Cre/Loxp 系統(tǒng)介導轉(zhuǎn)基因山羊乳腺上皮細胞標記基因的刪除

宋紹征 于康英 陸睿 張婷 陳朝軍 潘生強 成勇 周鳴鳴

（1.無錫太湖學院護理學院，無錫 214000；2.揚州大學獸醫(yī)學院 江蘇省轉(zhuǎn)基因動物制藥工程研究中心，揚州 225009）

動物轉(zhuǎn)基因技術滲透于細胞生物學、發(fā)育生物學、基因工程等各領域，在遺傳育種、性狀改良、抗病和建立疾病模型等方面都具有不可比擬的優(yōu)勢［1-3］。通過體細胞核移植技術制備的轉(zhuǎn)基因動物普遍都含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（Neo）［4］、嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（Puro）、綠色熒光蛋白基因（GFP）等［5］標記基因，主要用于轉(zhuǎn)基因陽性細胞克隆篩選。然而，標記基因存在于表達載體的某些部位可能會對外源基因的表達產(chǎn)生干擾，對受體動物的生長以及生物安全產(chǎn)生諸多不利的影響，Pham等［6］證實標記基因（PGK-Neo）整合到基因敲除的小鼠染色體之后，破壞了基因座上相關基因的表達，最終產(chǎn)生異常的表型；Rucker 等［7］將Neo 基因放在bcl-x 基因的啟動子前，電轉(zhuǎn)染整合到小鼠體內(nèi)，結果雌雄后代均出現(xiàn)了精原細胞、濾泡數(shù)減少及不育等生殖缺陷，通過Cre 重組酶去掉Neo 基因后，bcl-x 基因恢復了正常的表達。因此，有必要對標記基因進行刪除，以消除潛在的生物安全隱患。

Cre/Loxp 系統(tǒng)首先發(fā)現(xiàn)于噬菌體［8］。該系統(tǒng)包含兩部分，即Cre 重組酶和Loxp 位點。Cre 重組酶能夠識別特異性的Loxp 核苷酸序列，不需借助任何的輔助因子，不需要消耗能量，通過其酪氨酸殘基與該序列結合，然后在特定位點對該序列進行剪切［9］，不受切割片段長度及所處染色體位置的限制。因此，該系統(tǒng)廣泛的應用于轉(zhuǎn)基因研究中的部分DNA 序列刪除，同時可在哺乳動物細胞水平刪除基因組上的標記基因，具有高效、快速、便捷等諸多優(yōu)點［10-12］。但是，目前大多數(shù)研究集中在成纖維細胞和動物個體，蘭翀等［13］利用Cre/Loxp 系統(tǒng)刪除轉(zhuǎn)基因山羊耳尖成纖維細胞標記基因，吳慧［14］利用Cre/Loxp 系統(tǒng)刪除轉(zhuǎn)基因絨山羊胎兒成纖維細胞標記基因，獲得的細胞株用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆絨山羊個體、周期長。而本實驗選取的山羊乳腺上皮細胞作為研究對象，可在細胞水平誘導表達篩選、周期短，在國內(nèi)外較少見報道。

本研究通過Cre/Loxp 系統(tǒng)瞬時表達Cre 重組酶，刪除hLF 轉(zhuǎn)基因山羊乳腺上皮細胞中的Neo 標記基因，徹底消除其潛在的生物安全性風險，并以此探索Cre/Loxp 刪除效率以及刪除標記基因前后乳腺上皮細胞誘導功能基因表達量的變化，旨在建立一套高效便捷的山羊乳腺上皮細胞標記基因刪除系統(tǒng)，為不同轉(zhuǎn)基因細胞中標記基因的刪除積累經(jīng)驗，為進一步擴大生產(chǎn)無標記基因的轉(zhuǎn)基因山羊及其它動物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒 PBS185 質(zhì)粒（含CMV 啟動子、GFP基因）和BLC14 質(zhì)粒由本實驗室保存（包含Loxp位點，圖1）。

