五加皮丙酮提取物殺蟲(chóng)活性的初步研究

張 潔,李雪嬌

(1.咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 儀祉農(nóng)林學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心, 陜西楊凌 712100)

植物在與昆蟲(chóng)長(zhǎng)期共存和進(jìn)化中產(chǎn)生許多次生代謝物[1-3]，這些物質(zhì)可以對(duì)昆蟲(chóng)的不同生長(zhǎng)階段產(chǎn)生拒食、觸殺、抑制發(fā)育等作用[4-5]。植物源殺蟲(chóng)劑就是從天然植物的不同組織中提取有效的活性成分，確定用量用法后，人為加工成可以防治植物蟲(chóng)害的制劑[6]。植物源殺蟲(chóng)劑具有不易產(chǎn)生藥害和抗藥性、作用方式多樣、對(duì)高等動(dòng)物及天敵生物較為安全及原料易得等優(yōu)點(diǎn)[7]，符合目前世界農(nóng)藥的發(fā)展趨勢(shì)，其市場(chǎng)無(wú)疑是廣闊的[8]。西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心研究發(fā)現(xiàn)，多種植物的提取物都具有較高的殺蟲(chóng)活性[9-10]，所以從植物中篩選開(kāi)發(fā)天然的殺蟲(chóng)劑是創(chuàng)制新型農(nóng)藥的有效途徑之一[8,11]。

中國(guó)植物種類(lèi)豐富多樣，具有優(yōu)良的條件研究植物源殺蟲(chóng)劑，據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前中國(guó)現(xiàn)有高等植物約有3萬(wàn)余種，其中包含470余科，3700余屬，居于世界第3位[12]。這其中有毒植物達(dá)到1300余種，而且大部分都具有殺蟲(chóng)或抑菌活性[13]。因此，篩選具有殺蟲(chóng)活性的植物對(duì)研發(fā)植物源殺蟲(chóng)劑具有重要意義。

五加皮為五加科五加屬植物細(xì)柱五加(Acanthopanaxgracilistylus)的根皮，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)五加皮具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗應(yīng)激、解熱、提高免疫力及抗腫瘤的效果[14-17],但目前少有研究五加皮的農(nóng)用功效，也僅有其對(duì)棉紅蜘蛛及蚜蟲(chóng)具有較好的觸殺活性的研究報(bào)道[18]，基于此，本試驗(yàn)采用室內(nèi)測(cè)定方法測(cè)定五加皮丙酮提取物對(duì)小菜蛾(PlutellaxylostellaL.)、粘蟲(chóng)(MythimnaseparateW.)、蚜蟲(chóng)(MyzuspersicaeS.)、酢漿草如葉螨(TetranychinahartiE.)、淡色庫(kù)蚊(Culexpipienspallens)、家蠅(MuscadomesticaL.)和玉米象(Sitophiluszeamais)7種害蟲(chóng)的生物活性，并測(cè)定20%的五加皮乳油制劑對(duì)小菜蛾的田間藥效，為進(jìn)一步研究五加皮的殺蟲(chóng)生物活性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物樣品 細(xì)柱五加于2018年5月采自秦嶺國(guó)家植物園。將其根皮置于室內(nèi)通風(fēng)處陰干， 45 ℃恒溫烘干，粉碎，過(guò)孔徑0. 355 mm篩，25 ℃密封，備用。

1.1.2 供試?yán)ハx(chóng) 小菜蛾(PlutellaxylostellaL.)于室內(nèi)(飼養(yǎng)要求相對(duì)濕度70%±5%，溫度25±1 ℃，光暗周期12 L∶12 D，以下各試蟲(chóng)飼養(yǎng)室內(nèi)條件要求相同)用青菜葉飼養(yǎng)，取健康且大小一致的3齡幼蟲(chóng)供試。

粘蟲(chóng)(MythimnaseparateW.)為咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院養(yǎng)蟲(chóng)室飼養(yǎng)的品系。試驗(yàn)時(shí)選取發(fā)育整齊一致且健康的成蟲(chóng)供試。

