金花茶組植物葉解剖結(jié)構(gòu)特征與抗旱性的關(guān)系

王 坤，韋曉娟，李寶財，李開祥，馬錦林

（廣西林業(yè)科學(xué)研究院 廣西特色經(jīng)濟林培育與利用重點實驗室，廣西 南寧 530002）

金花茶組植物Camelliasect.Chrysantha是世界上稀有的珍稀植物[1]，因其金黃花朵在山茶科植物中別具一格，觀賞性極高，具有很大的市場開發(fā)潛力[2-3]。二十世紀六十年代初被首次發(fā)現(xiàn)，引起了各個領(lǐng)域?qū)＜业年P(guān)注，其有“植物界的大熊貓”“植物活化石”等美名[1]。金花茶適宜生長在溫暖、蔭涼和潮濕環(huán)境，目前為林下經(jīng)濟發(fā)展的重要樹種[4]。

抗旱性是植物對自然界干旱環(huán)境適應(yīng)的一種遺傳特性，由多基因控制[5]。植物在生理生化方面的差異性是長期適應(yīng)生長環(huán)境的變異結(jié)果，短期內(nèi)生長環(huán)境因子的改變不會影響其生理生化指標[6]，葉片作為與外界環(huán)境緊密接觸的重要器官，主管植物的光合作用和呼吸作用，其組織結(jié)構(gòu)最易受到環(huán)境因子的影響，同時也最能體現(xiàn)植物對環(huán)境條件的適應(yīng)性，因此，在植物的抗旱性研究中，葉解剖結(jié)構(gòu)特征常被作為重要的參考指標。目前關(guān)于葉片形態(tài)特征與抗逆性的關(guān)系已受到很多學(xué)者關(guān)注[7-9]，研究表明，抗旱性較強的植物品種具有葉片厚度和柵欄組織厚度較大、柵欄組織厚度/海綿組織厚度比值高、氣孔密度高等特性[7-9]。目前對于金花茶的研究多為栽培繁育[10]、活性成分分析[11-12]、光合特性[13-14]，及環(huán)境脅迫對金花茶幼苗的影響[15-16]等方面，對不同金花茶品種的葉片解剖結(jié)構(gòu)對比及抗旱性分析未見文獻記載，因此，本研究選取廣西本地金花茶與越南引種金花茶共8 個品種，對其葉解剖結(jié)構(gòu)進行觀測，綜合評價其抗旱性，為金花茶的進一步引種栽培提供理論依據(jù)，并通過相關(guān)培育技術(shù)的引進，補充我國金花茶種質(zhì)資源，豐富新品種繁育材料，建立金花茶高效栽培技術(shù)和模式。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

8 種金花茶組植物栽培在廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院油茶種質(zhì)資源庫山茶苗木培育基地，3年生扦插苗。其中4 種越南金花茶（塔姆島金花茶、箱田金花茶、羅斯曼金花茶、多毛金花茶）于2015年7月引自越南塔姆島國家自然保護區(qū)，4 種廣西本地金花茶（普通金花茶、顯脈金花茶、凹脈金花茶、小花金花茶）來自廣西林科院油茶種質(zhì)資源庫山茶苗木培育基地（表1）。于2017年6月30日采集8 種金花茶植物2年生葉進行試驗。

表1 試驗材料信息Table1 Information of experimental materials

1.2 試驗方法

1.2.1 解剖學(xué)結(jié)構(gòu)分析

避開葉片的主脈和邊緣，取中間部位徒手用雙面刀片進行組織切片，用光學(xué)顯微鏡（Leica DM 2500，Germany）對葉片橫切的切片進行觀察，橫切時避開主脈，對葉片各解剖結(jié)構(gòu)特征值（葉片厚度、上表皮、柵欄組織、海綿組織和下表皮）進行測定。

每個品種選取5 張葉片，每個葉片選取6 個視野，在每片葉片相同位置的主脈，用雙面刀片對其進行徒手切片，選取完整、薄厚適中的切片，甲基藍染色后晾干，制成臨時裝片，用顯微鏡（Leica DM 2500，Germany）在40 倍鏡下進行觀測，并選取清晰視野拍攝圖片。用ImageJ 測量導(dǎo)管的長軸和短軸直徑，其中導(dǎo)管直徑計算公式為：

