超高效液相色譜法比較鮮川芎和川芎藥材中6種成分含量

陳 冉，尹丹丹，楊 沫，王運來，尹登科，許 釩

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012;2.中藥復(fù)方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根狀莖，揮發(fā)油類是構(gòu)成川芎氣味雄烈的主要物質(zhì)。藥理研究表明，川芎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為內(nèi)酯類成分如藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A[1-3]，芳香酸類如阿魏酸[4-5]及生物堿如川芎嗪[6-7]。川芎嗪、阿魏酸及洋川芎內(nèi)酯類化合物在抗氧化損傷、抗炎鎮(zhèn)痛、抗凝及抗血小板聚集、神經(jīng)保護(hù)等方面具有顯著作用[8-12]。

川芎所含成分不穩(wěn)定，易受到溫度及光照影響發(fā)生成分損失；室溫貯藏及自然光照條件下即可發(fā)生多種途徑的降解行為[13-16]。因此，不同的溫度及光照條件直接影響川芎中各成分的轉(zhuǎn)化及含量。

鮮川芎在產(chǎn)地經(jīng)火炕烘干后撞去泥沙和須根即為川芎藥材，烘干溫度小于70 ℃。筆者推測，受烘干過程中溫度的影響，川芎藥材與鮮川芎的化學(xué)成分間存在差異。但目前較多的研究關(guān)注川芎藥材貯藏期間的成分變化，本課題旨在對鮮川芎與川芎藥材中的6種活性成分(川芎嗪、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A)進(jìn)行測定，初步比較二者化學(xué)成分差異，為川芎的產(chǎn)地加工提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters Acquity UPLC-PAD色譜系統(tǒng)(包括二元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、PAD檢測器、Empower 2工作站)：美國Agilent公司；ML303E千分之一電子天平：梅特勒-托利多上海有限公司；KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DFY-300多功能高速中藥粉碎機(jī)：溫州鼎歷醫(yī)療器械有限公司。

1.2 試劑 乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)：美國Fisher公司；0.22 μm有機(jī)相針式濾器：江蘇津騰公司；超純水：自制；鹽酸川芎嗪(批號110817-201608，純度≥98%)、阿魏酸(批號110773-201614，純度≥98%)、藁本內(nèi)酯(批號111737-201608，純度≥98%)：均購買于中國食品藥品檢定研究院；洋川芎內(nèi)酯H(批號 P12J8F39794，純度≥98%)、洋川芎內(nèi)酯I(批號 P12J8F39795，純度≥98%)、洋川芎內(nèi)酯A(批號 P12J8F39796，純度≥98%)：購于上海源葉生物科技有限公司。

1.3 藥材 新鮮的川芎根狀莖于2017年5月收獲期采集自四川彭州市敖平鎮(zhèn)鳳鶴村，川芎藥材(批號：161219，產(chǎn)地四川)購買自安徽普仁中藥飲片有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)金傳山教授鑒定為傘形科川芎LigusticumchuanxiongHort.的新鮮及干燥根狀莖，見圖1。

圖1鮮川芎與川芎藥材切片(A.鮮川芎；B.川芎藥材)

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1 供試品溶液制備 川芎自產(chǎn)地采收后，洗凈泥沙，晾干水分后，作為鮮川芎。將同一批次鮮川芎于60 ℃烘箱中烘烤6 h作為川芎藥材。新鮮川芎含水量較高，為降低水分對成分測定的影響，在采用超高效液相串聯(lián)光電二極管陣列檢測器進(jìn)行含量測定前，根據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》一部規(guī)定[17]，采用甲苯法測定鮮川芎及川芎藥材含水量分別為62.73%、8.73%，鮮川芎與川芎藥材的質(zhì)量比為7.18。將一定質(zhì)量的鮮川芎和川芎藥材粉碎至過三號篩，分別取5 g，采用50 mL的75%甲醇以超聲功率80 W超聲提取(室溫25 ℃)30 min，室溫放置6 h后分別取上清，過0.22 μm有機(jī)濾膜，得濾液備用。

2.1.2 對照品溶液制備 取各標(biāo)準(zhǔn)品一定量，配制鹽酸川芎嗪、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯濃度分別為65、50、30、12、400、682 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液母液。

2.2 色譜條件 色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)，配備有Acquity UPLC柱在線過濾系統(tǒng)。采用梯度洗脫，流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)。梯度洗脫過程：0～0.5 min，5% A；0.5～8 min，5%～45% A；8～10 min，45% A；10～11 min，45%～48% A；11～16 min，48%～50% A；16～18.5 min，50%～60% A；18.5～20 min，60%～75% A；20～22 min，75%～90% A；22～23 min，90%～5% A；23～25 min，5% A。檢測波長295 nm，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣體積2 μL。

2.3 專屬性考察 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液、川芎藥材及鮮川芎樣品溶液，進(jìn)樣容積2 μL，按照“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析，所得色譜圖見圖2、圖3。

注：A.空白對照品；B.鮮川芎；C.川芎藥材；D.混合標(biāo)準(zhǔn)品；1.鹽酸川芎嗪；2.阿魏酸；3.洋川芎內(nèi)酯I；4.洋川芎內(nèi)酯H；5.洋川芎內(nèi)酯A；6.藁本內(nèi)酯

圖2鮮川芎與川芎藥材的UPLC圖

注：A.混合標(biāo)準(zhǔn)品；B鮮川芎；C.川芎藥材；D.空白對照品；1.鹽酸川芎嗪；2.阿魏酸；3.洋川芎內(nèi)酯I；4.洋川芎內(nèi)酯H；5.洋川芎內(nèi)酯A；6.藁本內(nèi)酯

