多價(jià)抗蟲水稻外源Bt 基因的多引物多重PCR 檢測方法

方欣怡 陽菁 王井章 李陽生

（武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 水稻國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072）

水稻鱗翅目害蟲會(huì)影響水稻豐產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。稻縱卷葉螟、二化螟、三化螟對(duì)我國水稻生產(chǎn)造成的損失可占總產(chǎn)量的5%-10%，雜交水稻水稻的廣泛種植使得長江流域的三化螟危害下降，二化螟進(jìn)而變成主要害蟲［1-2］。其主要危害表現(xiàn)為造成葉片枯白、枯心苗、白穗。目前在水稻中尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)水稻鱗翅目害蟲具有抗性的稻種資源，因此過去對(duì)螟蟲的防治主要以施用農(nóng)藥為主，但也存在防治效果不佳、農(nóng)藥殘毒污染、增加成本等問題。

近10 年，我國政府大力支持轉(zhuǎn)Bt基因在糧食作物中的應(yīng)用，投入了大量的人力、財(cái)力、物力。Bt基因是來自于蘇云芽孢桿菌的一種殺蟲基因，這種轉(zhuǎn)基因水稻可在體內(nèi)表達(dá)出一種Bt 殺蟲蛋白，可特異性毒殺鱗翅目、鞘翅目昆蟲，減少殺蟲劑的使用量，是目前農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因育種主要使用的目標(biāo)抗蟲基因［3-4］。在抗蟲育種及生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，隨著Bt 殺蟲劑的大量應(yīng)用，會(huì)使害蟲產(chǎn)生抗性，作用難以持久，而使其應(yīng)用具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。不同的Bt 蛋白在昆蟲體內(nèi)的受體并不相同，同時(shí)利用多個(gè)Bt基因的多價(jià)抗蟲水稻，可以獲得抗蟲性狀的持久利用［5-7］，而且不會(huì)明顯改變農(nóng)藝性狀，單拷貝插入的后代分離符合孟德爾遺傳規(guī)律。目前國內(nèi)水稻科學(xué)家們已經(jīng)培育出一系列的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻，如轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1（轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac融合基因），轉(zhuǎn)基因水稻T2A-1（轉(zhuǎn)cry2A基因），轉(zhuǎn)基因水稻T1C-19（轉(zhuǎn)cry1C基因）等［4，5，8-10］，并利用這些轉(zhuǎn)化事件通過雜交和系統(tǒng)選育的方法，培育了一批具有商業(yè)生產(chǎn)潛力的轉(zhuǎn)基因水稻新品系。這些抗蟲新品系不僅可以用來作為新的抗性育種資源，也可以用于發(fā)展三價(jià)Bt水稻［4］。利用多個(gè)Bt基因培育多價(jià)抗蟲水稻獲得持久的抗蟲性狀是抗蟲轉(zhuǎn)基因育種的發(fā)展趨勢。

選育Bt基因純合的優(yōu)良單株是決定育種進(jìn)程的一個(gè)關(guān)鍵因素。目前常用的檢測Bt基因的分子標(biāo)記主要是根據(jù)外源插入片段序列設(shè)計(jì)的特異顯性標(biāo)記，該標(biāo)記可以檢測目標(biāo)基因的有無，無法判斷當(dāng)代植株的純合或雜合基因型，需要在下一代對(duì)基因型或者表型進(jìn)行群體驗(yàn)證［4-5，11-12］。以前的檢測方法所需時(shí)間較長，對(duì)試驗(yàn)技術(shù)條件要求較高，且受儀器、設(shè)備和電力以及空間等諸多因素的限制，不利于快速檢測以及在基層實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用［13-16］。在篩選含多個(gè)Bt抗性基因的純合后代時(shí)，利用以前的方法進(jìn)行鑒定效率較低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。根據(jù)轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)附近的序列設(shè)計(jì)多重PCR 標(biāo)記，可以有效鑒別基因型的純合和雜合［5，17-19］，特別是在多價(jià)抗性純合后代的篩選中，能提高效率，加快育種進(jìn)程。

