• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    金磁微粒模擬酶檢測食品中的葡萄糖

    2019-12-04 02:59:42韓博林關(guān)樺楠龔德狀遇世友劉曉飛
    食品科學(xué) 2019年22期
    關(guān)鍵詞:過氧化物光度葡萄糖

    韓博林,關(guān)樺楠*,龔德狀,遇世友,劉曉飛,張 娜

    (哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150076)

    天然活性酶由于其催化效率高和特異性強(qiáng)已被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域。但因其在過酸、過堿條件下容易失活、不易保存、價(jià)格較昂貴等諸多限制因素,尋找既具有天然酶的催化活性又能克服天然酶不足的模擬酶成為研究熱點(diǎn)。隨著納米技術(shù)的高速發(fā)展,許多納米材料已被證實(shí)具有固有的過氧化物酶活性,同時(shí)一些復(fù)合納米材料展現(xiàn)出更優(yōu)良的模擬酶活性在諸多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-6]。其中Fe3O4磁性納米粒子具有內(nèi)在的過氧化物酶活性,它結(jié)合了磁性分離、合成簡單、成本低的優(yōu)點(diǎn)。但是,暴露的納米顆粒容易被氧化,在Fe3O4表面官能化具有過氧化物酶活性的其他納米顆??梢越鉀Q這個(gè)問題,并且提高復(fù)合納米顆粒的過氧化物酶樣活性。金磁微粒是一種表面包含金納米粒子,內(nèi)核為磁性材料的復(fù)合納米微粒[7-8]。在快速富集分離的基礎(chǔ)上,還具有良好的單分散性、穩(wěn)定性、生物適應(yīng)性和光學(xué)性能,因此被廣泛應(yīng)用于生物催化、生物醫(yī)學(xué)、食品安全檢驗(yàn)等諸多領(lǐng)域[9-13]。單金屬Fe3O4納米粒子和金納米粒子(AuNPs)均表現(xiàn)出優(yōu)異的過氧化物酶活性[14-15]。因此,將AuNPs負(fù)載到Fe3O4納米粒子表面合成復(fù)合微粒,不僅可以提升其過氧化物酶活性,而且增強(qiáng)了穩(wěn)定性和生物相容性,有利于納米粒子的分離和回收。與天然酶相比納米材料模擬酶具有穩(wěn)定、低成本、易保存的優(yōu)點(diǎn)使其在食品分析與檢測方面具有廣泛的應(yīng)用。葡萄糖是一種多羥基醛,其在生命科學(xué)及食品領(lǐng)域具有非常重要意義與地位。葡萄糖檢測方法主要有色譜法、光譜法和電化學(xué)法等[16-18]。但是,這些方法都有著各自對(duì)于儀器、操作人員、成本等的限制因素。因此構(gòu)建一種高靈敏、高選擇性、快速簡便的檢測新方法有著重要的應(yīng)用價(jià)值[19-21]。本實(shí)驗(yàn)采用水熱法制備Fe3O4納米粒子,并通過表面氨基化與金納米粒子自組裝方法構(gòu)建金磁微粒(Fe3O4@Au),利用其模擬過氧化物酶活性構(gòu)建葡萄糖檢測體系。體系中葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOx)作用于葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生H2O2,F(xiàn)e3O4@Au模擬酶催化反應(yīng)產(chǎn)物H2O2與過氧化物酶底物二按鹽2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)產(chǎn)生顯色反應(yīng)。體系以此原理建立了高靈敏、高選擇性、可視化檢測葡萄糖含量的簡便方法,相關(guān)結(jié)果將為拓寬納米材料模擬酶在食品檢測中的應(yīng)用提供一定的參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    新鮮蘋果 哈爾濱市家樂福超市。