玉米象(Sitophiluszeamais)為咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院養(yǎng)蟲(chóng)室飼養(yǎng)的品系。試驗(yàn)時(shí)選擇發(fā)育一致且健康的成蟲(chóng)。用消毒過(guò)的小麥(將小麥置于溫度為85 ℃烘箱內(nèi)消毒1.5 h，將其含水量調(diào)整至 13%±2%喂養(yǎng) 。

淡色庫(kù)蚊(Culexpipienspallens)和家蠅(MuscadomesticaL.)為引種自中國(guó)軍事科學(xué)院，試驗(yàn)時(shí)選取羽化3 d，健康且未接觸過(guò)殺蟲(chóng)劑的 成蟲(chóng)。

桃蚜(MyzuspersicaeS.)采于咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院溫室大棚，試驗(yàn)時(shí)選取健康活潑，大小一致的無(wú)翅成蚜。

酢漿草茹葉螨(TetranychinahartiE.)采于咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院試驗(yàn)基地，試驗(yàn)時(shí)，選取健康活潑的害螨供試。

1.2 方 法

1.2.1 五加皮的提取方法 五加皮采用超聲波提取法提取[19]：按“1.1.1”方法將提取的五加皮細(xì)干粉加入丙酮(五加皮與丙酮比例為1∶10體積比)，每次35 min左右，重復(fù)3次。將提取物過(guò)濾，濾液在55±1 ℃內(nèi)減壓、蒸餾后濃縮得丙酮總浸膏，置于4 ℃的冰箱內(nèi)保存待用。

1.2.2 殺蟲(chóng)活性的測(cè)定 測(cè)定五加皮丙酮提取物對(duì)小菜蛾3齡幼蟲(chóng)及粘蟲(chóng)的拒食及毒殺活性使用小葉碟添加法[20]。將新鮮的且無(wú)病蟲(chóng)害的甘藍(lán)葉用圓形打孔器(直徑1.0 cm)打成小葉碟，放于藥液中浸漬3 s取出，自然晾干后放入直徑為 9 cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿接入10頭饑餓 3～4 h的試蟲(chóng)。每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)10頭試蟲(chóng)，并于處理后的24 h、48 h、72 h分別檢查、記錄結(jié)果，以丙酮處理為對(duì)照。以下式(1)計(jì)算試蟲(chóng)死亡率。

校正死亡率=(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1-對(duì)照組死亡率)×100%

(1)

粘蟲(chóng)成蟲(chóng)于處理后的24 h和48 h分別記錄其取食葉片數(shù)，以下式(2)計(jì)算拒食率。

拒食率=(對(duì)照取食葉碟數(shù)-處理取食葉碟數(shù))/對(duì)照取食葉碟數(shù)×100%

(2)

計(jì)算試蟲(chóng)拒食率采用葉片分級(jí)法[21]。參考分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為零級(jí)：葉片完整，未被試蟲(chóng)取食；Ⅰ級(jí)：葉片上被取食有痕跡，但不明顯；Ⅱ級(jí)：葉片被試蟲(chóng)取食缺刻明顯；Ⅲ級(jí)：葉片被試蟲(chóng)取食超過(guò) 1/3；Ⅳ級(jí)：試蟲(chóng)取食葉片超過(guò)1/2；Ⅴ級(jí)：試蟲(chóng)將葉片取食僅剩殘?jiān)?。待試蟲(chóng)取食完成后，記錄取食等級(jí)，以下式(3)和(4)計(jì)算小菜蛾及粘蟲(chóng)的取食指數(shù)和拒食率。

每蟲(chóng)取食指數(shù)=∑(為害級(jí)別×各級(jí)葉碟數(shù))/(總?cè)~碟數(shù)×最高為害級(jí)別×參試總數(shù))

(3)