1.1.2 引物 PCR 引物設計借助于Primer 5.0 軟件完成，引物（表1）由上海生工生物有限公司合成。

圖1 BLC14 載體和Cre 酶特異性識別的Loxp 位點

表1 標記基因刪除檢測引物

1.1.3 主要試劑與材料 DMEM/F12（Sigma，Cat No.D2906）、FBS（Hyclone，Cat No.SH30070.03）、Electroporation Buffer（Eppendorf，Cat No.940002150）、Hydrocortisone（Sigma，Cat No.H-0888）、Transferrin（Sigma，Cat No.T-1283）、Insulin（Sigma，Cat No.I-5500）、Trypsin（Amresco，Cat No.0458）、Proteinase K（Sigma，Cat No.P6556）、Ethanolamine（Sigma，Cat No. 411000）、 青 鏈 霉 素（Hyclone，Cat No.SV30010）、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（Promega，Cat No. A1223）、鼠抗hLF 單克隆抗體（Santa Cruz，sc-53498）、羊抗鼠單克隆抗體IgG-HRP（Santa Cruz，sc-2005）、各種內(nèi)切酶（寶生物工程）、口控式移卵針（自制）（圖2），其余化學試劑購自上海生工生物有限公司、國藥集團化學試劑有限公司及Sigma-Aldrich 公司。

圖2 自制口控式移卵針

1.1.4 轉(zhuǎn)基因細胞系與培養(yǎng)液 hLF 轉(zhuǎn)基因奶山羊乳腺上皮細胞（通過核移植制備的人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因克隆山羊，以BLC14 為載體，整合外源基因hLF）取自揚州大學獸醫(yī)學院轉(zhuǎn)基因動物制藥工程研究中心。

乳腺上皮細胞培養(yǎng)液：DMEM/F12 15.6 mg/mL，NaHCO31.2 mg/mL，乙酸鈉5 mmol/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白5 μg/mL，乙醇胺0.5 mmol/L，胰島素10 μg/mL，氫化可的松 5 μg/mL，青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 μg/mL，10% FBS（pH 7.2-7.4）。

1.2 方法

1.2.1 山羊乳腺上皮細胞的復蘇、純化、傳代 從液氮中取出原代hLF 轉(zhuǎn)基因山羊乳腺上皮細胞，迅速置于37℃水浴溶解，D-Hank’s 溶液清洗2 次后，細胞計數(shù)并用乳腺上皮細胞培養(yǎng)液調(diào)整密度至1×106個/mL 接種于六孔板內(nèi)，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。第2 天，D-Hank’s溶液清洗去除死亡漂浮細胞，添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞長至80%左右時，棄去原有培養(yǎng)液，用D-Hank’s 清洗細胞2 次，加入胰蛋白酶消化液，消化1-5 min，待大部分的成纖維細胞漂浮脫落，而乳腺細胞沒有變化時，用吸管輕輕吹打，棄去消化液與浮起的成纖維細胞，剩余的細胞添加新鮮的胰蛋白酶繼續(xù)消化5 min，添加培養(yǎng)液終止，吹打并收集細胞計數(shù)1×106個/mL，六孔板內(nèi)進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 PBS185 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hLF 轉(zhuǎn)基因細胞系 取PBS 185 菌種100 μL 接種至50 mL 滅菌LB 內(nèi)，37℃擴增10 h，經(jīng)內(nèi)毒素質(zhì)粒純化試劑盒提純質(zhì)粒，稀釋濃度至100 μg/mL。0.1% Trypsin-0.04% EDTA 的消化液收集對數(shù)生長期的山羊乳腺上皮細胞，用電轉(zhuǎn)染液洗滌離心后，重懸調(diào)整密度至1×106個/mL，添加PBS185 純化質(zhì)粒，使其終濃度為20 μg/mL，在徑寬2 mm 的電轉(zhuǎn)染杯內(nèi)，以2 kV/cm、250 μs 的條件電擊2 次，靜置3 min，轉(zhuǎn)移到正常的乳腺上皮細胞培養(yǎng)液內(nèi)，接種六孔板，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。