    GOx(TypeX-SG7141-50KU, from Aspergillus niger)美國Sigma-Aldrich公司;FeCl3·6H2O、NaAc·3H2O、PEG-4000、葡萄糖、ABTS 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;3-氨丙基三乙氧基硅烷((3-aminopropyl)triethoxysilane,APTES) 淮安和元化工有限公司;氯金酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    水熱反應(yīng)釜 西安洪辰儀器廠;恒溫振蕩搖床金壇市精工儀器設(shè)備有限公司;MAGNA-IR560E.S.P型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司;phi-5000Versaprobe型X射線光電子能譜儀 美國ULVCAPHI公司;UV2250型紫外-可見光分光光度計(jì) 北京桑翌科技發(fā)展有限公司;H-7500型透射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社;BT-9300H型激光粒度分布儀 美國麥克儀器公司;9600型振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì) 美國LDJ Electronics公司。

    1.3 方法

    1.3.1 Fe3O4納米粒子的制備

    將1.35 g的FeCl3·6H2O溶于40 mL乙二醇中,依次加入3.6 g的NaAc·3H2O與1.0 g的PEG-4000,形成均勻溶液后再攪拌30 min。然后將溶液倒入50 mL水熱反應(yīng)釜中,200 ℃保持8 h,反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫,所得黑色的產(chǎn)物分別用乙醇和水各洗滌3 次[22]。

    1.3.2 金納米粒子的綠色制備

    取200 mL的蒸餾水加熱至80 ℃,加入100 g葡萄皮浸泡30 min。將浸泡液于4 000 r/min離心3 min,取上清液,以此上清液作為母液。使用去離子水稀釋母液獲得母液體積分?jǐn)?shù)為20%的葡萄皮工作液200 mL,于冰箱4 ℃保存。取4 ℃預(yù)冷的氯金酸溶液20 mL置于燒杯中,伴隨磁力攪拌器溫和攪動(dòng)2 min后,迅速加入20%的葡萄皮工作液5 mL,隨即觀察顏色的變化,即由黃色變?yōu)樽仙僮優(yōu)榫萍t色,當(dāng)體系顏色出現(xiàn)酒紅色時(shí),攪拌速率提升,20 min后結(jié)束反應(yīng),將反應(yīng)液置于冰箱4 ℃條件下保存[23-24]。

    1.3.3 Fe3O4@Au的制備

    參考文獻(xiàn)[25-26]方法并進(jìn)行改良。取2 g制備的Fe3O4納米粒子加入50 mL乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為20%),超聲1 min,逐滴加入1 mL APTES,在恒溫振蕩搖床中以120 r/min反應(yīng)8 h后得到淺棕色的懸濁液,產(chǎn)物即為氨基化修飾后的Fe3O4納米微粒。產(chǎn)物用20%乙醇溶液磁分離清洗3 次,60 ℃烘干備用。取上述制備的氨基修飾的Fe3O4納米微粒2 g邊攪拌邊加入20 mL所制備的金納米粒子溶液,混合溶液由棕色逐漸變淡,低速攪拌反應(yīng)12 h后,獲得Fe3O4@Au。

    1.3.4 表征

    將制備的磁性材料粉末用適量的蒸餾水稀釋,置于超聲波清洗器上超聲振蕩使其均勻分散。Fe3O4@Au的磁學(xué)性能通過振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)室溫下測量。利用X射線光電子能譜對(duì)合成的復(fù)合微粒進(jìn)行分析。利用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行分析,將合成的干燥納米粒子粉末與KBr混合,充分研磨后壓片,在紅外光譜儀下進(jìn)行表征,根據(jù)得到的紅外光譜圖對(duì)此納米粒子產(chǎn)品進(jìn)行分析。

    1.3.5 單因素試驗(yàn)優(yōu)化Fe3O4@Au檢測葡萄糖的體系

    1.3.5.1 Fe3O4@Au懸浮液質(zhì)量濃度對(duì)葡萄糖檢測體系的影響

    將100 μL葡萄糖氧化酶(1 mg/mL)和300 μL(10 mmol/L)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到600 μL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)(10 mmol/L、pH 7.0)中,37 ℃水浴孵育30 min[18]。反應(yīng)結(jié)束后向上述反應(yīng)液中加入100 μL不同質(zhì)量濃度的Fe3O4@Au懸浮液(0.01、0.05、0.1、0.15 g/mL和0.2 g/mL),200 μL ABTS(25 mmol/L)溶液和3 mL HAc-NaAc緩沖溶液(0.1 mol/L、pH 4.4),將混合溶液在50 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min后(水浴過程中每過1 min溫和倒轉(zhuǎn)1 次,下同)取出,采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部,靜置1 min,吸取上清液3 mL,以蒸餾水為空白,測定420 nm波長處吸光度,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

