溫度、鹽度和光照對(duì)球形棕囊藻生長(zhǎng)和鹵代烴釋放的影響*

晏國(guó)佳， 丁瓊瑤， 高先池

(中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266100)

揮發(fā)性鹵代烴(VHCs)不僅是溫室氣體，而且對(duì)大氣臭氧層的破壞起到很重要的作用[1-3]。VHCs可直接吸收大氣紅外輻射產(chǎn)生熱能導(dǎo)致全球溫度升高，還可以通過參與一系列大氣化學(xué)反應(yīng)間接影響到全球氣候和地表溫度。作為平流層中鹵素的主要載體，氯甲烷(CH3Cl)在平流層活性氯的含量中占比可達(dá)16%，溴甲烷(CH3Br)占活性溴含量的比值高至30%[4]。碘甲烷(CH3I)是含量最豐富的含碘化合物，尤其在低層大氣中參與重要的大氣化學(xué)反應(yīng)[5]。海洋是大氣中CH3Cl、CH3Br和CH3I的主要來源[6-7]。除了人為來源產(chǎn)生的鹵代烴之外，在海洋中，浮游植物釋放產(chǎn)生CH3Cl[8-10],CH3Br[11]和CH3I[9]是一個(gè)重要的天然途徑[2, 6, 7, 12-13]，但是浮游植物產(chǎn)生鹵代烴受環(huán)境因素的影響很大[14]。

目前已經(jīng)有研究表明部分藻類產(chǎn)生的鹵代烴會(huì)隨著溫度的增加而增加，但是溫度的影響對(duì)于不同微藻的產(chǎn)生結(jié)果不盡相同[15]。根據(jù)Snoeijs和Prentice的研究結(jié)果，在波羅的海大部分藻類都會(huì)在溫度升高之后迅速繁殖。但是Abrahamsson指出沒有一個(gè)固定的模式適用于所有的藻類，環(huán)境的影響因素依舊需要深入探究[15-17]。文獻(xiàn)表明微藻在不同鹽度下生長(zhǎng)有所不同，不同藻類的鹽度適應(yīng)度是不同的[18-20]。關(guān)于光照對(duì)VHCs釋放量的影響，研究結(jié)果并不完全統(tǒng)一[21-24]。鹽度和光照是海藻生長(zhǎng)的重要影響因素，而VHCs的產(chǎn)生和藻類的生長(zhǎng)有著不可分割的聯(lián)系，所以鹽度和光照對(duì)VHCs的產(chǎn)生也可能產(chǎn)生一定的影響。

球形棕囊藻是海洋中一種數(shù)量豐富的球形藻類。它是海洋浮游植物中能夠在不同溫度和鹽度下生存的一類植物。球形棕囊藻是海洋初級(jí)生產(chǎn)中的關(guān)鍵物種，它可以大量繁殖增加[25-28]，且能產(chǎn)生導(dǎo)致全球變暖和破壞臭氧層的VHCs[13, 29]。球形棕囊藻在不同生長(zhǎng)環(huán)境(溫度、鹽度和光照強(qiáng)度)下產(chǎn)生VHCs的含量和生產(chǎn)速率的系統(tǒng)研究暫未見報(bào)道，所以本實(shí)驗(yàn)主要以中國(guó)邊緣海的藻類生長(zhǎng)環(huán)境為基礎(chǔ)，探究不同溫度、鹽度和光照強(qiáng)度下CH3Cl、CH3Br和CH3I產(chǎn)生的濃度和生產(chǎn)速率的釋放特性。

1 材料與方法

1.1 藻類培養(yǎng)

球形棕囊藻藻種來源于中國(guó)海洋大學(xué)海洋污染生態(tài)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，藻的培養(yǎng)和取樣方法按照文獻(xiàn)[29]進(jìn)行。藻于3L培養(yǎng)瓶中密閉培養(yǎng)，采用f/2培養(yǎng)液并已進(jìn)行高溫滅菌(LDZX-50KBS,上海申安醫(yī)療器械廠)。培養(yǎng)所用的海水采集于黃海，并用0.45 μm醋酸纖維濾膜進(jìn)行過濾[30]。所有使用的玻璃器皿都在10% HCl浸泡24 h后，用高純水沖洗干凈并經(jīng)過高溫滅菌。不同生長(zhǎng)溫度(15、20和25 ℃)，鹽度(19、23和29)和光照(14、25、38 μmol·m-2·s-1)條件于培養(yǎng)期間嚴(yán)格控制。在培養(yǎng)期間，每?jī)商觳杉?次樣品。為了避免浮游植物細(xì)胞沉淀，將樣品每天搖動(dòng)3次。

