黑葉不結(jié)球白菜耐熱性的抗氧化指標(biāo)評估體系的構(gòu)建

趙思涵，田麗波，商 桑，楊 衍，鄒凱茜，曾麗萍，劉子記，劉昭華

(1.海南大學(xué) 園藝學(xué)院/海南省熱帶園藝作物品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228；2.海南大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)院，海口 570228；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，海南儋州 571737)

利用熱害指數(shù)進(jìn)行耐熱性鑒定，過程復(fù)雜漫長，試驗(yàn)過程中容易受到各種主觀、客觀因素影響，造成結(jié)果不夠準(zhǔn)確。胡俏強(qiáng)等[7]對普通白菜進(jìn)行37℃/27℃高溫處理，在前3d各品種間熱害指數(shù)差異不顯著，無法區(qū)分耐熱品種，到第7天可區(qū)分部分熱敏與耐熱品種，對普通白菜只進(jìn)行高溫處理耐熱性強(qiáng)弱難以區(qū)分。植物的耐熱性是多基因控制的數(shù)量性狀，高溫脅迫下會(huì)涉及多個(gè)生理生化變化，可引起植物膜脂過氧化作用，導(dǎo)致植物細(xì)胞破壞或細(xì)胞死亡，植物內(nèi)源保護(hù)系統(tǒng)的抗氧化能力及生物膜的穩(wěn)定性對植物逆境脅迫響應(yīng)至關(guān)重要[8]。采用單一指標(biāo)，不足以反映出植物的耐熱性差異，根據(jù)植物對熱脅迫的抗氧化指標(biāo)的響應(yīng)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析可對植物耐熱性進(jìn)行全面準(zhǔn)確的評價(jià)。

近年來，已有多篇文章利用多元統(tǒng)計(jì)分析法對植物生物脅迫和非生物脅迫抗性進(jìn)行綜合評價(jià)，該方法已得到廣泛應(yīng)用，如在黃瓜[8]、萬壽菊[9]、大豆[10]、棉花[11]等植物抗逆性鑒定表現(xiàn)優(yōu)良。本試驗(yàn)以13個(gè)黑葉不結(jié)球白菜品種為試材，測定37℃/27℃高溫脅迫下黑葉不結(jié)球白菜的12個(gè)抗氧化指標(biāo)，運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)方法，分析各影響因素的作用及相互之間的關(guān)系，構(gòu)建黑葉不結(jié)球白菜耐熱性抗氧化指標(biāo)評估體系，對黑葉不結(jié)球白菜主要栽培品種的耐熱性強(qiáng)弱進(jìn)行分類，使黑葉不結(jié)球白菜耐熱性鑒定直觀、簡便和準(zhǔn)確，為耐熱黑葉不結(jié)球白菜品種選育、鑒定耐熱品種的遺傳多樣性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試黑葉不結(jié)球白菜品種13份購于各種子公司，見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培育幼苗及溫度處理 選取飽滿、整齊一致的種子，溫湯浸種，20 ℃下催芽，60%露白時(shí)播種于50孔育苗穴盤，一穴一粒。兩片子葉展開后移栽至8 cm×10 cm黑色育苗缽?；|(zhì)配方是體積比1∶1∶1的泥炭、蛭石和珍珠巖，常規(guī)管理。當(dāng)幼苗長至4～5片真葉時(shí)，在人工氣候箱中預(yù)處理2 d，溫度為25 ℃/18 ℃，光強(qiáng)為300 μmol /(m2·s)、光周期為晝夜12 h /12 h，相對濕度控制在70%～80%。然后進(jìn)行高溫脅迫 37 ℃/27 ℃處理，高溫處理5 d，對照處理為 25 ℃/18 ℃，其余條件同上。每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)18株，隨機(jī)區(qū)組排列。處理5 d后，測定各項(xiàng)形態(tài)及抗氧化指標(biāo)。

表1 供試的黑葉不結(jié)球白菜品種Table 1 Non-heading Chinese cabbage varieties tested

1.2.2 測定項(xiàng)目及方法 熱害指數(shù)(Heat injury index,HII)的測定參考2014江蘇省耐熱小白菜鑒定實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)[4]、劉維信等[6]和胡俏強(qiáng)等[7]的方法，略有改動(dòng)，每天進(jìn)行觀察，根據(jù)葉片反卷及褪綠，確定分級標(biāo)準(zhǔn)。熱害指數(shù)小則材料耐熱性強(qiáng)。