轉(zhuǎn)Bt基因水稻TT51-1（轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac融合基因），T2A-1（轉(zhuǎn)cry2A基因）和T1C-19（轉(zhuǎn)cry1C基因），是培育抗螟蟲水稻和多價(jià)抗蟲水稻的優(yōu)良親本。本研究根據(jù)TT51-1，T2A-1 和T1C-19 中外源DNA 插入位點(diǎn)兩側(cè)基因組序列分別設(shè)計(jì)引物L(fēng) 和R，根據(jù)插入序列設(shè)計(jì)引物I，通過L+R+I 的引物組合檢測結(jié)果，不僅可以在單個(gè)抗性基因材料中同時(shí)鑒定轉(zhuǎn)基因插入事件的純合、雜合和陰性3 種基因型，還可以在雙價(jià)和三價(jià)抗蟲材料中，同時(shí)鑒定出各個(gè)抗性基因的基因型，以期為利用Bt基因進(jìn)行抗螟蟲水稻分子育種提供一個(gè)高效的基因鑒定技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)Bt基因純合系TT51-1（cry1Ab/1Ac）、T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家植物基因研究中心（武漢）提供。非轉(zhuǎn)基因水稻9311、R988、超泰B 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

分別用9311 與TT51-1，R988 與T2A-1，超泰B 與T1C-19 雜交，以獲得的F1自交得F2用于篩選單價(jià)Bt轉(zhuǎn)基因插入事件的不同基因型植株（圖1-A）；同時(shí)將三個(gè)F1彼此間兩兩雜交，在雜交F2后代中篩選雙價(jià)Bt轉(zhuǎn)基因插入事件的不同基因型（圖1-B）；在9311/TT51//R988/T2A-1 的F2后代中篩選出雙價(jià)純合TT51-1（+/+）T2A-1（+/+）基因型的水稻單株，與T1C-19（T1C-19（+/+））雜交，在雜交F2后代中篩選三價(jià)Bt轉(zhuǎn)基因插入事件的不同基因型（圖1-C）。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取方法

1.2.1.1 堿裂解法 剪下大約1-2 cm 長的水稻葉片放于2 mL 圓底離心管中，并在其中加入鋼珠和40 μL 0.25 mol/L NaOH 溶液，放在QIAGEN Tissuelyser樣品打樣機(jī)中磨碎勻漿，再加入160 μL 0.05 mol/L（pH8.0）Tris-HCl，振蕩混合搖勻后12 000 r/min 離心，取上清，得到DNA。

圖1 用于檢測的不同基因型水稻材料

1.2.1.2 CTAB 法 取約100 mg 新鮮的水稻嫩葉組織放入2 mL EP 管，在液氮冷凍條件下將組織研磨成粉末狀。再加入600 μL 2×CTAB 提取液（2×CTAB提取液使用之前加入0.2%的巰基乙醇），顛倒混勻之后放入水浴鍋中，65℃水浴30-60 min，期間每10 min 顛倒混勻一次。取出EP 管，待其冷卻后加入等體積的600 μL 的24∶1 的氯仿/異戊醇混合液，劇烈振蕩，使之充分混勻，12 000 r/min 室溫離心10 min。然后取上清液約400 μL，加入1/10 體積的3 mol/L NaAC 溶液40 μL，加入2 倍體積的無水乙醇880 μL，充分混勻后于-20℃冰箱中靜置30 min，12 000 r/min，4℃離心10 min 棄上清，再次12 000 r/min，4℃離心1 min，用100 μL 的移液槍吸去管底的多余液體。加入200 μL 75%乙醇，溫和震蕩EP 管，將沉淀彈起，清洗沉淀，8 000 r/min，4℃離心2 min后棄去上清，重復(fù)上一清洗步驟。棄去上清，再次離心，用100 μL 的移液槍吸去管底的多余液體，風(fēng)干沉淀6 min，加入50 μL 1×TE 溶液，用槍反復(fù)吹打，確保沉淀溶解完全，得到DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)方法 由NCBI 數(shù)據(jù)庫中查詢得到TT51-1（Genebank：EU880444.1）的 外 源 片 段插入序列及插入位點(diǎn)兩側(cè)水稻基因組序列，T2A-1（GenBank：HQ161063.1）的部分外源片段序列及插入位點(diǎn)左側(cè)水稻基因組序列，T1C-19（GenBank：HQ161062.1）的部分外源片段序列及插入位點(diǎn)左側(cè)水稻基因組序列。根據(jù)TT51-1 插入序列及兩側(cè)基因組序列設(shè)計(jì)L+R 及I+R 組合用于分別檢測基因組片段和插入事件。根據(jù)T2A-1 和T1C-19 插入序列及左側(cè)基因組序列設(shè)計(jì)L+I 引物組合檢測插入位點(diǎn)，在插入位點(diǎn)右側(cè)選取1 kb 左右基因組片段設(shè)計(jì)R 引物，用L+R 組合檢測基因組片段（圖2）。所有引物利用Premier5 軟件設(shè)計(jì)，引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物信息見表1，由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。