1.2 培養(yǎng)條件

藻類培養(yǎng)在培養(yǎng)光照箱中進(jìn)行(GXZ-380B,寧波江南儀器廠)。設(shè)置溫度分別為15、20和25 ℃[31]；鹽度模擬中國(guó)近海鹽度范圍，確定為19、23和29；考慮到光照強(qiáng)度對(duì)藻類生長(zhǎng)的促進(jìn)或抑制效應(yīng)，設(shè)定光照條件為14、25和38 μmol·m-2·s-1，光暗周期12 h∶12 h。具體的藻類培養(yǎng)條件設(shè)置見表1。

表1 球形棕囊藻的培養(yǎng)條件Table 1 Different growth environments of Phaeocystis globosa

1.3 分析方法

隔天取樣時(shí)間為在開始照射3 h后的上午9:00，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣分別采集以分析細(xì)胞密度和鹵代烴[31]。 根據(jù)文獻(xiàn)[32-33]，通過吹掃捕集氣相色譜法(Agilent 6890 N)和電子捕獲檢測(cè)(ECD)分析藻類產(chǎn)生鹵代烴的含量。該方法的CH3Cl、CH3Br和CH3Cl的檢測(cè)限分別為1.8、0.2和0.05 pmol·L-1，精密度分別為<2%、<8%和11%。采用光學(xué)顯微鏡(Olympus CX31，日本Japan)測(cè)量藻細(xì)胞數(shù)。鹵甲烷的最大生產(chǎn)速率是由鹵代烴對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的變化值除以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的平均藻細(xì)胞數(shù)得到的。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度、鹽度和光照強(qiáng)度對(duì)球形棕囊藻細(xì)胞密度的影響

球形棕囊藻大多數(shù)是以1～10 mm左右的形態(tài)存活在球形菌落中[31, 35]，觀察細(xì)胞密度可以直接捕捉到菌落的形成情況。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開始前的第1周，細(xì)胞密度增加緩慢，但在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期期間，菌落會(huì)逐漸消失并被單細(xì)胞所代替。Scarratt和Moore認(rèn)為[31, 35]這可能也和培養(yǎng)過程中不斷搖晃培養(yǎng)瓶以促進(jìn)藻細(xì)胞新陳代謝有關(guān)。溫度、鹽度和光照在藻類生長(zhǎng)中起相當(dāng)重要的作用(見圖1)，在本研究中，生長(zhǎng)曲線以及藻類的生長(zhǎng)周期在這幾種條件下都比較相近。細(xì)胞密度在第7天之前基本處于延滯期，之后以對(duì)數(shù)形式開始增加，在穩(wěn)定期細(xì)胞密度達(dá)到了最高點(diǎn)。對(duì)于溫度的變化對(duì)細(xì)胞密度影響的結(jié)果見圖1(a)，從中可以看出，3種溫度下球形棕囊藻分別在第15、17和19天達(dá)到細(xì)胞密度峰值，且15和20 ℃的峰值相近。相比25 ℃，偏低的15～20 ℃更有利于球形棕囊藻的生長(zhǎng)(P<0.05)。鹽度和光照(P>0.05)的變化對(duì)藻細(xì)胞密度的影響與溫度的變化相比不明顯(見圖1(b)和(c))。

2.2 溫度、鹽度和光照對(duì)球形棕囊藻鹵代烴濃度的影響

在球形棕囊藻的整個(gè)培養(yǎng)周期均能檢測(cè)出CH3Cl、CH3Br和CH3I，總體上3種物質(zhì)濃度的變化趨勢(shì)相似，均表現(xiàn)出對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期濃度迅速增加，在穩(wěn)定生長(zhǎng)期及衰亡期降低的趨勢(shì)。

溫度對(duì)鹵代烴濃度的影響見圖2。25 ℃培養(yǎng)條件下CH3Cl(見圖2(a))和CH3Br(見圖2(b))的濃度最大，分別為452.48和9.49 pmol·L-1。CH3I在這3種溫度下的最大濃度差異不大，但在15 ℃時(shí)最大濃度略偏高(P<0.05)，為6.29 pmol·L-1(見圖2(c))。3種化合物均在第13～15天達(dá)到濃度的峰值。鹽度和光照對(duì)3種化合物濃度的影響如圖3、4所示。可以看出，鹵甲烷濃度并沒有受到鹽度和光照的太大影響。鹽度為29時(shí)，CH3Cl、CH3Br和 CH3I的最大濃度略高于其它條件，分別為79.97、10.31和5.65 pmol·L-1。在38 μmol·m-2·s-1培養(yǎng)條件中，CH3Cl、CH3Br和 CH3I的最大濃度分別為82.00，9.90和4.91 pmol·L-1。在整體培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)與CH3Cl相比，CH3Br和CH3I的濃度約低10倍。