拒食率=(對(duì)照取食指數(shù)-處理取食指數(shù))/對(duì)照取食指數(shù)×100%

(4)

采用浸蟲(chóng)浸葉法[22]測(cè)定五加皮丙酮提取物對(duì)蚜蟲(chóng)的毒殺活性。取一定量的丙酮提取物用吐溫-80水溶液稀釋到供試質(zhì)量濃度(50 mg/mL、100 mg/mL)，將蚜蟲(chóng)和供試葉片分別在藥液中浸漬5 s后取出，吸干多余藥液，放置于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿(底部鋪濾紙)中，每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)50頭試蟲(chóng)，于藥液處理后的24 h、48 h、72 h分別檢查記錄結(jié)果，同時(shí)以吐溫-80水溶液作為空白對(duì)照(以下均以此為空白對(duì)照)，計(jì)算校正死亡率。

采用玻片浸漬法[22]測(cè)定五加皮丙酮提取物對(duì)酢醬草茹葉螨的毒殺活性。取一定量的丙酮提取物用吐溫-80水溶液稀釋到供試質(zhì)量濃度(200 mg/mL、100 mg/mL)，將酢醬草茹葉螨放置于玻片上，將玻片在藥液中浸漬5 s后取出，置于吸水紙上迅速吸干多余藥液，每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)50頭，于處理后的24 h、48 h、72 h分別檢查記錄結(jié)果，計(jì)算校正死亡率。

采用浸液法[20]測(cè)定五加皮丙酮提取物對(duì)淡色庫(kù)蚊的毒殺活性。取一定量的丙酮提取物用吐溫-80水溶液稀釋到供試質(zhì)量濃度(1 mg/mL、 5 mg/mL、2.5 mg/mL)。每重復(fù)引入供試的淡色庫(kù)蚊20頭，每處理重復(fù)3次，于處理后的24 h、48 h、72 h分別檢查結(jié)果，計(jì)算校正死亡率。

采用點(diǎn)滴法[20]測(cè)定五加皮丙酮提取物對(duì)玉米象成蟲(chóng)、家蠅成蟲(chóng)的毒殺活性。用微量點(diǎn)滴儀將所需的不同質(zhì)量濃度的藥液點(diǎn)滴于家蠅成蟲(chóng)的前胸背板(每頭用量為0.125、0.25、0.5、1 mg)；玉米象成蟲(chóng)的腹面(每頭用量為0.125、0.25、 0.5、1 mg)。每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)30頭供試?yán)ハx(chóng)，于處理后的24 h、48 h分別檢查結(jié)果，并以點(diǎn)滴同等量的丙酮作為空白對(duì)照，計(jì)算校正死亡率。

上述試蟲(chóng)處理后均放于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)觀察(相對(duì)濕度70%±5%，溫度25±1 ℃，光暗周期12 L∶12 D)。

1.2.3 田間藥效試驗(yàn) 配制20%的五加皮乳油用于田間藥效試驗(yàn)，配方為20%五加皮丙酮提取物+70%丙酮+10%吐溫-80。使用時(shí)用清水分別稀釋200、400和600倍液噴施，以1.8%阿維菌素乳油稀釋4 500倍(有效成分質(zhì)量濃度為 4 mg/L)作藥劑對(duì)照，以清水為空白對(duì)照，共5個(gè)處理，噴藥劑量為60 L/667m2，每處理重復(fù)4次，試驗(yàn)共設(shè)20個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積為10 m2，隨機(jī)區(qū)組排列。于小菜蛾發(fā)生危害初期噴藥防治1次，用手動(dòng)噴霧器噴霧，以葉片濕潤(rùn)為度。每小區(qū)內(nèi)連續(xù)選擇10株白菜苗分別于施藥前和施藥后定期、定株檢查活蟲(chóng)數(shù)(不分蟲(chóng)齡)，按下列公式計(jì)算防治效果。

