廣西HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌及其癌旁組織中HBV S基因突變分析

李紅 吳玲紅 鄧偉 黃有全 韓簫 梁善雄 黃天壬，

作者單位：530021 南寧 1廣西醫(yī)科大學(xué)；2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部；3廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所

原發(fā)性肝癌（以下簡稱肝癌）是全球第4大癌癥死亡原因［1］。2015年廣西肝癌發(fā)病和死亡例數(shù)分別位居惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第2位和第1位［2］。肝細(xì)胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）占肝癌的 75%～85%［1］，是最常見的組織學(xué)類型。HCC發(fā)生是多因素、多步驟參與的復(fù)雜過程，受遺傳和環(huán)境因素雙重影響，其中HBV慢性感染是主要危險(xiǎn)因素［3］。據(jù)報(bào)道，我國乙肝表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）攜帶者約1.2億［4］。HBV DNA是由正鏈和負(fù)鏈組成的不完整雙鏈結(jié)構(gòu)，包含4個(gè)開放讀碼框（open reading frames，ORF），分別為 preS/S 區(qū)、preC/C 區(qū)、P 區(qū)和 X區(qū)。ORF突變可改變病毒的復(fù)制與毒性，導(dǎo)致病毒持續(xù)感染及肝臟嚴(yán)重?fù)p傷，甚至可導(dǎo)致HCC發(fā)生發(fā)展。其中HBV preS/S區(qū)由preS1、preS2和S 3個(gè)區(qū)域組成，編碼3種HBsAg，即大分子蛋白（large hepatitis B surface protein，LHBs）、中分子蛋白（middle hepatitis B surface proteins，MHBs）和小分子蛋白（small hepatitis B surface proteins，SHBs）［5］。LHBs由preS1、preS2、S基因編碼；MHBs由preS2、S基因編碼；SHBs即HBV主蛋白，由S基因編碼［6］。近年來，多項(xiàng)研究表明HBVS基因突變與HCC發(fā)病密切相關(guān)［7-9］。但由于組織樣本難以獲取，大多研究在血清中進(jìn)行S基因突變分析。本研究分析肝細(xì)胞癌組織HBVS基因及其所編碼蛋白的突變情況，為闡明HCC發(fā)病機(jī)制提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2015年1月至2016年12月于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的43例HCC患者癌組織及其癌旁組織（距手術(shù)切緣大于2 cm），均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：HBV相關(guān)HCC，首次就診；HBV DNA陽性且定量大于1 000 IU/mL；術(shù)前未經(jīng)抗癌治療。排除合并其他腫瘤、藥物性肝病、酒精性肝病、丙型肝炎病毒感染等患者。共43例患者符合標(biāo)準(zhǔn)納入研究，其中男性 37例，女性 6例，平均年齡（49.8±10.1）歲，中位年齡50歲（范圍：25～69歲）。血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（serum alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate amino transferase，AST）中位水平分別為44.00 U/L 和 51.00 U/L；血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）中位水平為178.4 ng/mL。HBsAg、乙型肝炎E抗原（hapatitis B e antigen，HBeAg）陽性率分別為97.67%和16.28%。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或監(jiān)護(hù)人知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 HBV DNA提取 按HBV DNA提取試劑盒（購自上海天根生化科技公司，貨號為DP304）說明書提取DNA，NanoDrop2000超微量樣本分光光度計(jì)檢測DNA濃度與純度。

1.2.2 HBVS基因擴(kuò)增 采用巢式PCR擴(kuò)增HBVS基因，全長約586 bp。第一輪反應(yīng)上游引物為5′-GGGTCACCATATTCTTGGG-3′，下游引物為 5′-GACCCACAATTCTTTGACAT-3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 2 min；變性95℃ 35 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；終末循環(huán)72℃10 min。第二輪反應(yīng)上游引物為 5′-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3′，下游引物為5′-GGGACTCAAGATGTTGTACAG-3′。反應(yīng)條件同第一輪反應(yīng)。

1.2.3 目的產(chǎn)物鑒定與序列測定 以DNA marker作為對照，10 g/mL瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，目的條帶產(chǎn)物由北京六合華大基因股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.3 序列分析

采用Chromas軟件分析序列峰圖，鑒定測序結(jié)果。DNAMAN軟件比對樣品序列和NCBI上NC_003977.2 HBV序列；樣品序列和NC_003977.2 HBV序列對齊（nt247-771，大小525 bp）進(jìn)行氨基酸翻譯，共175個(gè)氨基酸，對應(yīng)SHBs第31～205位氨基酸。同一位點(diǎn)突變頻率超過所有序列數(shù)的10%視為熱點(diǎn)突變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分類數(shù)據(jù)組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV S基因擴(kuò)增及測序結(jié)果

43對HCC癌組織及癌旁組織樣本均成功擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳在586 bp處出現(xiàn)亮條帶，與目的片段長度相符，見圖1。擴(kuò)增產(chǎn)物測序后分別獲得43條癌組織序列和43條癌旁組織序列。

圖1 部分組織樣本HBV S基因瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of agarose for HBV S gene