    1.3.5.2 反應(yīng)溫度對(duì)檢測體系的影響

    將100 μL(1 mg/mL)GOx和300 μL(10 mmol/L)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到600 μL PBS(10 mmol/L、pH 7.0)中,37 ℃水浴孵育30 min。反應(yīng)結(jié)束后向上述反應(yīng)液中加入100 μL的Fe3O4@Au懸浮液(0.05 g/mL),200 μL ABTS(25 mmol/L)溶液和3 mL HAc-NaAc緩沖溶液(0.1 mol/L、pH 4.4),將反應(yīng)體系放置于30、40、50、60 ℃和70 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min后取出,采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部,靜置1 min,吸取上清液3 mL,以蒸餾水為空白,測定420 nm波長處吸光度,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

    1.3.5.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測體系的影響

    將100 μL(1 mg/mL)GOx和300 μL(10 mmol/L)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到600 μL PBS(10 mmol/L、pH 7.0)中,37 ℃水浴孵育30 min。反應(yīng)結(jié)束后向上述反應(yīng)液中加入100 μL的Fe3O4@Au懸浮液(0.05 g/mL),200 μL的ABTS(25 mmol/L)溶液和3 mL HAc-NaAc緩沖溶液(0.1 mol/L、pH 4.4),將反應(yīng)體系放置于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)(10、20、30、40 min和50 min)后取出,采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部,靜置1 min,吸取上清液3 mL,以蒸餾水為空白,測定420 nm波長處吸光度,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

    1.3.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化檢測體系

    將100 μL(1 mg/mL)GOx和300 μL(10 mmol/L)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到600 μL PBS(10 mmol/L、pH 7.0)中,37 ℃水浴孵育30 min。反應(yīng)結(jié)束后向上述反應(yīng)液中加入100 μL不同質(zhì)量濃度的Fe3O4@Au懸浮液,200 μL ABTS(25 mmol/L)溶液和3 mL HAc-NaAc緩沖溶液(0.1 mol/L、pH 4.4),將混合溶液在不同溫度水浴鍋中反應(yīng)不同時(shí)間后(水浴過程中每過1 min溫和倒轉(zhuǎn)一次)取出,采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部,靜置1 min,吸取上清液3 mL,以蒸餾水為空白,測定420 nm波長處吸光度,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。確定因素影響的主次順序及優(yōu)選方案。

    1.3.7 葡萄糖檢測體系工作曲線、檢出限、回收率和選擇性的測定

    在最適質(zhì)量濃度、最適時(shí)間、溫度體系下將100 μL(1 mg/mL)GOx和300 μL(1、2.5、5、7.5、10、15、20 mmol/L)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到600 μL PBS(10 mmol/L、pH 7.0)中,37 ℃水浴孵育30 min。反應(yīng)結(jié)束后向上述反應(yīng)液中加入100 μL的Fe3O4@Au懸浮液,200 μL ABTS(25 mmol/L)溶液和3 mL HAc-NaAc緩沖溶液(0.1 mol/L、pH 4.4),水浴一段時(shí)間后采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部,靜置1 min,吸取上清液3 mL,以蒸餾水為空白,測定420 nm處吸光度,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。根據(jù)不同質(zhì)量濃度葡萄糖與吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算最低檢出限。選擇10、20 mmol/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到上述檢測體系,測定其吸光度,重復(fù)實(shí)驗(yàn)6 次,測定其回收率及精密度。在正交試驗(yàn)優(yōu)化的條件下向檢測體系中分別加入1 mol/L乳糖、蔗糖和麥芽糖,水浴一段時(shí)間后,觀察體系中顏色變化,確定檢測體系的選擇性。