1.2.3 二引物PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測序方法 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收包含目標(biāo)片段的膠塊，用南京諾唯贊生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段DNA，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 不同PCR 擴(kuò)增體系方法

1.2.4.1 三引物PCR 擴(kuò)增體系 因?yàn)樗O(shè)計(jì)的引物退火溫度均在52-57℃之間，在此區(qū)間做梯度PCR測試發(fā)現(xiàn)溫度影響較小，最終選用56℃作為體系的退火溫度。

圖2 三引物PCR 檢測轉(zhuǎn)基因插入事件原理示意圖

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及產(chǎn)物序列

考慮到三引物多重PCR 擴(kuò)增體系中存在1 個(gè)左側(cè)引物L(fēng)、1 個(gè)右側(cè)引物R 和1 個(gè)插入序列I，引物相互之間的競爭對(duì)擴(kuò)增效果會(huì)有影響。所以，設(shè)計(jì)了幾個(gè)不同引物使用量的PCR 反應(yīng)體系，最終選用最為合適的PCR 擴(kuò)增體系即2AL1∶2AR1∶2AI1按 照0.5∶0.15∶0.35 的 比 例 進(jìn) 行 混 合 擴(kuò) 增，1AR1∶1AL1∶1AI1 或1AR1∶1AL1∶1AI2 和1CL1∶1CR1∶1CI1 或1CL2∶1CR2∶1CI2 按 照0.5∶0.15∶0.35 的比例進(jìn)行混合擴(kuò)增，分別能得到兩條大小有明顯區(qū)別且明亮的條帶。能區(qū)分轉(zhuǎn)基因雜合體、轉(zhuǎn)基因純合體和非轉(zhuǎn)基因材料，在雜合體中擴(kuò)增出清晰的片段，片段大小分別與純合體和陰性材料中的片段大小一致，表現(xiàn)在雜合體兩條片段的擴(kuò)增量幾乎一致。

轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)側(cè)翼引物L(fēng)+R 用于擴(kuò)增基因組序列，L/R+插入序列特異引物I 用于檢測特異轉(zhuǎn)基因事件。利用L+R+I 的三引物組合，在轉(zhuǎn)基因純系材料TT51-1、T2A-1、T1C-19 中，僅能擴(kuò)出特異轉(zhuǎn)基因事件條帶。在轉(zhuǎn)基因陰性材料9311、R988、超泰B 中，僅能擴(kuò)出基因組序列條帶。在轉(zhuǎn)基因雜合材料9311/TT51-1、R988/T2A-1、超泰B/T1C-19 中，能擴(kuò)出兩條預(yù)期大小條帶。

PCR 反應(yīng)體系為30 μL，其中包含2×mix 15 μL（諾唯贊green mix），DNA 模板2 μL 和合適量的三引物L(fēng)、R 和I（引物濃度為10 μmol/L，引物使用量根據(jù)優(yōu)化結(jié)果確定）。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5℃反應(yīng)5 min，然后進(jìn)入三溫度循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括 94℃反應(yīng)30 s，56℃反應(yīng)45 s，72℃反應(yīng)1 min，共30 個(gè)循環(huán)，最后72℃反應(yīng)5 min。

1.2.4.2 六引物PCR 擴(kuò)增體系 為了測試不同Bt基因的三引物體系能否同時(shí)使用以檢測雙價(jià)和三價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻，將9311/TT51-1、R988/T2A-1 和超泰B/TIC-19 兩兩雜交，在雜交后代中利用3 種三引物體系檢測篩選出不同基因型的雙價(jià)水稻單株，以這些后代DNA 作為模板，分別利用不同引物組合進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