熱害指數(shù)=∑(各級株數(shù)×級數(shù))/(最高級 數(shù)×調(diào)查總株數(shù))×100%

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 除熱害指數(shù)外，對其他12個(gè)指標(biāo)計(jì)算耐熱系數(shù)。用 SAS 9.2 軟件對所有指標(biāo)進(jìn)行多元線性相關(guān)性分析、多元逐步線性回歸分析、隸屬函數(shù)分析、主成分分析和多元聚類分析。隸屬函數(shù)分析依照模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)的方法[12]。用 Excel 2010軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行 整理。

本文探討了環(huán)偶極子超材料的研究和發(fā)展現(xiàn)狀，環(huán)偶極子獨(dú)特電磁特性能與太赫茲波特性相結(jié)合，必產(chǎn)生一系列獨(dú)特的物理現(xiàn)象。太赫茲頻段環(huán)偶極子超材料可以緩解太赫茲波段器件缺少的現(xiàn)象，可實(shí)現(xiàn)對太赫茲波進(jìn)行調(diào)控、濾波、開關(guān)和延時(shí)等操控，可用于制備傳感器、調(diào)節(jié)器、切倫科夫計(jì)數(shù)器等太赫茲先進(jìn)器件。

耐熱系數(shù)=處理測定值/對照測定值

各綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)值：μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)j=1,2,…,n

各綜合指標(biāo)的權(quán)重：Wj=Pj/∑Pjj=1,2,…,n

綜合耐熱評價(jià)：D=∑[μ(Xj)×Wj]j=1,2,…,n

式中，Xj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)；Xmin表示第j個(gè)綜合指標(biāo)的最小值；Xmax表示第j個(gè)綜合指標(biāo)的最大值。Wj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)在所有指標(biāo)中的重要程度即權(quán)重；Pj為各自交系第j個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。D值表示各高代自交系在高溫脅迫下由綜合指標(biāo)評價(jià)所得的耐熱性綜合評價(jià)值。對D值進(jìn)行聚類分析，并對D值與耐熱系數(shù)進(jìn)行逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑葉不結(jié)球白菜各指標(biāo)的方差分析和相關(guān)性分析

由表2可知，黑葉不結(jié)球白菜品種經(jīng)高溫處理后，其APX、GR、MDA、ASA、PAL、PPO、POD、SOD、CAT的耐熱系數(shù)平均值均大于1，說明高溫脅迫對上述9個(gè)指標(biāo)均呈正向效應(yīng)。除APX、POD外其余指標(biāo)均表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)，說明本試驗(yàn)中的黑葉不結(jié)球白菜品種在耐熱性上具有很好的遺傳多樣性，這11個(gè)指標(biāo)都可以作為黑葉不結(jié)球白菜耐熱性評價(jià)的輔助指標(biāo)。

表2 高溫脅迫下13個(gè)黑葉不結(jié)球白菜品種耐熱系數(shù)及各指標(biāo)多元方差分析Table 2 Heat resistance coefficient of 13 black leaf non-heading Chinese cabbage varieties under high temperature stress and various indexes of multivariate analysis of variance

注：*、**代表不同品種的某個(gè)性狀在0.05或0.01水平具有顯著性差異,下表同。

Note: *,** represents significant difference of certain trait at 0.05 or 0.01 level,the same below.

對各品種的13項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析得出相關(guān)系數(shù)矩陣。從表3可以看出，13個(gè)品種的部分生理指標(biāo)之間存在不同程度相關(guān)性，使得各指標(biāo)間提供的信息存在著明顯的重疊。其中GSH與AsA呈極顯著正相關(guān)，GSH、AsA與MDA和GR呈顯著正相關(guān)，AsA、PAL與PPO呈顯著負(fù)相關(guān)，APX與H2O2和 呈顯著負(fù)相關(guān)， 與H2O2呈顯著正相關(guān)， 與CAT呈顯著正相關(guān)，PAL與POD呈極顯著負(fù)相關(guān)，與PPO呈顯著負(fù)相關(guān)，H2O2、SOD與熱害指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，說明在高溫脅迫下，黑葉不結(jié)球白菜的各抗氧化指標(biāo)之間存在一定的協(xié)同性和拮抗性，抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)協(xié)同清除 ，避免H2O2的過量積累，從而減少高溫脅迫對膜系統(tǒng)的傷害。不同指標(biāo)在熱脅迫下反應(yīng)不同，說明不結(jié)球白菜的耐熱性較為復(fù)雜，單項(xiàng)指標(biāo)難以準(zhǔn)確客觀地反映不結(jié)球白菜品種對高溫的耐熱性差異，因此，構(gòu)建復(fù)合指標(biāo)評估體系，采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法對各指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)以彌補(bǔ)單項(xiàng)指標(biāo)鑒定的局限性是非常有必 要的。