1.2.3 單克隆細胞株的獲取 轉(zhuǎn)染后按1×106個/mL 細胞密度接種六孔板24 h 后，清洗更換培養(yǎng)液去除大部分漂浮未貼壁細胞，隔天換液一次，培養(yǎng)至10-14 d 左右，熒光倒置顯微鏡（IX-71，Olympus，日本）下可觀察到綠色熒光細胞集落（PBS185 質(zhì)粒含GFP），即單克隆細胞形成。0.1%Trypsin-0.04% EDTA 消化乳腺上皮細胞，使用口控式移卵針挑取單克隆細胞，置于48 孔板、37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。

1.2.4 細胞株的PCR 檢測 待單克隆細胞長滿至80%左右時，收集部分細胞懸液，2 500 r/min 離心5 min，棄上清，加入10 μL 細胞裂解液，重懸細胞，45℃孵育45 min、96℃孵育15 min 后可直接作為PCR 模板，共設計3 對引物用于檢測標記基因是否刪除，引物序列。經(jīng)PCR 檢測刪除標記基因的細胞株及時進行細胞傳代和凍存。

1.2.5 ELISA 檢測 刪除標記基因的細胞株傳代至24 孔板進行培養(yǎng)，至細胞匯集約60%時，添加含5 μmol/L 催乳素進行功能基因的誘導表達，同時設置未刪除標記基因的轉(zhuǎn)基因細胞作為對照，72 h 后收集細胞誘導液。使用鼠抗hLF 單克隆抗體作為一抗（sc-53498，Santa Cruz）、羊抗鼠單克隆抗體IgGHRP（sc-2005，Santa Cruz）作為二抗進行ELISA 檢測［15-16］，顯色后酶標儀測定OD450值，并繪制曲線、計算hLF 表達量。

1.2.6 Western Blot 檢測 收集細胞誘導液，取30 μL 誘導液和6 μL 6×SDS-PAGE 電泳上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，冷卻后，按照常規(guī)方法進行12%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）［15-17］。通過轉(zhuǎn)移緩沖液（1.93 g/L tris，9 g/L glycine）將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，250 mA，轉(zhuǎn)印4 h。超純水沖洗后，37℃封 閉（20 mmol/L Tris，137 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20，10% FBS，pH 7.6），3 h。加入一抗稀釋液（1∶1 000 稀釋，鼠抗hLF 單克隆抗體，sc-53498，Santa Cruz），37℃孵育2 h。TTBS（20 mmol/L tris，137 mmol/L NaCl，1% Tween-20，pH 7.6）洗滌3 次后，加入二抗-HRP 稀釋液（1∶2 000 稀釋，羊抗鼠單克隆抗體IgG-HRP，sc-2005，Santa Cruz）中，37℃孵育2 h。取出PVDF 膜，PBS 洗凈后，添加顯色液（DAB 50 mg，0.05 mol/L TB100 mL，30 μL 30%H2O2，pH7.6），室溫15 min，晾干后拍照、記錄并保存。

2 結果

2.1 乳腺上皮細胞的復蘇、純化與傳代培養(yǎng)

未純化的山羊乳腺上皮細胞混雜著大量的成纖維細胞生長（呈梭形長條狀或旋渦狀）（圖3-A），通過胰蛋白酶消化純化后培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細胞呈現(xiàn)典型的短梭形或鵝卵石狀（圖3-B）。