設(shè)計(jì)了幾個(gè)不同引物使用量的PCR 反應(yīng)體系，最終選用最為合適的PCR 擴(kuò)增體系：

檢 測TT51-1和T2A-1的6 條 引 物，1AR1∶1AL1∶1AI1∶2AL1∶2AR1∶2AI1 按 照0.4∶0.1∶0.5∶0.4∶0.1∶0.5 的比例進(jìn)行混合擴(kuò)增；檢測TT51-1和T1C-19的6 條 引 物，1AR1∶1AL1∶1AI1∶1CL1∶1CR1∶1CI1 按 照0.5∶0.05∶0.45∶0.5∶0.05∶0.45 的比例進(jìn)行混合擴(kuò)增；檢測T2A-1和T1C-19的6 條引物，2AL1∶2AR1∶2AI1∶1CL1∶1CR1∶1CI1 按 照0.4∶0.15∶0.45∶0.4∶0.15∶0.45的比例進(jìn)行混合擴(kuò)增。

PCR 反應(yīng)體系為30 μL，其中包含2×mix 15 μL（諾唯贊green mix），DNA 模板2 μL 和合適量的6條引物（引物濃度為10 μmol/L，引物使用量根據(jù)優(yōu)化結(jié)果確定）。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5℃反應(yīng)5 min，然后進(jìn)入三溫度循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括 94℃反應(yīng)30 s，56℃反應(yīng)45 s，72℃反應(yīng)1 min，共30 個(gè)循環(huán)，最后72℃反應(yīng)5 min。

1.2.4.3 九引物PCR 擴(kuò)增體系 進(jìn)一步希望利用3 組引物組合同時(shí)檢測3 個(gè)Bt基因的基因型。將9311/TT51-1 x R988/T2A-1 F2 后代中基因型為雙價(jià)純合的單株與T1C-19 雜交，獲得基因型為TT51-1（+/-）T2A-1（+/-）T1C-19（+/-）水稻材料，用于檢測9 條引物組合的擴(kuò)增效果。在多引物PCR 體系中，隨著引物數(shù)量的增減，多重引物之間存在的引物間的相互干擾的難度加劇。因此，針對(duì)9 條引物組合，設(shè)計(jì)了不同引物使用量的27 個(gè)PCR 反應(yīng)體系（表2）。

在三引物的基礎(chǔ)，把各自適合的引物體系混合在一起后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)可以出現(xiàn)6 條大小不同的目的條帶，但有的太微弱。故考慮調(diào)整引物濃度配比，優(yōu)化后得到最佳引物配比1AR1∶1AL1∶1AI1∶2AL1∶2AR1∶2AI1∶1CL1∶1CR1∶1CI1 為0.4∶0.15∶0.45∶0.4∶0.1∶0.5∶0.4∶0.15∶0.45，PCR 反應(yīng)體系為30 μL，其中包含2×mix 15 μL（諾唯贊green mix），DNA 模板2 μL 和最適量的9 條引物（引物濃度為10 μmol/L，引物使用量根據(jù)優(yōu)化結(jié)果確定）。

表2 三價(jià)轉(zhuǎn)基因材料PCR 不同9 條引物比例擴(kuò)增體系

PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5℃反應(yīng)5 min，然后進(jìn)入三溫度循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括 94℃反應(yīng)30 s，56℃反應(yīng)45 s，72℃反應(yīng)1 min，共30 個(gè)循環(huán)，最后72℃反應(yīng)5 min。

2 結(jié)果

2.1 三引物PCR體系對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻材料擴(kuò)增的特異性檢測

以不同類型水稻DNA 為模板，分別利用不同引物組合進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的條帶（圖3）。

對(duì)引物L(fēng)+R、L/R+I 和L+R+I 在不同水稻材料中擴(kuò)增出的片段的測序結(jié)果顯示陰性條帶與預(yù)期有所差別（表3），原因是我們以NCBI 數(shù)據(jù)庫中TT51-1、T2A-1、T1C-19 三個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的部分插入序列和日本晴的基因組為參考序列設(shè)計(jì)引物，但實(shí)際PCR 擴(kuò)增檢測的是其他水稻品種，因此陰性條帶存在些許差異；陽性條帶與預(yù)期結(jié)果完全一致，均能擴(kuò)增出目標(biāo)片段。

2.2 不同轉(zhuǎn)基因水稻材料擴(kuò)增及條件優(yōu)化

2.2.1 雙價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻材料擴(kuò)增及條件優(yōu)化 由圖4 可以看出，不同的6 條引物組合能夠在雙價(jià)轉(zhuǎn)基因材料中擴(kuò)增出預(yù)期大小條帶。

2.2.2 三價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻材料擴(kuò)增及條件優(yōu)化 由圖5-A 可見，在三價(jià)雜合轉(zhuǎn)基因水稻（TT51-1（+/-）T2A-1（+/-）T1C-19（+/-））中，體系24 的擴(kuò)增效果最好，6 條擴(kuò)增條帶均清晰可見。