防治效果=1-(對(duì)照區(qū)施藥前活蟲(chóng)數(shù)×處理區(qū)施藥后活蟲(chóng)數(shù))/(對(duì)照區(qū)施藥后活蟲(chóng)數(shù)×處理區(qū)施藥前活蟲(chóng)數(shù))×100%

(5)

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件的機(jī)率值分析法求出AFC50、LC50及95%的置信限，采用Duncan’s新復(fù)極差法(P=0.05)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 五加皮丙酮提取物對(duì)7種害蟲(chóng)的拒食及觸殺活性測(cè)定結(jié)果

根據(jù)“1.2.2”中的測(cè)定方法測(cè)定五加皮丙酮提取物對(duì)7種害蟲(chóng)的拒食活性及觸殺活性，結(jié)果見(jiàn)表1～表4。

表1 五加皮丙酮提取物對(duì)粘蟲(chóng)和小菜蛾3齡幼蟲(chóng)的拒食活性Table 1 Antifeedant of acetone extracts against from Acanthopanar gracilistylus of Mythimna separate W. and 3rd larva of Plutella xylostella L.

Note:If measured equationχ2is less than the value, the equation is in line with reality(The same as table 2).

表2 五加皮丙酮提取物對(duì)粘蟲(chóng)及小菜蛾3齡幼蟲(chóng)的觸殺活性Table 2 Poisoning activity of acetone extracts from A.gracilistylus against 3rd larva of Mythimna separate W. and P.xylostella L.

由表1可見(jiàn)，小菜蛾3齡幼蟲(chóng)在藥劑處理 24 h和48 h時(shí)，拒食中濃度分別為9.89 mg/mL和4.32 mg/mL，證明五加皮丙酮提取物對(duì)小菜蛾具有較強(qiáng)的拒食活性。

從表2可見(jiàn)，粘蟲(chóng)成蟲(chóng)及小菜蛾3齡幼蟲(chóng)的致死中濃度在72 h時(shí)低于48 h，表明藥劑對(duì)供試?yán)ハx(chóng)的毒殺活性隨著時(shí)間的增加明顯升高；在處理48 h后，小菜蛾3齡幼蟲(chóng)和粘蟲(chóng)成蟲(chóng)的致死中濃度分別為77.52 mg/mL、15.32 mg/mL，表明五加皮丙酮提取物對(duì)小菜蛾3齡幼蟲(chóng)的觸殺活性高于粘蟲(chóng)成蟲(chóng)。

由表3可見(jiàn)，五加皮丙酮提取物在質(zhì)量濃度為200 mg/mL ，24 h時(shí)對(duì)酢醬草茹葉螨的毒殺率為(61.71±1.32)%，觸殺活性較強(qiáng)，48 h、72 h時(shí)毒殺活性呈下降趨勢(shì)；對(duì)淡色庫(kù)蚊成蟲(chóng)觸殺活性較強(qiáng)，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的升高，死亡率增高，在質(zhì)量濃度為5 mg/mL，時(shí)間為72 h時(shí)，淡色庫(kù)蚊的死亡率為(89.23±0.22)%。

由表4可見(jiàn)，五加皮丙酮提取物在每頭用量為1 mg，玉米象和家蠅48 h的死亡率分別為(18.17± 0.65)%和(10.02±1.32)%，證明五加皮丙酮提取物對(duì)玉米象成蟲(chóng)和家蠅成蟲(chóng)具有一定的觸殺活性，但效果不明顯。

2.2 大田藥效試驗(yàn)結(jié)果

表5結(jié)果表明，20%的五加皮乳油的200倍和400倍稀釋液噴施后3 d防治效果分別為 70.23%和51.35%；7 d后防治效果分別達(dá) 65.42%和42.47%，其中200倍稀釋液與對(duì)照藥劑阿維菌素4 500倍稀釋液的藥效無(wú)顯著差異，對(duì)于防治白菜上的小菜蛾具有較好的效果；600倍的20%五加皮乳油防治小菜蛾效果不顯著(試驗(yàn)期間未觀察到本試驗(yàn)所用處理藥液對(duì)白菜的生長(zhǎng)有不良影響)。

