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    基于聚集誘導發(fā)光的熒光適體傳感器檢測Ag+

    2019-12-04 02:59:44田會麗糜唯鈺王周平
    食品科學 2019年22期
    關(guān)鍵詞:黑磷探針熒光

    田會麗,孟 云,趙 森,糜唯鈺,姬 華,王周平,,*

    (1.石河子大學食品學院,新疆 石河子 832003;2.江南大學食品學院,江蘇 無錫 214122)

    銀在自然界中分布廣泛,主要應(yīng)用于電氣工業(yè)、攝影和成像工業(yè)以及制藥工業(yè)[1]。關(guān)于銀與必需營養(yǎng)素(尤其是硒、銅和VE和VB12)相互作用的研究越來越多,人們開始關(guān)注其潛在的毒性。美國環(huán)境保護局規(guī)定,水中的Ag+濃度不應(yīng)超過0.9 μmol/L。相比其他形式的銀,Ag+毒性最大[2]。因此,高靈敏和選擇性方法的發(fā)展檢測水介質(zhì)中痕量的Ag+對環(huán)境和人類健康具有相當重要的意義。目前,Ag+的檢測方法很多,如原子吸收光譜法[3]、催化動力學光度法[4]、電感耦合等離子質(zhì)譜法[5]等。雖然這些方法具有高選擇性和靈敏度,但也存在預(yù)處理復(fù)雜、耗時長、成本高等缺點,不利于實際應(yīng)用。因此,傳統(tǒng)的熒光探針已經(jīng)不適用于檢測水中的銀離子,開發(fā)一種快速、簡單、靈敏的銀離子檢測方法是非常重要的。

    適配體由于親和性高和易于修飾等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于重金屬的檢測。DNA金屬堿基對因其在傳感應(yīng)用中的潛力而備受關(guān)注。一些金屬離子可以選擇性地與DNA雙鏈體中的一些天然或人工堿基結(jié)合,形成金屬介導的堿基對[6]。這通常會導致DNA雙鏈體的熱穩(wěn)定性增加。特別是,DNA-金屬堿基對通常用于促進單鏈或雙鏈寡核苷酸的結(jié)構(gòu)變化,例如,DNA雙鏈體中的C—C對能夠?qū)iT捕獲Ag+以形成C—Ag+—C結(jié)構(gòu),形成一個穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu),從而提高DNA鏈的解鏈溫度[7-11]。周學輝等[12]利用C—Ag+—C錯配釋放出富含G堿基的序列從而形成G-四聚體,建立了Ag+的傳感比色檢測方法,該方法的檢測限可達6.3 nmol/L,具有操作簡便、無需修飾等優(yōu)點。

    黑磷是一種新型的二維層狀晶體。黑磷的直接帶隙結(jié)構(gòu)[13]和帶隙穩(wěn)定性使其廣泛應(yīng)用于光電領(lǐng)域,幾乎覆蓋了整個電磁波譜范圍[13-15]。基于黑磷與氧化石墨烯性質(zhì)相似,黑磷在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用也得以迅速發(fā)展,包括藥物輸送、氣體檢測、疾病治療和生物醫(yī)學成像等領(lǐng)域。黑磷因具有良好的消光系數(shù)、熱轉(zhuǎn)換效率特性、良好的生物降解性和生物低毒性等優(yōu)點,在光動力治療、藥物負載、熱處理和光成像等方面也有很大的優(yōu)勢[16-19]。

    聚集誘導熒光淬滅(aggregation-caused quenching,ACQ)現(xiàn)象很容易發(fā)生在傳統(tǒng)有機熒光探針中,導致這種現(xiàn)象的主要因素是高濃度的熒光探針容易在聚集態(tài)發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象,影響探針靈敏度,這是使用熒光信號檢測技術(shù)所極力避免的現(xiàn)象[20-23]。而9,10-二苯乙烯基蒽季銨鹽(9,10-distyryl sulfonium quaternary ammonium salt,DSAI)生物熒光探針與其他傳統(tǒng)的熒光分子相比,其最大的優(yōu)勢在于它在高濃度或聚集狀態(tài)下不會發(fā)生ACQ現(xiàn)象,且操作簡便、耗時短[24]。聚集誘導發(fā)光現(xiàn)象因其獨特的性質(zhì)及其在生物、醫(yī)學領(lǐng)域以及食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用得到越來越多的科研工作者的關(guān)注。基于此,本研究旨在將聚集誘導發(fā)光材料與適配體識別技術(shù)以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)相結(jié)合并應(yīng)用于食品安全檢測中,通過將具有聚集誘導發(fā)光現(xiàn)象的分子與這些新型、便捷的分析技術(shù)結(jié)合起來以建立更高效、更靈敏、更準確的新型檢測方法。聚集誘導發(fā)光技術(shù)的利用將會為食品安全檢測方法提供一個新的平臺。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    所有的試劑和材料均為商業(yè)材料且不需純化即可使用。Ag+適配體(CCTCCCTCCCTCCCTTTTTCCCA CCCACCCACC)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;醋酸(HAc)、N,N-二甲基甲酰胺(均為分析純),三(羥甲基)氨基甲烷(Tris,生物試劑) 國藥集團化學試劑有限公司;AgNO3、HNO3等試劑均為分析純;實驗用水均為Milli水系統(tǒng)處理的去離子水。