    1.3.8 實(shí)際樣品檢測

    樣品的預(yù)處理蘋果:果蔬切碎,研磨成均勻糊狀,用干凈的燒杯稱取約1 g,加入約20 mL去離子水溶解,并超聲30 min,然后用布氏漏斗過濾兩次,再轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容,混勻后用0.45 μm的濾膜過濾一次,最后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中待用。加入不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,重復(fù)測定5 次,考察檢測體系的加標(biāo)回收率,并評(píng)價(jià)檢測體系的精確度和重復(fù)性。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    每組數(shù)據(jù)均重復(fù)5 次,利用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)作圖。采用DPS 7.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Fe3O4@Au的表征

    圖1 Fe3O4@Au合成示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the preparation of Fe3O4@Au

    本實(shí)驗(yàn)采用水熱法制備Fe3O4納米粒子,并通過對(duì)其表面氨基化與金納米粒子自組裝方法構(gòu)建Fe3O4@Au,合成示意圖如圖1所示。采用硅烷偶聯(lián)劑APTES對(duì)Fe3O4納米粒子進(jìn)行表面氨基化改性,APTES改性的目的是在磁性粒子的表面形成一層分子結(jié)合劑,并通過在介孔孔道中引入帶正電荷的氨基,利用中和反應(yīng)的機(jī)制并通過靜電力、氫鍵等相互作用可以提高對(duì)表面帶有負(fù)電荷的金納米粒子的吸附結(jié)合效率,以此原理構(gòu)建組裝型Fe3O4@Au。

    圖2 氨基化Fe3O4納米粒子傅里葉紅外光譜圖Fig. 2 Infrared spectrum of aminated Fe3O4 nanoparticles

    對(duì)合成的氨基化Fe3O4納米粒子進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析,從圖2可知,在1 610、1 659 cm-1和2 938 cm-1波數(shù)處分別為C=C、C=O和C—H的特征峰。與此同時(shí),在1 835 cm-1和1 483 cm-1處有吸收波長,這是氨基的特征吸收波長,因而證明了氨基的存在,同時(shí)在3 508 cm-1左右的地方有亞甲基的吸收峰,這是APTES基團(tuán)特征峰,該結(jié)果表明,APTES已成功地被接枝到Fe3O4納米粒子的表面上,使得其表面發(fā)生氨基化改性,并帶有適量的正電荷。

    根據(jù)Fe3O4納米粒子和氨基化Fe3O4納米粒子磁學(xué)性質(zhì)結(jié)果可知,在300 K的磁滯回線(Oe=79.578 A/m),納米Fe3O4和氨基化Fe3O4納米粒子的磁飽和強(qiáng)度值(M)分別為78 emu/g和59 emu/g,F(xiàn)e3O4納米粒子和功能化Fe3O4納米粒子均表現(xiàn)出了很好的超順磁性和磁場感應(yīng)性,說明氨基化作用不會(huì)顯著影響磁球的超順磁性特點(diǎn)。與納米Fe3O4比較,氨基化Fe3O4納米粒子的磁飽和,可有效防止納米磁球聚合,使得納米磁球能夠穩(wěn)定地分散在水溶液中。

    圖3 金納米粒子的粒徑分布Fig. 3 Particle size distribution of gold nanoparticles

    由圖3可知,金納米粒子粒徑呈正態(tài)分布,主要分布在7~9 nm范圍內(nèi),占整個(gè)分布體系的79%,平均粒徑達(dá)到(7.8±0.4)nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明利用綠色還原法制備的金納米粒子平均尺寸較小,其催化活性更高,在負(fù)載到氨基化Fe3O4納米粒子表面合成復(fù)合微粒后,可以產(chǎn)生協(xié)同作用進(jìn)一步提升納米微粒的過氧化物酶活性。

