能可發(fā)揮積極的保護(hù)效應(yīng)。心肌組織SOD、MDA 水平測(cè)定結(jié)果顯示，MaFGF組與MaFGF+UTMD 組SOD 明顯升高，但MDA 明顯降低，證實(shí)MaFGF 干預(yù)可有效抵抗由阿霉素所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)。線粒體是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要供體以及作用靶點(diǎn)[10]，相比其它器官，作為能量需求高的臟器，心臟線粒體數(shù)量與密度較高，所以更易受到阿霉素所致氧化應(yīng)激反應(yīng)的攻擊。透射電鏡結(jié)果顯示，相較于正常對(duì)照組大鼠，HF 模型組大鼠的心肌肌絲之間排列紊亂，同時(shí)線粒體排列紊亂，腫脹變形，周圍可見空泡形成，說明HF 模型組大鼠心臟結(jié)構(gòu)明顯異常以及能量代謝紊亂，而分布紊亂與腫脹的線粒體經(jīng)過MaFGF+UTMD干預(yù)，出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，與心肌SOD 與MDA 檢測(cè)結(jié)果相符，更加證實(shí)了MaFGF 使阿霉素所致氧化應(yīng)激反應(yīng)受抑的機(jī)制可能為抑制ROS 靶向刺激線粒體膜。經(jīng)Masson 膠原染色發(fā)現(xiàn)，HF 模型組大鼠心肌間與血管附近含膠原纖維量大幅上升，可見阿霉素心肌毒性能夠?qū)е滦募￠g質(zhì)與血管周圍纖維化的發(fā)生，經(jīng)過MaFGF+UTMD 干預(yù)，心肌膠原統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，CVF 與PVCA/LA 明顯下降。

綜上所述，本研究證實(shí)阿霉素心肌毒性能夠明顯提高心肌氧化應(yīng)激水平，使得心衰大鼠產(chǎn)生明顯心肌纖維化現(xiàn)象，而心肌纖維化可導(dǎo)致心室壁僵硬，順應(yīng)性減弱，心室腔明顯擴(kuò)大，由此導(dǎo)致心功能明顯減低。MaFGF 具備抗氧化應(yīng)激功能[3，11]，攜載MaFGF 的超聲微泡與UTMD 技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，能夠?qū)Π⒚顾卣T導(dǎo)的心肌損傷發(fā)揮積極的防治作用，對(duì)心衰大鼠左心室收縮功能具有保護(hù)作用，分析其機(jī)制可能與MaFGF 減輕ROS 損傷心肌線粒體膜程度，增強(qiáng)心肌抗氧化功能，使氧化應(yīng)激反應(yīng)受抑并抑制心肌纖維化相關(guān)。