圖3鮮川芎與川芎藥材的UPLC色譜圖

2.4 線性范圍考察 精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液母液0.125、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋，定容至刻度，搖勻，配成混合對照品溶液。按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見表1。

表1 6種成分的回歸方程及線性范圍

2.5 精密度試驗 按照“2.2”項下色譜條件，將同一混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計算得到川芎嗪、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的峰面積的RSD分別為0.13%、0.89%、1.52%、1.68%、0.89%、0.94%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 將同一批次的供試品溶液室溫下放置0、2、4、8、12、16、24 h后分別進(jìn)樣分析，計算得到各成分峰面積的RSD，分別為阿魏酸0.19%、洋川芎內(nèi)酯H 0.92%、洋川芎內(nèi)酯I 0.14%、洋川芎內(nèi)酯A 0.14%、藁本內(nèi)酯0.16%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取同批川芎藥材6份進(jìn)樣，按照供試品溶液制備方法制備后進(jìn)樣分析，對重復(fù)性試驗進(jìn)行考察，分別計算得到各成分峰面積的RSD，分別為阿魏酸0.34%、洋川芎內(nèi)酯I 0.67%、洋川芎內(nèi)酯H 1.32%、洋川芎內(nèi)酯A 0.46%、藁本內(nèi)酯0.27%，表明方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱定0.25 g鮮川芎及川芎藥材6份，加入各對照品溶液，按照“2.1”項下樣品制備方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件，進(jìn)樣分析，計算6種成分的回收率和RSD，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

注：空白單元格表示該項下沒有檢測到相應(yīng)化合物

2.9 含量測定 按“2.1”項下條件制備樣品溶液，按“2.2”項下條件測定。根據(jù)川芎藥材與鮮川芎質(zhì)量比折算，川芎藥材與鮮川芎中6種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表3。通過與6種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品對比，鮮川芎中檢測出3種成分別是阿魏酸、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A；川芎藥材中，除川芎嗪外，其余5種成分均被檢測出。本研究未在川芎藥材及鮮川芎檢測到川芎嗪，川芎中川芎嗪含量較低。鮮川芎中未檢測到洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I。

表3 鮮川芎及川芎藥材含量測定結(jié)果

注：空白單元格表示該項下沒有檢測到相應(yīng)化合物；w(川芎藥材)=(m/M)×100%，式中m代表川芎藥材中檢測出該化合物的質(zhì)量，M代表川芎藥材的質(zhì)量；w(鮮川芎)=(m/7.18M)×100%，式中m代表鮮川芎中檢測出該化合物的質(zhì)量，M代表鮮川芎的質(zhì)量；平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為鮮川芎、川芎藥材6個批次的平均值

3 討論

3.1 提取方式及時間考察 川芎藥材及鮮川芎中富含揮發(fā)性成分，因此在提取時選取了超聲提取。本研究中使用的鮮川芎未經(jīng)加工處理，含水量較大，考慮到含水量對提取率的影響，對提取時間進(jìn)行了考察，分為超聲提取30 min、超聲提取30 min后室溫放置2 h、超聲提取30 min后室溫放置6 h、超聲提取30 min后室溫放置12 h，結(jié)果表明超聲提取30 min后室溫放置6 h為最佳提取方式。

3.2 檢測波長的選擇 結(jié)合川芎嗪、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的光譜性質(zhì)，選擇了254、270、280、295、320 nm作為考察檢測波長，實驗結(jié)果表明，295 nm下6種活性成分響應(yīng)效果較佳，因此選擇295 nm作為最佳檢測波長。

3.3 鮮川芎與川芎藥材的成分轉(zhuǎn)化 本實驗將同一批鮮川芎、川芎藥材納入研究，UPLC檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)鮮川芎與川芎藥材間成分存在較大的差異。據(jù)報道，藁本內(nèi)酯及洋川芎內(nèi)酯A是川芎藥材中含量較高的兩種活性成分[19]。內(nèi)酯類成分易發(fā)生結(jié)構(gòu)改變和轉(zhuǎn)化，在產(chǎn)地加工及儲藏過程中的加熱、暴曬等程序會增加川芎的成分轉(zhuǎn)化。藁本內(nèi)酯在自然光照下可降解為洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯I[13]；洋川芎內(nèi)酯I在陽光照射下可形成二聚體[14]。在川芎藥材的提取或貯藏過程中，阿魏酸松柏酯易水解為阿魏酸，增加川芎中游離阿魏酸的含量[15]。貯藏兩年的川芎藥材，阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H的含量平均增加46.9%，阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的含量平均減少48.3%[16]。鮮川芎的產(chǎn)地加工有兩種方式，一為陽光露曬，一為炕床烘干。受加工過程中的光照、溫度影響，鮮川芎中的成分發(fā)生轉(zhuǎn)化，藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A含量降低，洋川芎內(nèi)酯I和洋川芎內(nèi)酯H含量增加。實驗結(jié)果表明，鮮川芎與川芎藥材成分存在差異。

洋川芎內(nèi)酯類化合物是川芎的主要活性成分及代謝成分。藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的降解產(chǎn)物為洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯I[20]，但人體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為洋川芎內(nèi)酯I[21]。研究表明，洋川芎內(nèi)酯I可快速入血入腦[22]，這為川芎的臨床治療疾病提供了直接的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究通過UPLC測定鮮川芎和川芎藥材中6種活性成分的含量，發(fā)現(xiàn)鮮川芎、川芎藥材中存在成分差異。鮮川芎及川芎藥材中均未檢測到川芎嗪；鮮川芎中內(nèi)酯類化合物在產(chǎn)地加工中發(fā)生轉(zhuǎn)化，藁本內(nèi)酯含量降低，洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H含量增加。