圖1 溫度(a)、鹽度(b)和光照(c)對(duì)球形棕囊藻細(xì)胞密度的影響Fig.1 Effect of temperature (a), salinity (b) and light density (c) on cell density of P. globosa

圖2 不同溫度下CH3Cl(a)、CH3Br(b)和CH3I(c)的濃度變化Fig.2 The concentrations of CH3Cl (a), CH3Br (b) and CH3I (c) at different temperatures

圖3 不同鹽度下CH3Cl(a)、CH3Br(b)和CH3I(c)的濃度變化Fig.3 The concentrations of CH3Cl (a), CH3Br (b) and CH3I (c) at different salinities

圖4 不同光照下CH3Cl(a)、CH3Br(b)和CH3I(c)的濃度變化Fig.4 The concentrations of CH3Cl (a), CH3Br (b) and CH3I (c) at different light densities

2.3 溫度對(duì)球形棕囊藻鹵代烴最大生產(chǎn)速率的影響

本文按照文獻(xiàn)[32]計(jì)算了不同溫度下鹵甲烷的最大生產(chǎn)速率。最大生產(chǎn)速率是以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期變化最大的數(shù)據(jù)計(jì)算，可以更清楚地表明溫度變化對(duì)藻產(chǎn)生鹵甲烷的影響[34]。而鹽度和光照對(duì)于鹵甲烷平均濃度的影響不大(P>0.05)，所以本文只計(jì)算了溫度變化條件下鹵甲烷的最大生產(chǎn)速率。3種鹵甲烷在不同溫度條件下的最大生產(chǎn)速率如圖5所示。溫度越高，CH3Cl和CH3Br的最大生產(chǎn)速率越高(見圖5(a),(b))，而CH3I的最大生產(chǎn)速率在3種溫度下變化不大。在25 ℃時(shí)，CH3Cl和CH3Br的最大生產(chǎn)速率分別達(dá)到4.84×10-8和0.19×10-8pmol·L-1·cells-1·d-1。CH3Cl在3種鹵甲烷中最大生產(chǎn)速率最大，明顯高于CH3Br 10倍高于CH3I 100倍左右。

圖5 不同溫度對(duì)CH3Cl(a), CH3Br(b), CH3I(c)最大生產(chǎn)速率的影響Fig.5 Effect of temperature, salinity, light density on maximum production rate of CH3Cl (a), CH3Br (b), and CH3I (c)

3 討論

結(jié)果表明藻細(xì)胞密度受溫度影響最大，而鹽度和光照的改變幾乎沒有產(chǎn)生太大影響。根據(jù)之前對(duì)鹽度效應(yīng)的研究，某些微藻可以在大范圍的鹽度范圍下生長(zhǎng)，但這取決于藻的種類，不同藻類對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性不同[19-20, 35-37]。圖1(b)中不同鹽度下生物量變化不大，說明球形棕囊藻能夠適應(yīng)較大范圍的鹽度區(qū)間。隨著鹽度的增加，鹵甲烷的濃度也有微弱的增加。球形棕囊藻在鹽度為29時(shí)CH3Cl、CH3Br和CH3I的濃度均最高，但是不同鹵甲烷的濃度有差別，這是因?yàn)樗鼈兊漠a(chǎn)生機(jī)理不同。 CH3Cl是占主導(dǎo)地位的有機(jī)氯化物，其具有廣泛的天然來源，文獻(xiàn)曾提出CH3Cl產(chǎn)生過程中存在“甲基氯轉(zhuǎn)移酶”這一機(jī)理[38]。另外CH3Cl和CH3Br可能由CH3I和相應(yīng)的其他鹵化物之間的反應(yīng)形成[39]，這也可以解釋在所有培養(yǎng)體系中，CH3Cl的濃度總是最高，而CH3Br和CH3I的濃度偏低的現(xiàn)象。

光照對(duì)藻細(xì)胞密度的影響和鹽度的變化具有相似的結(jié)果，說明球形棕囊藻也能適應(yīng)較大范圍的光照條件。已有的研究結(jié)果表明，光照對(duì)藻類釋放鹵代烴的影響結(jié)論差異較大，與藻的種類密切相關(guān)[21, 40]。本研究光照的影響結(jié)果和鹽度的影響相似，鹵甲烷的濃度隨著光照強(qiáng)度的增加而略有增加。在光照條件下，鹵甲烷的形成可能依賴于光合作用的機(jī)制，一種和鹵過氧化酶相關(guān)的合成途徑[41-43]。這種鹵過氧化酶可以使過氧化氫和鹵化物進(jìn)行反應(yīng)生成鹵甲烷，由于過氧化氫可以在光合作用過程中形成，影響了不同光照下鹵甲烷濃度的略微差異。