式（1）中，Vd 為導(dǎo)管直徑，a及b分別指導(dǎo)管的長短軸半徑。

1.2.2 氣孔特征的觀測

使用指甲油印記法，用無色指甲油涂在葉片的下表皮中部，等指甲油干后，用透明膠帶將指甲油撕下，直接貼在載玻片上，然后用顯微鏡（Leica DM 2500，Germany）在40 倍鏡下進行觀測并拍攝圖片。用ImageJ 圖形處理軟件處理圖片，統(tǒng)計視野內(nèi)的所有氣孔個數(shù)，測量保衛(wèi)細胞縱軸長和橫軸長。計算氣孔密度（SD）及氣孔指數(shù)（SI）。氣孔指數(shù)=氣孔密度/（氣孔密度+表皮細胞密度）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010 軟件對試驗結(jié)果進行初步分析，利用SPSS 19.0 統(tǒng)計進行Duncan 多重比較、方差分析和主成分分析，采用模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)法對金花茶組植物葉片的各個參數(shù)指標進行綜合評價。隸屬函數(shù)值的計算公式為[17]：

式（2）中xi為指標測定值，xmax、xmin為所有測定材料某一指標的最大值和最小值。若某一指標與植物抗旱性之間呈負相關(guān)，則利用反隸屬函數(shù)進行計算，其計算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微結(jié)構(gòu)對比分析

從表2可見，塔姆島金花茶的葉片厚度最大為422.95 μm，與其他金花茶葉片厚度具有顯著差異性（P＜0.05），普通金花茶和顯脈金花茶葉片厚度僅次于塔姆島金花茶，分別為323.87、329.41 μm，凹脈金花茶的葉片厚度最低，為189.20 μm，比塔姆島金花茶降低了55.27%，相比塔姆島金花茶，羅斯曼金花茶、箱田金花茶、多毛金花茶、小花金花茶的葉片厚度，分別降低了37.03%、37.10%、39.85%、34.21%。上表皮厚度和小表皮厚度的數(shù)據(jù)顯示，普通金花茶的上表皮和下表皮厚度值最大，分別為34.27 和26.25 μm，凹脈金花茶上下表皮值最小，比普通金花茶降低了49.49%、42.02%；4 種越南金花茶與廣西本地金花茶中的小花金花茶和顯脈金花茶的上下表皮細胞厚度值無明顯差異性。箱田金花茶和多毛金花茶的中脈導(dǎo)管直徑值最大，分別為30.02 和33.84μm，越南金花茶中的羅斯曼金花茶和4 種廣西本地金花茶的中脈導(dǎo)管直徑差異性不大。越南金花茶中的塔姆島金花茶、箱田金花茶和多毛金花茶的柵欄組織層數(shù)為1 層，羅斯曼金花茶和4 種廣西本地金花茶的柵欄組織層數(shù)均為2 層（圖1）。

表2 8 種金花茶組植物葉解剖結(jié)構(gòu)（n=30）?Table2 Anatomical structure of eight species of Camellia sect.Chrysantha leaves (n=30)

圖1 8 種金花茶組植物成熟葉片橫切面Fig.1 Cross section of eight species of Camellia sect.Chrysantha leaves

8 種金花茶組植物的柵欄組織厚度和海綿組織厚度數(shù)據(jù)見表3，普通金花茶的柵欄組織厚度值最大為86.97 μm，羅斯曼金花茶、箱田金花茶、小花金花茶和顯脈金花茶的柵欄組織厚度值次之，分別為73.04、70.17、72.06 和73.16 μm，他們之間差異性不顯著，相比普通金花茶，塔姆島金花茶、多毛金花茶的柵欄組織厚度降低了38.12%、39.13%，凹脈金花茶的柵欄組織厚度最小，為42.06 μm。8 種金花茶組植物第一層?xùn)艡诮M織高度和寬度值差異顯著（P＜0.05），塔姆島金花茶和普通金花茶的第一層?xùn)艡诮M織高度值最大分別為47.55、 48.10 μm，凹脈金花茶第一層?xùn)艡诮M織高度值最小，比普通金花茶降低了38.15%，箱田金花茶和多毛金花茶第一層?xùn)艡诮M織寬度值最大，分別為15.19、15.82 μm，凹脈金花茶的第一層?xùn)艡诮M織寬度值最小，為12.20 μm。越南金花茶中只有羅斯曼柵欄組織層數(shù)為2 層，普通金花茶的第二層?xùn)艡诮M織高度值最大，為37.87 μm，凹脈金花茶的第二層?xùn)艡诮M織高度值最小，為23.19 μm，其他金花茶的第二層?xùn)艡诮M織高度值差異不顯著（P＞0.05），凹脈金花茶的第二層?xùn)艡诮M織寬度值也最小，為14.02 μm，其他金花茶組植物差異不顯著（P＞0.05）。塔姆島金花茶海綿組織厚度值最大，為319.70 μm，顯脈金花茶次之，為203.48 μm，凹脈金花茶海綿組織厚度值最小，為103.42 μm，相比塔姆島金花茶降低了67.65%，與塔姆島金花茶相比羅斯曼金花茶、箱田金花茶、多毛金花茶、小花金花茶、普通金花茶分別 降低了52.74%、54.89%、47.62%、51.01%、44.84%，這5種金花茶之間差異不顯著（P＞0.05）。通過表5可見柵欄組織厚度/海綿組織厚度的比值具有顯著差異性，羅斯曼金花茶、箱田金花茶、小花金花茶、普通金花茶、凹脈金花茶的柵海比最大，在0.5 左右，塔姆島金花茶、多毛金花茶的柵海比最小，分別為0.17、0.25。