圖3 山羊乳腺上皮細胞的培養(yǎng)（100×）

2.2 PCR檢測標記基因是否刪除

收集細胞裂解進行細胞PCR 檢測。其中DRB引物用于檢測細胞基因組經(jīng)裂解后是否完整，若基因組完整則PCR 能擴增出大小為276 bp 的條帶（圖4）；hLF-Neo 引物用于檢測標記基因Neo 是否刪除，若正確刪除標記基因則擴增不出條帶，反之則擴增出1 158 bp 大小條帶，如圖5 所示，10#、11#、12#細胞株未見條帶，疑似刪除標記基因；hLF-BLG 為跨標記基因引物，如果得到的產(chǎn)物為2 056 bp 則標記基因仍然存在；如果得到的條帶為667 bp 則標記基因已刪除，如圖6 所示，10#、11#、12#三株單克隆細胞株均出現(xiàn)667 bp 條帶，故判斷該3 株細胞為成功刪除標記基因的細胞株。本實驗總共檢測細胞株18 株，實際獲得刪除細胞系3 株（單克隆10#、11#、12#），刪除效率為16.7%（3/18）。

圖4 DRB 引物檢測乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)PBS185 單克隆細胞基因組

圖5 hLF-NEO 引物檢測乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)PBS185 單克隆細胞的標記基因刪除

圖6 hLF-BLG 引物檢測乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)染PBS185 單克隆

2.3 ELISA檢測刪除標記基因表達水平變化

以人乳清標準品濃度（g/L）作為橫坐標、OD450值作為縱坐標，制作標準曲線（圖7），根據(jù)曲線計算ELISA 檢測結果顯示：刪除標記基因的單克隆細胞株（10#、11#、12#）表達hLF 水平分別為2.73 g/L、2.82 g/L、2.85 g/L，最高表達水平可達2.85 g/L，而未刪除標記基因的轉(zhuǎn)基因山羊乳腺上皮細胞（已純化）表達hLF 水平約0.35 g/L，刪除標記基因后的細胞株表達水平高出約8 倍，說明標記基因的刪除明顯地提高了外源基因hLF 的表達量。

2.4 Western Blot檢測表達情況

刪除標記基因后的單克隆細胞株誘導表達的Western Blot 檢測結果如圖8 所示，出現(xiàn)約80 kD 大小的條帶，與目標蛋白hLF 蛋白條帶大小一致。

圖7 細胞誘導液中hLF 濃度檢測曲線圖

圖8 刪除標記基因的乳腺上皮細胞誘導表達的hLF 檢測

3 討論

Cre/Loxp 系統(tǒng)是一種高效的基因刪除系統(tǒng)，在P1 噬菌體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，目前已成功的應用于酵母，植物及哺乳動物身上［9，18-19］。本實驗選取含有Cre/Loxp 系統(tǒng)的表達質(zhì)粒PBS185 在山羊乳腺上皮細胞內(nèi)也能夠較好地誘導表達出Cre 重組酶，但與以往的基因轉(zhuǎn)染研究不同［16］，此次我們選擇的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后瞬時表達。瞬時表達是近年來發(fā)展的一種基因快速表達的有效方法，由Dillen 等［20］首先在植物中成功運用。瞬時表達相比于傳統(tǒng)的整合表達，是一種相對獨立的表達系統(tǒng)，當外源基因進入細胞表達相關蛋白后，很快就會發(fā)生降解，不會遺傳給后代，同時具有快速，簡便，周期短，安全等顯著優(yōu)點［21-22］。