圖3 三引物PCR 體系在水稻材料中的擴(kuò)增

預(yù)期大小/bp 實(shí)際大小/bp 9311 716 718 TT51-1 937 937 9311/TT51-1 716 + 937 718 + 937 2AR1+2AL1+2AI1預(yù)期大小/bp 實(shí)際大小/bp R988 406 434 T2A-1 600 600 R988/T2A-1 406 + 600 434 + 600 1CR1+1CL1+1CI1預(yù)期大小/bp 實(shí)際大小/bp超泰B 790 792 T1C-19 495 495超泰B/T1C-19 790 + 495 792 + 495

在9311/TT51//R988/T2A-1（TT51-1（+/+）T2A-1（+/+））x T1C-19（T1C-19（+/+））的F2代植株中，利用多引物檢測體系分別篩選含有單價(jià)、雙價(jià)、三價(jià)不同Bt基因型的水稻單株，用于檢測9 條引物檢測體系的特異性。利用體系24 的引物配比，對(duì)不同基因型的轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行了檢測，結(jié)果（圖5-B）表明9 條引物PCR 體系可以準(zhǔn)確區(qū)分3 種Bt基因的不同基因型。

圖4 6 條引物PCR 體系檢測雙價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻

同時(shí)也檢測了該P(yáng)CR 體系對(duì)不同提取方法所獲得的DNA 模以及對(duì)不同商用PCR 擴(kuò)增試劑的通用性（圖5-C），發(fā)現(xiàn)對(duì)于堿裂解法粗提的DNA 和CTAB 提取的DNA 作為模板進(jìn)行擴(kuò)增效果沒有明顯差別，對(duì)不同的商用試劑也有很好的兼容性。

2.3 單價(jià)或多價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻材料的分子檢測

根據(jù)雜交親本的基因型狀況不同，利用該檢測方法能夠在F2或者F3代中快速鑒定出單價(jià)、雙價(jià)和三價(jià)Bt轉(zhuǎn)基因水稻的轉(zhuǎn)基因純合單株。隨機(jī)選取了基因型為TT51-1（+/-）T2A-1（+/-）T1C-19（+/-）自交后代里的288 株，提取DNA 后做9 條引物PCR檢測結(jié)果見表4。

圖5 9 條引物PCR 體系檢測3 價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻

3 討論

利用Bt基因能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)螟蟲的抗性，已經(jīng)在國內(nèi)外多年的研究和商業(yè)化種植得到充分證明。但同時(shí)也存在長時(shí)間大規(guī)模利用單一Bt抗性基因后，使害蟲產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)。選育帶有多個(gè)不同Bt基因的多價(jià)轉(zhuǎn)基因作物，是降低這一風(fēng)險(xiǎn)的有效手段［5-7］。然而抗蟲性在形狀上通常表現(xiàn)為顯性或者半顯性，因此很難從表型鑒定上來判斷多個(gè)Bt基因的導(dǎo)入以及純合/雜合情況。利用分子標(biāo)記輔助選擇手段，可以在選育后代中檢測多個(gè)Bt基因的導(dǎo)入情況，對(duì)于這種多個(gè)功能類似外源基因?qū)氲倪x育，具有更明顯的優(yōu)勢，能夠加快選育進(jìn)程。常用的Bt基因分子標(biāo)記，多是根據(jù)插入片段設(shè)計(jì)的特異顯性標(biāo)記，而無法判斷當(dāng)代植株的純合或雜合情況［20］。

利用轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)附近的序列設(shè)計(jì)三引物的多重PCR，可以在一個(gè)反應(yīng)中鑒定Bt基因的純合、雜合和轉(zhuǎn)基因陰性，能大大提高檢測效率［5］。因此利用多重PCR 的方法，理論上也可以同時(shí)檢測多價(jià)Bt轉(zhuǎn)基因后代的基因型。多重PCR 可以在 PCR 反應(yīng)中同時(shí)加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因，利用一次 PCR 反應(yīng)，就能同時(shí)檢測多個(gè)靶標(biāo)基因，與傳統(tǒng) PCR 方法相比，具有低耗時(shí)、高通量、節(jié)省樣品的優(yōu)點(diǎn)［21］，但同時(shí)在引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)條件優(yōu)化上也存在著不小的技術(shù)難度。在本研究中，我們針對(duì)已經(jīng)獲得轉(zhuǎn)基因安全證書的轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1（轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac融合基因）、以及在轉(zhuǎn)基因育種研究中被廣泛使用的供體材料T2A-1（轉(zhuǎn)cry2A基因）和T1C-19（轉(zhuǎn)cry1C基因），設(shè)計(jì)了一系列多重引物，用于在水稻選育材料中檢測單價(jià)、二價(jià)、三價(jià)轉(zhuǎn)Bt基因的基因型，以便盡快確認(rèn)Bt基因的純合或者雜合狀態(tài)，解決抗蟲表型鑒定無法區(qū)分單價(jià)和多價(jià)的問題，能夠加快抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的選育進(jìn)程。