    1.2 儀器與設(shè)備

    UV-1800紫外-可見光吸收光譜 日本Shimadzu公司;F-7000發(fā)光分光光度計 日本日立公司;JEM-2100透射電子顯微鏡 日本Jeol公司;Dimension ICON原子力顯微鏡 德國布魯克科技有限公司;KQ-300E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TGL-16M臺式高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;Starter 3C pH計 奧豪斯儀器(上海)有限公司;Direct-Q3超純水制備儀 美國Millipore公司。

    1.3 方法

    1.3.1 BPNS的制備及結(jié)構(gòu)表征

    黑磷納米片(black phosphorus nanosheet,BPNS)制備:黑磷粉末中加入超純水,超聲波分散機超聲4 h,功率為300 W,然后將溶液于4 ℃、6 000 r/min離心30 min,取上清液備用。使用透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡分別對BPNS的結(jié)構(gòu)尺寸進行表征。

    1.3.2 適配體濃度優(yōu)化

    適配體濃度直接影響反應(yīng)液的熒光強度以及實驗的最低檢測限,所以要對適配體濃度進行優(yōu)化。在EP管中加入不同濃度的適配體儲備溶液(0、1、5、8、10、50、80、100 nmol/L)并與5 μL DSAI混合,然后加入Tris-HAc緩沖液(20 mmol/L、pH 7.0)確保反應(yīng)總體系為500 μL,室溫下測定熒光發(fā)射光譜。

    1.3.3 BPNS濃度優(yōu)化

    BPNS作為熒光淬滅材料,其濃度會影響該傳感系統(tǒng)的靈敏度。將優(yōu)化好的適配體儲備溶液與EP管中的5 μL DSAI混合,然后加入一系列不同濃度的BPNS上清液,然后將緩沖液加入到EP管中以確保反應(yīng)總體系為500 μL,并且在室溫下測定熒光光譜確定最佳濃度。

    1.3.4 靈敏性和選擇性測定

    在最優(yōu)條件下,將不同質(zhì)量濃度的靶標Ag+(0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500 ng/mL)依次加入EP管中,加入Tris-HAc緩沖液(20 mmol/L、pH 7.0),保證反應(yīng)總體系為500 μL,室溫下測定熒光光譜。

    為了評估該實驗用于高度特異性檢測Ag+的能力,選擇7 種不同的金屬離子(Fe3+、K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Pb2+和Cu2+)分別進行測試,所有的金屬離子都以相同的濃度進行實驗。所有其他檢測條件與Ag+檢測中使用的條件相同。

    1.3.5 純凈水中Ag+加標回收測定

    為了證明這種方法的可行性,選擇純凈水作為加標回收實驗的樣品。將3 種不同質(zhì)量濃度的Ag+(1、10 ng/mL和50 ng/mL)加入水樣品中以獲得試驗樣品。將不同質(zhì)量濃度的Ag+溶液分別與50 μL 120 nmol/L的適配體和60 μL/100 μL的BPNS進行混合,加入Tris-HAc緩沖液(20 mmol/L、pH 7.0)確保反應(yīng)總體系為500 μL,孵育40 min。然后10 000 r/min離心10 min。最后將5 μL DSAI加入反應(yīng)體系中,孵育30 min后室溫測定熒光發(fā)射光譜。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    靈敏性和選擇性實驗和加標回收實驗的所有數(shù)據(jù)均測量3 次。本實驗的所有數(shù)據(jù)采用Origin pro 9.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 BPNS的制備及其結(jié)構(gòu)表征