溫度是影響藻類生長(zhǎng)的最關(guān)鍵因素之一[44]。本文結(jié)果表明溫度偏低更適宜球形棕囊藻的生長(zhǎng)，不僅最早達(dá)到藻細(xì)胞密度峰值，而且藻細(xì)胞密度也更高。Medlin等人報(bào)道在1997年東海海域球形棕囊藻爆發(fā)時(shí)的海水表層溫度為18～24 ℃，且指出球形棕囊藻的適宜生長(zhǎng)溫度為16 ℃[45]。同時(shí)，其他研究也選擇15 ℃作為球形棕囊藻的室內(nèi)培養(yǎng)溫度[46]，這表明本文的結(jié)果與上述文獻(xiàn)研究結(jié)果相一致。球形棕囊藻不同溫度下產(chǎn)生的CH3Cl、CH3Br和CH3I的濃度各有差異，低溫適宜球形棕囊藻的生長(zhǎng)而25 ℃下產(chǎn)生的CH3Cl和CH3Br最多，且最大生產(chǎn)速率也是隨溫度升高而增大，這是因?yàn)楫?dāng)藻類的適宜生長(zhǎng)條件被破壞時(shí)，其代謝過程會(huì)受到一定的影響，從而釋放出更多的鹵甲烷[47]，這也與文獻(xiàn)報(bào)道藻類釋放鹵代烴的原因可能是抵抗外界環(huán)境條件的不利變化或者捕食是一致的[32]。對(duì)于CH3I受溫度影響不同于CH3Cl和CH3Br的結(jié)果，是因?yàn)镃H3I的產(chǎn)生不僅由過氧化酶的活性決定，在水體中，鹵甲烷的存在還涉及到彼此間的取代反應(yīng)(如CH3I轉(zhuǎn)化為CH3Br，后者進(jìn)一步可轉(zhuǎn)化為CH3Cl)和水解反應(yīng)[48]。本實(shí)驗(yàn)中藻釋放的CH3Cl和CH3Br的平均濃度高于CH3I，也可能與取代反應(yīng)有關(guān)，當(dāng)然還涉及到水體中甲基供體和鹵離子含量的影響[45]。球形棕囊藻主要在對(duì)數(shù)期產(chǎn)生大量的鹵甲烷，而對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中的自溶過程有可能發(fā)生，因?yàn)閮H在完整的細(xì)胞中鹵代烴的自溶過程才會(huì)出現(xiàn)[29]。在培養(yǎng)后期的濃度降低，至少說明鹵甲烷的釋放不是藻細(xì)胞破碎后的反應(yīng)產(chǎn)物。然而，從這些實(shí)驗(yàn)仍然不清楚鹵甲烷是否是細(xì)胞內(nèi)或者是細(xì)胞滲出物的反應(yīng)產(chǎn)物。

已有的近岸現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示鹵甲烷的濃度和分布會(huì)受到海域、季節(jié)及生物、人為或者陸地徑流等因素的多重影響，并且不同鹵甲烷的濃度變化較大。如中國(guó)近海調(diào)查結(jié)果總體上CH3Cl、CH3Br和CH3I的平均濃度變化范圍分別為80～250、2.0～12和1～5 pmol·L-1(實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部數(shù)據(jù))。結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查數(shù)據(jù)，本文培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除了溫度系列實(shí)驗(yàn)外，球形棕囊藻產(chǎn)生這3種鹵甲烷的濃度基本符合上述濃度變化范圍，最高濃度甚至高于上述范圍，這也說明藻類鹵代烴的釋放對(duì)近岸鹵代烴的存在起著相當(dāng)積極的貢獻(xiàn)。假設(shè)球形棕囊藻釋放鹵甲烷的行為在海藻中具有一定的相似性，可以預(yù)測(cè)當(dāng)近岸藻華發(fā)生之時(shí)，藻類產(chǎn)生的鹵甲烷是海水中鹵甲烷的一個(gè)重要來源。

4 結(jié)語

本文研究了溫度、鹽度和光照強(qiáng)度對(duì)球形棕囊藻生長(zhǎng)及其釋放鹵代烴的影響。溫度偏低更適宜球形棕囊藻的生長(zhǎng)，高溫不利于該藻的生長(zhǎng)。CH3Cl和CH3Br的濃度和最大生產(chǎn)速率隨溫度的增大而增加，但偏低溫更有益于碘甲烷在水體中的存在。鹽度和光照的改變對(duì)于藻的生長(zhǎng)和鹵代烴的釋放的影響不如溫度變化明顯。球形棕囊藻培養(yǎng)期間3種化合物濃度和最大生產(chǎn)速率相差較大，CH3Cl的濃度在各個(gè)條件下都比CH3Br和CH3I高出10倍左右，而最大生產(chǎn)速率CH3Cl高于CH3Br 10倍，高于CH3I 100倍左右。