    基于靜電自組裝法,采用氨基化的Fe3O4納米粒子構(gòu)建Fe3O4@Au。見圖4,X射線光電子能譜分析結(jié)果表明,所構(gòu)建的Fe3O4@Au分別在4f位點(diǎn)和2p位點(diǎn)呈現(xiàn)出了Au和Fe的能譜特征峰,其中,F(xiàn)e(2p3/2)和Fe(2p1/2)結(jié)合能分別為711.08 eV和724.48 eV,表明Fe的來源是Fe3O4;Au(4f7/2)和Au(4f5/2)結(jié)合能分別為83.78 eV和87.48 eV,表明Au的來源為零價(jià)態(tài)的單質(zhì)Au。結(jié)果表明,基于自組裝法,金納米粒子已成功結(jié)合在氨基化的Fe3O4納米粒子表面。

    圖4 Fe3O4@Au的XPS譜圖Fe(2p)(A)和Au(4f)(B)Fig. 4 XPS spectra in the regions of Fe (2p) (A) and Au (4f) (B) for Fe3O4@Au

    如圖5所示,F(xiàn)e3O4納米粒子的表面吸附有密集的金納米粒子,結(jié)果表明氨基化的磁性材料可以固載金納米粒子。綜上所述,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,基于自組裝法,已成功構(gòu)建出Fe3O4@Au。利用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)測量Fe3O4@Au的磁滯回線,磁學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果表明,其依然具有超順磁性,磁飽和強(qiáng)度值為43 emu/g。說明包覆Au的含量升高會(huì)導(dǎo)致復(fù)合微粒磁化強(qiáng)度的輕微降低,這一結(jié)論和其他同類磁性納米復(fù)合微粒的磁學(xué)性質(zhì)一致[26]。

    圖5 Fe3O4@Au透射電子顯微鏡圖片(×40 000)Fig. 5 TEM image of Fe3O4@Au (× 40 000)

    2.2 模擬酶體系檢測葡萄糖單因素試驗(yàn)

    2.2.1 Fe3O4@Au懸浮液質(zhì)量濃度對(duì)檢測體系的影響

    體系中Fe3O4@Au表現(xiàn)出過氧化物模擬酶催化活性,能夠有效催化H2O2氧化ABTS發(fā)生顯色反應(yīng),基于此,結(jié)合GOx與葡萄糖反應(yīng)生成H2O2的原理,考察紫外-可見光吸收光譜于420 nm波長處(ABTS的特征峰)的吸光度,間接檢測體系中的葡萄糖。基于納米材料模擬酶檢測葡萄糖原理如圖6所示。孵育反應(yīng)中葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下生成H2O2,在Fe3O4@Au模擬過氧化物酶活性的催化下,過氧化物酶顯色底物ABTS顏色由無色變成綠色,以此原理檢測體系中的葡萄糖。

    圖6 檢測葡萄糖原理圖Fig. 6 Schematic diagram of glucose detection

    首先,考察Fe3O4@Au混懸液質(zhì)量濃度對(duì)檢測體系的影響。由圖7A可知,質(zhì)量濃度在0.01~0.1 g/mL范圍內(nèi)時(shí),隨質(zhì)量濃度的增加吸光度呈平穩(wěn)上升趨勢。添加量在0.1~0.15 g/mL時(shí),反應(yīng)速率變大。添加量在0.15~0.2 g/mL范圍內(nèi)時(shí),吸光度緩慢平穩(wěn)下降。由此可知,F(xiàn)e3O4@Au混懸液質(zhì)量濃度為0.15 g/mL時(shí)反應(yīng)體系檢測效果最好。結(jié)果表明,在以下正交試驗(yàn)優(yōu)化中,F(xiàn)e3O4@Au混懸液的質(zhì)量濃度取0.1、0.15 g/mL和0.2 g/mL較為適合。

    圖7 單因素試驗(yàn)條件對(duì)檢測體系的影響Fig. 7 Effect of various factors on the detection system investigated by one-factor-at-a-time method