表3 8 種金花茶組植物葉解剖結(jié)構(gòu)（n=30）Table3 Anatomical structure of eight species of Camellia sect.Chrysantha leaves (n=30)

2.2 氣孔特征對比分析

8 種金花茶組植物的葉片氣孔發(fā)育特征見表4。氣孔密度值最大的普通金花茶、塔姆島金花茶、羅斯曼金花茶，分別為105.48、101.89、 98.20 個/mm2，最小值為小花金花茶和凹脈金花茶分別為67.29、66.17 個/mm2，具有顯著差異性 （P＜0.05）。氣孔縱軸長和橫軸長最大值均為普通金花茶為19.21、23.91 μm，最小值均為凹脈金花茶為10.28、11.21 μm。除了凹脈金花茶，其他金花茶品種之間的氣孔指數(shù)值差異不顯著 （P＞0.05），凹脈金花茶氣孔指數(shù)值最小為0.11，其他金花茶的氣孔指數(shù)均在0.2 左右。

表4 8 種金花茶組植物氣孔發(fā)育特征（n=30）Table4 Stomata growth of eight species of Camellia sect.Chrysantha leaves (n=30)

2.3 主成分分析

各主成分的得分系數(shù)矩陣、貢獻率及累積貢獻率見表5，我們以特征值大于1.0 為標準，得到3 個主成分，這3 個主成分的累積貢獻率為90.437%，可以代表8種金花茶組植物8 個指標90.437% 的綜合信息，符合我們進行主成分分析的目的。各主成分系數(shù)絕對值較大的指標可以作為評價樹種抗旱性的重要依據(jù)[18]。第一主成分中葉片厚度系數(shù)最大，下表皮厚度、海綿組織厚度、氣孔密度的系數(shù)次之；第二主成分中柵欄組織厚度、柵欄組織厚度/ 海綿組織厚度的系數(shù)最大；第三主成分中中脈導(dǎo)管直徑的系數(shù)最大。因葉片厚度已經(jīng)包含下表皮厚度，柵欄組織厚度、海綿組織厚度及柵欄組織厚度/海綿組織厚度3 個指標中，柵欄組織有助于減少葉片蒸騰作用，提高植物的抗旱能力，柵欄組織厚度最能體現(xiàn)植物的抗旱性，故選擇葉片厚度、中脈導(dǎo)管直徑、柵欄組織厚度、氣孔密度作為評價抗旱性的指標。

表5 葉片解剖結(jié)構(gòu)特征的主成分分析Table5 Results of a principle component analysis of leaf anatomical structures characteristics

2.4 抗旱性比較

根據(jù)主成分分析結(jié)果，運用隸屬函數(shù)法[19]對葉片厚度、中脈導(dǎo)管直徑、柵欄組織厚度、氣孔密度進行計算，對8 種金花茶組植物4 項抗旱性指標的隸屬函數(shù)值進行累加求平均值，結(jié)果見表6。綜合評價了8 種金花茶組植物的抗旱能力，均值越大抗旱性越強，結(jié)果表明普通金花茶的抗旱性最強，凹脈金花茶的抗旱性最弱。通過隸屬函數(shù)法的評價結(jié)果，抗旱性最強的3 個品種為普通金花茶、塔姆島金花茶、多毛金花茶，隸屬函數(shù)均值均在0.2以上；抗旱能力次之的4 個品種為羅斯曼金花茶、小花金花茶、顯脈金花茶、箱田金花茶，均值在0.149 2～ 0.197 6；抗旱性最弱的金花茶品種為凹脈金花茶。