表3 五加皮丙酮提取物對(duì)蚜蟲(chóng)、酢醬草茹葉螨和淡色庫(kù)蚊的觸殺活性Table 3 Toxic of acetone extracts from A.gracilistylus of T.hani,M.persicae and Culex pipiens pallens

注：“-”表示未有試驗(yàn)結(jié)果，以下各表標(biāo)注均同。表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的“平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差”(表4同)。

Note:“-” no test result，the same as following tables.Data represent “means ± standard deviation” of the 3 measurement in the table(The same as table 4).

表4 五加皮丙酮提取物對(duì)玉米象和家蠅成蟲(chóng)的觸殺活性Table 4 Toxic of acetone extracts from A.gracilistylus against S.zeamais and M.domestica

表5 20%的五加皮乳油對(duì)白菜上小菜蛾的田間防治效果Table 5 The results of field trials of 20% A.gracilistylus EC against P.xylostella in cabbages

注：表中數(shù)值為4次重復(fù)的平均值。

Note:The data in the table are the average of 4 replicates.

3 討 論

通過(guò)對(duì)五加皮丙酮提取物殺蟲(chóng)活性研究發(fā)現(xiàn)，藥劑處理24 h和48 h時(shí)，小菜蛾3齡幼蟲(chóng)的AFC50分別為9.89 mg/mL和4.32 mg/mL，在藥劑處理48 h后，小菜蛾3齡幼蟲(chóng)的LC50為 77.51 mg/mL，證明五加皮丙酮提取物對(duì)其具有較強(qiáng)的拒食活性和觸殺活性；在藥劑處理24 h時(shí)對(duì)酢醬草茹葉螨的毒殺率為(61.71±1.32)%，在藥劑處理72 h時(shí)，淡色庫(kù)蚊的死亡率為(89.23±0.22)%，證明其對(duì)酢醬草茹葉螨害螨、淡色庫(kù)蚊成蟲(chóng)均有較好的觸殺活性；田間藥效試驗(yàn)結(jié)果表明，20%的五加皮乳油的200倍和400倍稀釋液噴施后3d防治效果分別為70.23%和51.35%；證明20%五加皮乳油200倍稀釋液對(duì)白菜上小菜蛾具有較強(qiáng)的防治效果。

近年來(lái)，由于化學(xué)類(lèi)殺蟲(chóng)劑的大量不理性使用，使得許多害蟲(chóng)產(chǎn)生了抗藥性，如何在害蟲(chóng)防治上降低其抗藥性成為研究的熱點(diǎn)[23-24]。五加皮屬天然植物，其丙酮提取物具有較好的拒食及觸殺活性，且低毒，易降解，不易產(chǎn)生抗藥性。五加皮在醫(yī)學(xué)中因其作用方式多樣，作用譜廣，越來(lái)越受到重視[25]，但目前其在農(nóng)用功效方面研究較少，具有一定開(kāi)發(fā)空間。

4 結(jié) 論

五加皮丙酮提取物對(duì)小菜蛾3齡幼蟲(chóng)具有較好的拒食及觸殺活性；對(duì)酢醬草茹葉螨、淡色庫(kù)蚊、粘蟲(chóng)3齡幼蟲(chóng)均表現(xiàn)出觸殺活性；20%五加皮乳油對(duì)白菜上小菜蛾具有良好的防治效果，有望研發(fā)為新型的植物源殺蟲(chóng)劑。

但本試驗(yàn)對(duì)五加皮丙酮提取物只進(jìn)行了初步的殺蟲(chóng)活性研究，且五加皮在中國(guó)西北地區(qū)資源豐富，對(duì)害蟲(chóng)作用方式多樣，所以還需進(jìn)一步研究其活性成分及作用機(jī)理，以期為其開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。