    2.2.2 催化溫度對(duì)檢測體系的影響

    由圖7B可知,當(dāng)溫度在30~40 ℃范圍內(nèi)時(shí),吸光度穩(wěn)定上升,40~50 ℃范圍內(nèi),反應(yīng)速率變大,當(dāng)溫度在50~70 ℃范圍內(nèi)時(shí)反應(yīng)速率明顯下降。結(jié)果表明,吸光度隨溫度的提高呈上升趨勢,溫度越高檢測體系效果越好??紤]到傳感系統(tǒng)其實(shí)用性,反應(yīng)溫度過高不利于其即時(shí)檢測,同時(shí)在50~70 ℃范圍內(nèi),體系反應(yīng)速率變緩,基本已經(jīng)達(dá)到最優(yōu)的反應(yīng)效果。為此選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中吸光度最好的3 個(gè)水平參與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化。同時(shí)隨著反應(yīng)溫度的升高,模擬酶的相對(duì)活性逐漸增加,表明在較寬的溫度范圍內(nèi),F(xiàn)e3O4@Au模擬過氧化物酶具有較好的催化效果。

    2.2.3 催化時(shí)間對(duì)檢測體系的影響

    如圖7C所示,隨著反應(yīng)時(shí)間的不斷延長,吸光度呈不斷上升的趨勢。時(shí)間在10~20 min時(shí),吸光度緩慢上升,在20~30 min時(shí),反應(yīng)速率輕微下降,在30~40 min時(shí),吸光度開始平穩(wěn)上升。在40~50 min時(shí),反應(yīng)速率明顯下降,反應(yīng)進(jìn)程變慢。結(jié)果表明,在一定的時(shí)間內(nèi),質(zhì)量濃度和溫度相同時(shí),檢測葡萄糖的效果隨反應(yīng)時(shí)間的延長而增加。在40~50 min范圍內(nèi)反應(yīng)速率變慢,檢測體系反應(yīng)效果基本達(dá)到最優(yōu),過長的反應(yīng)時(shí)間不利于其快速即時(shí)檢測,因此選擇50 min為其最優(yōu)的反應(yīng)時(shí)間,其檢測響應(yīng)效果良好,并在正交試驗(yàn)優(yōu)化時(shí)選擇反應(yīng)時(shí)間為30、40 min和50 min。

    2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

    表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design with experimental results for optimization of detection conditions

    由表1可知,各因素對(duì)檢測葡萄糖體系影響主次順序?yàn)椋篋>B>A,即催化時(shí)間>催化溫度>Fe3O4@Au混懸液質(zhì)量濃度。通過極差分析確定的最優(yōu)方案組合為:A2B3D3,即Fe3O4@Au混懸液質(zhì)量濃度0.15 g/mL、催化溫度70 ℃、催化時(shí)間50 min。綜合上述分析,可以說明反應(yīng)時(shí)間是影響檢測體系的主要因素,反應(yīng)溫度和Fe3O4@Au混懸液濃度對(duì)反應(yīng)體系也有相應(yīng)的影響。以正交試驗(yàn)結(jié)果最優(yōu)方案進(jìn)行葡萄糖檢測,重復(fù)實(shí)驗(yàn)5 次,吸光度平均值為0.352,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.16%。

    2.4 葡萄糖檢測體系的響應(yīng)效果

    2.4.1 最低檢出限

    在正交優(yōu)化檢測條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),配制不同濃度的葡萄糖溶液,在Fe3O4@Au模擬過氧化物酶活性的基礎(chǔ)上結(jié)合葡萄糖在GOx作用下產(chǎn)生H2O2,并與ABTS產(chǎn)生顯色反應(yīng)的原理,掃描體系的紫外-可見光吸收光譜,通過光譜的變化評(píng)價(jià)體系反應(yīng)的進(jìn)程。如圖8A所示,在420 nm波長出現(xiàn)ABTS的最大吸收峰,葡萄糖濃度為1 mmol/L時(shí),吸光度最小,吸光度與體系中葡萄糖濃度呈正比。結(jié)果顯示,檢測體系對(duì)葡萄糖響應(yīng)效果良好。對(duì)不同濃度的葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖8B所示,葡萄糖在1~20 mmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=28.423x+0.098 2,相關(guān)系數(shù)R2值為0.992 5,根據(jù)方程計(jì)算(3s/b)檢出限為2.45 μmol/L。根據(jù)本研究中所獲得的檢出限,與其他基于納米材料的檢測葡萄糖方法進(jìn)行比較,結(jié)果見表2。由表2可知,本研究的最低檢出限為2.45 μmol/L,與其他研究中檢測葡萄糖相比具有相對(duì)較低的檢出限,說明此基于Fe3O4@Au模擬酶性質(zhì)檢測葡萄糖的檢測方法具有良好的靈敏度。