表6 8 種金花茶組植物4 項指標的隸屬函數(shù)值及抗旱性綜合評價Table6 Subordinate function values of four indices in eight species of Camellia sect.Chrysantha and comprehensive appraisals of drought resistance

3 結(jié)論與討論

葉片解剖結(jié)構(gòu)的變化與植物的生長有著重要的聯(lián)系，較厚的表皮細胞和發(fā)達的柵欄組織可以通過保持植物的內(nèi)部水分，更有利于植株的生長發(fā)育[20]，通過對4 種越南金花茶和4 種本地金花茶的葉解剖結(jié)構(gòu)特征值進行測定后，數(shù)據(jù)表明塔姆島金花茶的葉片厚度值最大，為422.95 μm，與其他金花茶的葉片厚度具有顯著差異性（表2），普通金花茶、羅斯曼金花茶、箱田金花茶的柵欄組織厚度值最大，表明這4 種金花茶品種的植物生產(chǎn)力強；而凹脈金花茶的葉片厚度值和柵欄組織厚度值最小，表明其植物生產(chǎn)力最弱。氣孔是植物葉片與外界空氣交換和水分流失的重要通道，是影響植物光合和蒸騰作用的重要因素。氣孔密度值越大越有利于提高光合速率，氣孔小而密的植物往往光合能力更強，可以更快地響應(yīng)外界的環(huán)境因子[21]，當遇到外界環(huán)境改變發(fā)生脅迫時，小的氣孔可以迅速關(guān)閉以防止水分進一步喪失，而大的氣孔關(guān)閉緩慢，植物易發(fā)生失水等問題，引起功能失調(diào)[22-23]。通過對4 種越南金花茶和4種廣西本地金花茶葉片的氣孔進行觀測，結(jié)果表明，氣孔密度值最大的是普通金花茶、塔姆島金花茶、羅斯曼金花茶，分別為105.48、101.89、98.20 個/mm2，最小值為小花金花茶和凹脈金花茶分別為67.29、66.17 個/mm2，具有顯著差異性 （P＜0.05）。4 種越南金花茶葉片的氣孔縱軸長和橫軸長普遍小于4 種本地金花茶，表明越南金花茶具有小的氣孔。廣西本地普通金花茶和越南金花茶品種中羅斯曼金花茶、塔姆島金花茶、箱田金花茶的葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、氣孔密度值較大，氣孔較小，這些品種的金花茶葉片對光能的利用率高，更有利于保持植物內(nèi)部水分，防止水分流失。而廣西本地金花茶中的凹脈金花茶則表現(xiàn)最差，可能其光合能力最弱。

前人多采用一定的數(shù)學(xué)方法獲得既定的綜合數(shù)值來衡量植物的抗旱性，目前主要采用主成分分析法、隸屬函數(shù)法、抗旱性指標以及模糊數(shù)學(xué)中的聚類分析和灰色關(guān)聯(lián)度分析法等相關(guān)方法對植物抗旱性進行綜合分析評價[6-9,24]。本研究根據(jù)主成分分析，葉片厚度、中脈導(dǎo)管直徑、柵欄組織厚度、氣孔密度可以作為反映金花茶抗旱能力的葉解剖結(jié)構(gòu)特征指標，葉片厚度越厚說明植物的控水能力越強，抗旱性能越好；有學(xué)者對抗旱性較強的樹種進行分析，發(fā)現(xiàn)其維管束排列緊密且導(dǎo)管直徑較大，說明中脈導(dǎo)管直徑可以作為抗旱能力強弱的重要指標；柵欄組織的作用可以減少植物葉片水分的蒸騰作用，提供其光合效率及抗旱能力；氣孔越小且氣孔密度越大的植株能在干旱的環(huán)境中有效地減少水分流失。說明這4 個葉解剖結(jié)構(gòu)指標可以很好地反映植物的抗旱能力。通過隸屬函數(shù)法綜合評價了8 種金花茶組植物的抗旱能力，結(jié)果為抗旱性最強的3 個品種為普通金花茶、塔姆島金花茶、多毛金花茶，抗旱能力最差的為凹脈金花茶。

植物的抗旱性能是長期對環(huán)境適應(yīng)的綜合特性結(jié)果，不僅與葉解剖結(jié)構(gòu)特征有關(guān)，還依賴于其他生理生化指標，若要準確的評價金花茶的抗旱性，還需參考其水分脅迫的受害情況及脅迫后恢復(fù)能力等指標，進一步加強脅迫對不同金花茶品種的影響將是我們下一步工作的重點。