表3 黑葉不結(jié)球白菜各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 3 Correlation coefficient matrix of different indexes about black leaf non-heading Chinese cabbage

注：*、**代表各指標(biāo)在0.05或0.01水平上的相關(guān)性。

Note: *,** represents significant correlate at 0.05 and 0.01 level.

2.2 主成分分析

通過計(jì)算各抗氧化指標(biāo)的耐熱系數(shù)與主因子系數(shù)，得到每個(gè)品種的4個(gè)主因子得分值。說明該品種在這一主因子上的耐熱性強(qiáng)則CI值大，反之耐熱性弱。由表5可以看出，B12和B1在主因子1上的耐熱性最強(qiáng)，B8主因子2 上的耐熱性最強(qiáng)，B20在主子3上的耐熱性最強(qiáng)，B21在主因子4上的耐熱性最強(qiáng)。

2.3 隸屬函數(shù)分析

利用主因子貢獻(xiàn)率計(jì)算各主因子的權(quán)重(Wj)。由表6可以看出，主因子1的權(quán)重最大。在黑葉不結(jié)球白菜耐熱性評價(jià)中4個(gè)主因子的作用不同，將CI(j)值利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行轉(zhuǎn)換，得到各品種的隸屬函數(shù)值μ(j)和綜合評價(jià)值(D)，根據(jù)D值評價(jià)各品種的耐熱性。13個(gè)黑葉不結(jié)球白菜品種的耐熱性強(qiáng)弱依次為:B12>B14>B19>B1>B16>B2>B21>B18>B8>B10> B9>B20>B15。

2.4 聚類分析

采用系統(tǒng)聚類(Hierarchical clustering ) 中的最長距離法(Furthest neighbor) ，以歐氏距離(Euclidean distance) 為遺傳距離進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖 1，在歐式距離為0.73時(shí)，可劃分為4類。第Ⅰ類(強(qiáng)耐熱品種)包括3個(gè)品種，B12、B14、和B19，第Ⅱ類(耐熱品種)包括3個(gè)品種，B16、B2和B1，第Ⅲ類(不耐熱品種)包括4個(gè)品種，B21、B18、B8和B10，第Ⅳ類(熱敏感品種)包括3個(gè)品種，B9、B20和B15。

表4 各綜合指標(biāo)的系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 4 Coefficients of comprehensive indexes and proportion

表5 13個(gè)黑葉不結(jié)球白菜的4個(gè)主因子得分值Table 5 Scores of main four factors of black leaf non-heading Chinese cabbage

2.5 綜合評價(jià)及分類

分析13個(gè)參評性狀與不同品種之間的耐熱性關(guān)系，篩選能夠客觀鑒定黑葉不結(jié)球白菜耐熱性的指標(biāo)，建立數(shù)學(xué)模型用于黑葉不結(jié)球白菜種質(zhì)耐熱性評價(jià)，將耐熱性綜合評價(jià)值(D值) 作為因變量，各單項(xiàng)指標(biāo)的耐熱性數(shù)據(jù)作為自變量進(jìn)行逐步回歸分析，建立最優(yōu)回歸方程D= 0.019 76+0.623 98AsA+0.152 92H2O2- 0.142 79SOD-0.214 34PPO，方程決定系數(shù)R2=0.925 4，P< 0.000 1。由此方程可知，13個(gè)參評性狀中有4個(gè)性狀對黑葉不結(jié)球白菜耐熱性的鑒定有顯著性影響，分別是抗壞血酸過氧化物酶活性、過氧化氫、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶。