山羊乳腺上皮細胞具有誘導表達功能，可使用催乳素等誘導［16］，國內(nèi)外尚未見在山羊乳腺上皮細胞中進行刪除標記基因的研究，多數(shù)集中在成纖維細胞的研究［13-14］。本研究在細胞水平利用Cre/Loxp系統(tǒng)刪除標記基因，并誘導山羊乳腺上皮細胞表達來檢測刪除標記基因前后功能蛋白hLF 的表達差異，這一項研究在國內(nèi)外較少見報道。山羊乳腺上皮細胞是一種分化程度很高的終末分化細胞，對培養(yǎng)條件有嚴格的要求［16，23］。據(jù)有關文獻報道［23-24］，相比于胎兒成纖維細胞，乳腺上皮細胞生長緩慢、易老化、不宜傳代培養(yǎng)，如果培養(yǎng)的乳腺細胞密度太低將會直接影響其生長和增殖。本研究中采用一種新穎的單克隆細胞株獲取方法，即利用自制的口控式移卵針挑取單克隆細胞?？诳厥揭坡厌槹^、濾器、硅膠管和玻璃移卵針等幾部分構成，通常用于胚胎操作的卵母細胞轉(zhuǎn)移［16］，本實驗室長期從事胚胎研究工作具有一定的技術經(jīng)驗積累，將這一技術用于細胞單克隆的挑取，尤其是山羊乳腺上皮細胞單克隆的挑取，是一種大膽的創(chuàng)新嘗試。這樣可以縮短胰酶消化時間、增加單克隆細胞的純度，從而提高細胞的活力，更利于傳代培養(yǎng)。

本研究中選擇的是hLF 轉(zhuǎn)基因乳腺上皮細胞作為研究對象，其取自于通過核移植制備的轉(zhuǎn)基因克隆山羊，隨機整合了乳腺特異性表達人乳鐵蛋白（hLF）的載體BLC14［25］。結果顯示總共獲得65 株細胞，檢測其中狀態(tài)較好的18 株單克隆細胞，最終確定有3 株（10#、11#、12#）成功地刪除了標記基因Neo，刪除效率為16.7%（3/18），后期我們將進一步擴大刪選細胞株，進行大量刪選以期獲得更多的標記基因刪除細胞株。值得注意的是我們在PCR 檢測過程中，我們應用雙重引物進行篩選，即經(jīng)hLF-Neo 引物檢測沒有條帶的細胞系理論上應為刪除標記基因的細胞株，同時還應用hLF-BLG 引物進一步檢測，確保標記基因完全刪除，實驗結果證明了該引物檢測的準確性（3 株細胞均為標記基因刪除細胞株）。此外，關于標記基因刪除效率的研究報道較多見，蘭翀等［13］對選擇標記基因（SMGs）的刪除效率研究、Cui 等［26］對紅色熒光標記基因DsRed 和綠色熒光標記基因GFP 的刪除與置換效率的研究，刪除效率均超過50%以上。但是，較少有研究者在乳腺上皮細胞中進行標記基因刪除研究，尤其是對刪除標記基因前后的表達水平相關研究更少。本實驗通過ELISA 和Western bolt 檢測首次研究標記基因刪除前后的功能蛋白hLF 表達情況。從結果來看，刪除標記基因的細胞株表達hLF 水平明顯提高至8 倍左右，表達hLF 量高達2.85 g/L，而經(jīng)過胰蛋白酶純化后的未刪除標記基因的細胞株表達水平僅約0.35 g/L?？赡苁荁LC14 乳腺特異性表達構建中的標記基因Neo 對hLF 基因表達造成較大的影響，這與很多的研究報道中闡述的標記基因本身對外源基因表達會產(chǎn)生一系列影響相吻合［6-7，27］。同時，本研究中刪除標記基因的3 株細胞表達hLF 量存在一定的微小差異，可能是因為不同的單克隆細胞株雖然來源相同，外源基因拷貝數(shù)也相同，但是單克隆細胞的純度及后期細胞生長狀態(tài)均有可能存在一定的差異所致。此外，由于轉(zhuǎn)基因中外源基因的表達受多種內(nèi)在機制的調(diào)節(jié)影響，不能單獨考慮某一特定因素，故本研究后期將進一步深入開展。

4 結論

本研究采用轉(zhuǎn)染后瞬時表達Cre 重組酶的方法，利用Cre/Loxp 系統(tǒng)成功刪除hLF 轉(zhuǎn)基因山羊乳腺上皮細胞株的標記基因，最終成功獲得3 株完全刪除標記基因的細胞株，且誘導表達檢測刪除標記基因后的hLF 目的蛋白表達水平明顯提高達8 倍，表達hLF 量達2.85 g/L。