    圖1 用于檢測Ag+的適配體傳感器示意圖Fig. 1 Schematic illustration of the aptasensor for detection of Ag+

    如圖1所示,選取一段富含胞嘧啶的Ag+核酸適配體,首先在Ag+存在下,適配體與靶標作用生成C—Ag+—C結(jié)構(gòu),從而使核酸適配體的構(gòu)象從無序狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閁型結(jié)構(gòu)[25-26]。這種結(jié)構(gòu)一般情況下比較穩(wěn)定,不會被破壞。由于適配體的U型結(jié)構(gòu),當加入BPNS后適配體不會被BPNS吸附。DSAI分子是帶有正電的水溶性熒光探針,可以通過靜電吸附作用以及疏水相互作用與核酸適配體進行結(jié)合[27],因此溶液體系熒光增強,當適配體與Ag+之間形成穩(wěn)定的發(fā)夾型結(jié)構(gòu)后,DSAI分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限,能量以非輻射耗散的形式釋放,因此,溶液體系的熒光進一步增強,從而產(chǎn)生聚集誘導發(fā)光現(xiàn)象。反之,若溶液中為其他金屬離子時,適配體的構(gòu)象不會發(fā)生改變,仍然保持無規(guī)則結(jié)構(gòu)。加入BPNS后,BPNS通過靜電吸附作用使適配體吸附在BPNS表面。DSAI通過靜電吸附作用和疏水作用纏繞在適配體上,同時,DSAI的熒光因為熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用被BPNS淬滅,溶液不發(fā)光。所以通過觀察DSAI熒光強度的變化,即可以檢測溶液中的Ag+。

    BPNS獨特的物理化學性質(zhì)取決于它的形狀和厚度。利用液相剝離法,通過多次超聲和離心清洗制備納米尺寸的BPNS。BPNS的透射電子顯微鏡圖像(圖2A)顯示,其結(jié)構(gòu)近似為片狀,表明BPNS制備成功。通過原子力顯微鏡進一步表征制備的BPNS的厚度。圖2B~D為BPNS的原子力顯微鏡圖像,通過計算得出所制備的BPNS的平均厚度約為15 nm(圖2D)。

    圖2 BPNS的透射電子顯微鏡(A)和原子力顯微鏡(B~D)圖像Fig. 2 Transmission electron microscope (A) and atomic force microscope (B-D) images of BPNS

    2.2 適配體濃度優(yōu)化

    在該傳感系統(tǒng)中使用的適配體濃度直接影響反應(yīng)液的熒光強度以及實驗的最低檢測限,所以要對適配體的濃度進行優(yōu)化。如圖3所示,隨著適配體濃度的增加,反應(yīng)液的熒光強度逐漸增強。然而,當適配體濃度達到80 nmol/L后熒光強度基本保持恒定。因此選擇適配體的濃度為80 nmol/L進行后續(xù)實驗。

    圖3 DSAI在不同濃度的適配體中的熒光光譜Fig. 3 Fluorescence spectra of DSAI with different concentrations of aptamers

    2.3 BPNS添加量的優(yōu)化

    BPNS作為熒光淬滅材料,濃度大小會直接影響實驗結(jié)果的準確性以及靈敏度。因此,在確定適配體的濃度為80 nmol/L后,依次加入不同濃度的BPNS上清液并確定其最佳添加量。如圖4所示,隨著BPNS上清液添加量的增加,DSAI的熒光強度逐漸降低,表明DSAI的熒光被BPNS淬滅的程度越來越高。因為高濃度的BPNS會對熒光產(chǎn)生遮蔽效應(yīng)以及為了提高實驗結(jié)果的靈敏度以及準確性,最終選擇60 μL/100 μL作為BPNS的最佳添加量。

    圖4 DSAI在不同添加量的BPNS中的熒光光譜Fig. 4 Fluorescence spectra of DSAI with different concentrations of BPNS

    2.4 熒光適體傳感器的分析性能

    為研究該熒光適體傳感器的靈敏度,在優(yōu)化的實驗條件下檢測0~500 ng/mL的Ag+。如圖5所示,溶液的熒光強度恢復(fù)并增強,表明隨著Ag+濃度的增加,DSAI/適配體/Ag+與BPNS之間的相互吸附作用減弱,使得DSAI/適配體/Ag+遠離BPNS并且避免了DSAI的熒光被BPNS淬滅,使得溶液熒光恢復(fù)并增強。說明靶標Ag+可以被特異性識別。該熒光適體傳感器的熒光強度(Y)與Ag+質(zhì)量濃度的對數(shù)(X)呈正相關(guān),且在Ag+質(zhì)量濃度為0.01~100 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。其線性方程為Y=22.52X+675.12,R2=0.991 2,檢測限為0.002 ng/mL。