2.2 HBV S基因熱點(diǎn)突變

共116個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，其中癌組織有96個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，癌旁組織有95個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變。共發(fā)現(xiàn)45個(gè)熱點(diǎn)突變，所有患者癌組織及其癌旁組織序列均檢測到熱點(diǎn)突變，并非某一組織所特有，任一熱點(diǎn)突變在癌組織與癌旁組織中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中，癌組織與癌旁組織的所有序列均存在T291A、A292C和C520A突變，見表1。

表1 HBV相關(guān)HCC患者癌組織及其癌旁組織的熱點(diǎn)突變［n（%）］Tab.1 Analysis of hot spot mutations of HCC and pericarcinoma liver tissues in patients with HBV-related HCC［n（%）］

2.3 HBV SHBs終止突變

用DNAMAN軟件行氨基酸翻譯，共發(fā)現(xiàn)6條序列由于堿基突變發(fā)生終止突變，導(dǎo)致SHBs肽鏈合成提前終止。在43條癌組織序列中，有6條序列發(fā)生SHBs終止突變，突變發(fā)生率為13.95%（6/43），癌旁組織未發(fā)生此突變（0/43），兩者突變發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在 6條序列中，編碼第69位、74位、94位、172位和182位氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致SHBs截短性變異，見表2。

3 討論

HBV是突變頻率最高的DNA病毒，因?yàn)镠BV DNA在復(fù)制過程中缺乏DNA酶的校正功能［10］。S區(qū)與P區(qū)完全重疊，長期使用核苷（酸）類似物［nucleos（t）ide Analogues，NAs］引起的耐藥突變可間接導(dǎo)致S基因突變，S基因突變也可引起P區(qū)基因組突變［11］，HBsAg蛋白氨基酸變異也可影響病毒對藥物的反應(yīng)［12］。在SHBs中，第99～169位氨基酸序列區(qū)構(gòu)成了SHBs的主要親水區(qū)（major hydrophilic region，MHR），其中包括“α 決定簇（aa124～147）”。α 決定簇是重要的抗原決定表位，可刺激B細(xì)胞產(chǎn)生中和性抗體，S基因MHR氨基酸的替換降低了乙肝表面抗體的結(jié)合，導(dǎo)致免疫逃逸［13］和隱匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）。sG145R 突變是S基因最常見的突變，已被證實(shí)具有復(fù)制能力，可以長期穩(wěn)定存在，并垂直或水平傳播［14-17］。sG145R、sK122I和其他發(fā)生在SHBs α決定簇中的免疫逃逸突變，如sT123N突變，可能影響HBsAg分泌［18-19］。S基因MHR逃逸突變可能阻礙HBsAg的表達(dá)分泌，使HBsAg匯集在肝細(xì)胞內(nèi)，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)，導(dǎo)致肝損傷，從而促進(jìn)HCC發(fā)病［10］。本研究發(fā)現(xiàn) T291A、A292C、C520A在HCC癌組織與癌旁組織所有序列中均發(fā)生突變，而C520A/G521A雙突變存在于癌組織的全部序列中，且C520A、G521A突變在MHR內(nèi)，提示C520A/G521A突變可能造成免疫逃逸，影響HBsAg持續(xù)分泌，從而促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展。然而HCC癌組織與癌旁組織熱點(diǎn)突變發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同一患者中，HBVS基因熱點(diǎn)突變在HCC癌組織及其癌旁組織中的分布并無特異性。這一結(jié)果可能由于S基因處于HBV基因組高度保守區(qū)導(dǎo)致，也可能由于抽樣誤差或樣本量較少等原因造成。

表2HCC癌組織中SHBs蛋白終止突變的特點(diǎn)Tab.2 Characteristics of SHBs stop mutation in HCC tissues

本研究還發(fā)現(xiàn)SHBs終止突變僅發(fā)生在HCC癌組織中，但癌旁組織未發(fā)生此突變，6條序列中5個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了終止突變，分別是 sC69*、sW74*、sL94*、sW172*和 sW182*。其中 sC69*、sW172*和 sW182*已有研究報(bào)道［8，20-21］，但 sW74*、sL94*突變尚未見報(bào)道，提示sW74*、sL94*可能是地域性特有的終止突變模式。終止突變主要由于RT區(qū)耐藥突變，使S基因發(fā)生突變［20］，導(dǎo)致SHBs截短。終止突變也可在自然條件下發(fā)生，但未接受核苷（酸）類藥物治療患者突變檢出率較低［22］。終止突變可造成免疫逃逸而促進(jìn)肝臟疾病發(fā)生。此外，截短的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中滯留而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，如HBV sW172*截短變異體可導(dǎo)致HBsAg分泌缺陷，HBsAg在ER內(nèi)滯留，通過激活ER應(yīng)激信號通路參與HCC發(fā)生［23］。

綜上所述，廣西HCC癌組織及其癌旁組織HBVS基因熱點(diǎn)突變分布無特異性，SHBs終止突變常發(fā)生于HCC癌組織中，新發(fā)現(xiàn)了sW74*和sL94*終止突變位點(diǎn)，可能與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這一結(jié)果為廣西HCC研究提供新的方向。但鑒于本研究樣本量較少，有關(guān)結(jié)論尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。