3 討論與結(jié)論

植物耐熱性受多種因素影響，需要綜合多項(xiàng)指標(biāo)分析各品種間的耐熱性。多元統(tǒng)計(jì)方法將高維問題轉(zhuǎn)換成低維問題加以處理，使定量評價(jià)、鑒定變得相對簡單、直觀，并通過有效分類方法將評價(jià)對象定性劃分成不同類別[14]。其中主成分分析方法解決了綜合變量覆蓋和降維問題，將多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為綜合指標(biāo)，仍然可以盡量反映原來變量的信息量。本試驗(yàn)采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法包括方差分析、相關(guān)性分析、主成分分析、聚類分析實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)對象集合的聚類歸約，使結(jié)果更為科學(xué)合理[5,12]。

在高溫脅迫條件下，植物受到傷害主要是細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)導(dǎo)致生物膜過氧化作用[15-18]。植物細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶(SOD、POD、CAT、APX)和抗氧化物質(zhì)(AsA、GSH)在高溫下形成植物酶促防御系統(tǒng)，整體含量先增加后降低，個(gè)別指標(biāo)表現(xiàn)為持續(xù)性連續(xù)下降的變化[18-22]。PPO作為內(nèi)源呼吸酶在植物氧化酶系中，與植物的代謝強(qiáng)度及環(huán)境脅迫密切相關(guān)。葉陳亮等[23]對大白菜的研究表明，耐熱性強(qiáng)的品種SOD活性高于耐熱性弱的品種。在高溫脅迫過程中誘發(fā)植物細(xì)胞內(nèi)以H2O2為代表的活性氧水平的增加而導(dǎo)致氧化脅迫[22-25]。在本試驗(yàn)中SOD與熱害指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)， 與H2O2呈顯著正相關(guān)與在大白菜上的研究結(jié)果相似。作為植物抗氧化劑的AsA，可直接清除羥基自由基、超氧自由基，通過 AsA-GSH循環(huán)，精密調(diào)控植物細(xì)胞中的 H2O2等，AsA-GSH循環(huán)控制在細(xì)胞可行使信號傳導(dǎo)的和逆境脅迫應(yīng)答及適應(yīng)的生理水平[26-29]，本試驗(yàn)中GSH與AsA呈極顯著正相關(guān)，GSH、AsA與MDA和GR呈顯著正相關(guān)。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，高溫脅迫下黑葉不結(jié)球白菜MDA 含量增加，說明高溫脅迫使黑葉不結(jié)球白菜細(xì)胞膜脂過氧化作用增強(qiáng)，SOD、POD活性呈升高的變化趨勢，AsA含量總體也呈上升趨勢，說明高溫脅迫下黑葉不結(jié)球白菜可通過提高SOD和POD酶的活性來清除自由基，起到一定的抗氧化保護(hù)作用，ASA可增強(qiáng)黑葉不結(jié)球白菜的抗氧化脅迫能力，它們構(gòu)成了黑葉不結(jié)球白菜適應(yīng)高溫逆境的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。即SOD、POD、PPO和H2O2與黑葉不結(jié)球白菜的耐熱性有一定的關(guān)系[30-32]。

表6 13個(gè)品種隸屬函數(shù)μ(j)值和耐熱排名Table 6 Value of membership function μ(j) of 13 varieties and ranking of heat-tolerance

圖1 13份黑葉不結(jié)球白菜種質(zhì)耐熱性的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of heat tolerance of 13 black cabbage non-heading Chinese cabbage

研究高溫脅迫下植物抗氧化指標(biāo)的響應(yīng)，挖掘與耐熱性相關(guān)的鑒定指標(biāo)，構(gòu)建黑葉不結(jié)球白菜耐熱性抗氧化指標(biāo)評估體系，對黑葉不結(jié)球白菜耐熱性品種選育和為生產(chǎn)推薦優(yōu)良品種具有重要意義。本研究通過多元統(tǒng)計(jì)分析，最終發(fā)現(xiàn)編號為B12的“中腳葵扇黑葉匙羹白”、編號為B14的“玉兔雜交黑葉白菜”和編號為B19的“北京黑葉白”，在13個(gè)黑葉不結(jié)球白菜品種中的耐熱性最好，綜合性狀表現(xiàn)較優(yōu)，與田間觀察結(jié)果基本一致，但在各品種的耐熱排序上不完全相同，所以采用多元分析方法綜合鑒定，避免淘汰耐熱優(yōu)良 品種。