表4 在TT51-1（+/-）T2A-1（+/-）T1C-19（+/-）自交后代中隨機(jī)選取288 個(gè)水稻樣品，用9 條引物檢測法進(jìn)行快速鑒別后代基因型的結(jié)果統(tǒng)計(jì)

多重PCR 的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)難度隨著擴(kuò)增片段的增加而遞增，要避免引物間的相互結(jié)合，引物與模板上目標(biāo)片段以外的非特異性結(jié)合，還要注意不同擴(kuò)增片段間的擴(kuò)增效率差異引起的資源競爭以及不同擴(kuò)增片段的檢測區(qū)分［21］。本研究中，我們針對(duì)3 個(gè)轉(zhuǎn)化事件合理設(shè)計(jì)了多重PCR 引物，最多可以同時(shí)利用9 條引物檢測3 個(gè)Bt基因的轉(zhuǎn)基因情況。本研究設(shè)計(jì)的9 條引物PCR 擴(kuò)增體系產(chǎn)物條帶清晰，條帶大小區(qū)分明顯，在普通瓊脂糖凝膠上即可有效區(qū)分，不需要借助熒光探針或者聚丙烯酰胺凝膠電泳等較昂貴或較費(fèi)時(shí)的檢測手段。

在聚合多價(jià)Bt基因的檢測過程中，會(huì)涉及到大量的DNA 提取，按照傳統(tǒng)的CTAB 提取方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。利用NaOH 和Tris-HCl 能快速提取水稻DNA 用于PCR 檢測，但提取的DNA 質(zhì)量卻不如傳統(tǒng)CTAB提取方法。在不同PCR 反應(yīng)體系中的測試結(jié)果表明，用常用的國產(chǎn)或者進(jìn)口PCR 反應(yīng)試劑均能獲得較好的擴(kuò)增結(jié)果。對(duì)DNA 模板的測試結(jié)果也表明，不論是經(jīng)過裂解、抽提、純化的基因組DNA，還是粗提未經(jīng)純化的基因組DNA，均能得到一致的檢測結(jié)果。這些測試說明本次設(shè)計(jì)的多重PCR 體系，能夠快速、有效、經(jīng)濟(jì)地對(duì)大量育種后代進(jìn)行Bt基因型的檢測，以配合后續(xù)的農(nóng)藝性狀評(píng)估，綜合篩選出合適的選育后代。表3 檢測結(jié)果只需要一個(gè)工作日時(shí)間便可獨(dú)立完成，從用堿裂解法粗劣提取DNA，到PCR 擴(kuò)增，跑膠電泳，最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果，體現(xiàn)了本方法的高效性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該檢測方法的可靠性，且在不同實(shí)驗(yàn)試劑中具有良好的兼容性。

利用Bt基因進(jìn)行抗螟蟲水稻育種是防治水稻螟蟲的有效途徑，多價(jià)Bt轉(zhuǎn)基因水稻的選育是抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻品種改良的一個(gè)重要方向，多引物多重PCR 方法的建立為利用多價(jià)Bt基因抗螟蟲水稻分子育種提供了一個(gè)簡便有效的基因檢測技術(shù)，將有助于提高對(duì)Bt基因的檢測效率，加快抗螟蟲水稻的育種進(jìn)程。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)多價(jià)轉(zhuǎn)Bt抗蟲水稻設(shè)計(jì)多重引物及反應(yīng)體系，可在瓊脂糖膠上快速區(qū)分代表TT51-1、T2A-1、T1C-19 事件插入的陽性、陰性條帶，用于對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因插入事件水稻的純合、雜合、陰性進(jìn)行檢測，且對(duì)不同的PCR 試劑及不同提取方法的DNA模板都有很好的兼容性。