    圖8 葡萄糖檢測體系響應(yīng)效果Fig. 8 Response curves of glucose detection system

    表2 基于納米材料的葡萄糖測定方法的比較Table 2 Comparison of nanomaterial-based methods for determination of glucose content

    2.4.2 檢測體系選擇性

    圖9 葡萄糖檢測體系的選擇性Fig. 9 Selectivity of glucose detection system

    比色檢測體系的一個(gè)重要指標(biāo)就是檢測其選擇性,本研究選擇含有0.01 mol/L葡萄糖的體系作為參照,與3 種食品中常見的糖類(乳糖、蔗糖和麥芽糖)做對(duì)比研究,評(píng)估模擬酶檢測葡萄糖體系的特異性。每種糖類的濃度為葡萄糖濃度的100 倍,即1 mol/L。如圖9所示,葡萄糖測定具有的特異性和選擇性,相對(duì)于0.01 mol/L葡萄糖、1 mol/L蔗糖、1 mol/L的乳糖和1 mol/L麥芽糖不干擾測定。因此,本比色檢測方法對(duì)于葡萄糖檢測具有高的選擇性。葡萄糖吸光度和之前對(duì)應(yīng)濃度的實(shí)驗(yàn)基本一致,也說明了此體系具有一定的重復(fù)性,響應(yīng)效果較好,可望實(shí)現(xiàn)實(shí)際食品樣品中葡萄糖的測定。

    2.4.3 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

    在相同反應(yīng)體系下測定0.01 mol/L和0.02 mol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,對(duì)檢測體系進(jìn)行回收率評(píng)價(jià),回收率分別為105%和94.5%。重復(fù)測定5 次,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.29%和2.15%,說明該模擬酶檢測體系具有良好的精密度。在蘋果樣品的浸提液中加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,以確定此檢測體系對(duì)樣品中不同濃度葡萄糖的加標(biāo)回收率和精密度,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定5 次,結(jié)果見表3。結(jié)果表明,加標(biāo)回收率在96%~104%之間,且組內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差皆在5%以下,說明該模擬酶檢測體系具有良好的加標(biāo)回收率和精密度,并且具有良好的重復(fù)性,可望實(shí)現(xiàn)更多實(shí)際樣品中葡萄糖的檢測。

    表3 檢測實(shí)際樣品中不同濃度葡萄糖的回收率和精密度Table 3 Recoveries and precision for real samples spiked at different concentrations of glucose

    3 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)利用納米模擬酶活性建立高選擇、靈敏、快速檢測食品中葡萄糖含量的比色檢測體系。采用水熱法制備Fe3O4納米粒子,并綠色還原法制備金納米粒子,再利用氨基化法制備出了Fe3O4@Au微粒。利用其模擬過氧化物酶特性建立了葡萄糖檢測體系,優(yōu)化體系并對(duì)其葡萄糖的檢測性能進(jìn)行評(píng)估。研究結(jié)果表明,所制備的Fe3O4@Au微粒具有良好的過氧化物模擬酶活性,檢測方法具有較高的靈敏度、精確度、選擇性并且操作簡便。相關(guān)結(jié)果將為食品中葡萄糖檢測方法的改良積累基礎(chǔ)資料。本研究將為拓寬納米材料模擬酶在食品檢測中的應(yīng)用提供參考。