    圖5 不同質(zhì)量濃度Ag+時DSAI的熒光光譜Fig. 5 Fluorescence spectra of DSAI with different concentrations of Ag+

    圖6 其他金屬離子干擾性考察Fig. 6 Relative fluorescence intensity of the biosensor in the presence of other coexisting metal ions

    為了評估該熒光適體傳感器對Ag+的特異性,利用該熒光適體傳感器對其他重金屬離子進行干擾性實驗檢測。如圖6所示,Ag+適配體對鉀離子和鎂離子有一定的親和性,但由于Ag+適配體對鉀離子和鎂離子產(chǎn)生的熒光強度低于對銀離子的熒光強度的20%,并且含有Ag+溶液的熒光強度比檢測系統(tǒng)中的其他干擾物具有更明顯的信號,說明該方法具有良好的選擇性,其他干擾物可能不會影響檢測系統(tǒng)。這是由于適配體能與靶標Ag+特異性結(jié)合并形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu),導致適配體的構(gòu)象發(fā)生改變,且DSAI從BPNS上釋放并聚集吸附在發(fā)夾結(jié)構(gòu)上,因此使得溶液的熒光能夠恢復(fù)和增強。結(jié)果表明,所構(gòu)建的生物傳感器對Ag+具有良好的特異性。

    目前報道的關(guān)于銀離子檢測的文獻,如Sun Jian等[28]研究組報道了一種具有超靈敏檢測銀離子的納米材料AuNCs,但這種材料在低濃度下具有較高的毒性;Anand等[29]開發(fā)了一種熒光探針Cysan,但這種探針的水溶性差,限制了其在實際中的應(yīng)用;Yang Yue等[30]利用二萘嵌苯熒光探針結(jié)合適配體檢測水中的銀離子,探針在水溶液中會發(fā)射熒光,影響探針的靈敏度,使檢測限上升。Ono等[31]開發(fā)了一個由熒光標記的寡核苷酸探針和淬滅劑,在核酸適配體的一端修飾熒光基團,另一端修飾熒光淬滅基團,它對Ag+檢測靈敏且選擇性高,但這種探針價格昂貴,不利于實際應(yīng)用。與丁靜等[32]開發(fā)的利用單壁碳納米管猝滅效檢測Ag+相比,本實驗具有較低的檢測限。除此之外,本實驗無需進行FAM標記,從而降低了實驗成本。

    2.5 純凈水中Ag+加標回收測定

    為了評估該傳感系統(tǒng)在實際應(yīng)用中的可行性和可靠性,通過標準加入法確定3 種不同Ag+濃度的回收率。將樣品摻入不同Ag+量的水樣中。在該實驗中每組數(shù)據(jù)重復(fù)3 次。如表1所示,回收率在94.9%~105.82%之間。結(jié)果證明該傳感器方法可用于分析實際樣品。

    表1 適配體測定法檢測純凈水樣品中Ag+的回收率Table 1 Recovery rates of Ag+ by aptamer assay in puri fied water samples

    3 結(jié) 論

    本實驗開發(fā)了一種超靈敏的生物傳感器,基于聚集誘導發(fā)光現(xiàn)象的熒光探針和適配體識別技術(shù)檢測Ag+。由于巧妙的設(shè)計,檢測限低至0.002 ng/mL,比世界衛(wèi)生組織最新發(fā)布的指導標準[33]允許的Ag+限值低50 倍。與用于Ag+分析的其他方法相比,該方法不需要對所需適配體進行額外修飾,具有簡單和低成本的優(yōu)點。聚集誘導發(fā)光分子DSAI與其他傳統(tǒng)的熒光分子相比,能很好地避免在高濃度或聚集狀態(tài)下不會發(fā)生ACQ現(xiàn)象,且操作簡便、穩(wěn)定性強、耗時短。然而,在這項工作中只檢測到一種分析物。因此,未來的工作應(yīng)該集中在多分析物的測定上,為豐富和提高食品安全檢測技術(shù)提供了新的思路。

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