    猜你喜歡
    過氧化物光度葡萄糖
    銀納米團(tuán)簇的過氧化物模擬酶性質(zhì)及應(yīng)用
    Co3O4納米酶的制備及其類過氧化物酶活性
    葡萄糖漫反射三級(jí)近紅外光譜研究
    乘用車后回復(fù)反射器光度性能試驗(yàn)研究
    汽車電器(2019年1期)2019-03-21 03:10:46
    糖耐量試驗(yàn)對(duì)葡萄糖用量的要求
    葡萄糖對(duì)Lactobacillus casei KDL22發(fā)酵及貯藏性能的影響
    Interaction Study of Ferrocene Derivatives and Heme by UV-Vis Spectroscopy
    過氧化物交聯(lián)改性PE—HD/EVA防水材料的研究
    中國塑料(2016年3期)2016-06-15 20:30:00
    多發(fā)性肺硬化性血管瘤18~F-脫氧葡萄糖PET/CT顯像1例
    提高有機(jī)過氧化物熱穩(wěn)定性的方法
    欧美久久黑人一区二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美日韩乱码在线| 99香蕉大伊视频| 99久久综合精品五月天人人| 一级毛片女人18水好多| 亚洲一区二区三区不卡视频| 丝瓜视频免费看黄片| 日韩免费av在线播放| 欧美午夜高清在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 操美女的视频在线观看| 丝袜美足系列| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲九九香蕉| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲av美国av| 欧美日韩成人在线一区二区| 伦理电影免费视频| 在线观看66精品国产| 在线视频色国产色| 亚洲久久久国产精品| 老汉色∧v一级毛片| 黄色毛片三级朝国网站| 十八禁人妻一区二区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲国产精品sss在线观看 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品影院久久| 热re99久久国产66热| 久久热在线av| 精品久久蜜臀av无| 免费在线观看亚洲国产| 久久性视频一级片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产成人精品在线电影| 美女国产高潮福利片在线看| 99精品在免费线老司机午夜| a级毛片黄视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲精品国产色婷婷电影| 中文字幕精品免费在线观看视频| 午夜福利欧美成人| 亚洲精品自拍成人| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久婷婷成人综合色麻豆| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产成人影院久久av| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 狠狠狠狠99中文字幕| 免费在线观看亚洲国产| 国产免费男女视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲情色 制服丝袜| 国产亚洲av高清不卡| 人妻 亚洲 视频| 欧美在线一区亚洲| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美在线黄色| 久久精品91无色码中文字幕| 精品第一国产精品| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 人成视频在线观看免费观看| 国产高清国产精品国产三级| 激情视频va一区二区三区| 欧美午夜高清在线| 一区在线观看完整版| 国产有黄有色有爽视频| av不卡在线播放| 黄色视频,在线免费观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美+亚洲+日韩+国产| 老司机靠b影院| 身体一侧抽搐| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 色老头精品视频在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 69av精品久久久久久| 久久99一区二区三区| 男女之事视频高清在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 大香蕉久久网| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 男男h啪啪无遮挡| 午夜视频精品福利| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产成人免费观看mmmm| 欧美日韩av久久| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 99精品在免费线老司机午夜| 村上凉子中文字幕在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 多毛熟女@视频| 午夜激情av网站| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 久久午夜综合久久蜜桃| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 大陆偷拍与自拍| 亚洲成国产人片在线观看| 不卡av一区二区三区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 夜夜爽天天搞| 免费在线观看日本一区| 色在线成人网| 又大又爽又粗| 男男h啪啪无遮挡| videos熟女内射| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 91麻豆av在线| 亚洲精品国产区一区二| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精品永久免费网站| 日韩免费av在线播放| 黄色视频,在线免费观看| 91麻豆av在线| 婷婷成人精品国产| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产人伦9x9x在线观看| 久久久久久人人人人人| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 成年版毛片免费区| 日韩三级视频一区二区三区| 婷婷丁香在线五月| 国产成人欧美| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 日韩欧美在线二视频 | 无人区码免费观看不卡| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 18禁国产床啪视频网站| 久久这里只有精品19| 欧美性长视频在线观看| 天堂动漫精品| 欧美成人免费av一区二区三区 | 女人久久www免费人成看片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 欧美中文综合在线视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产精品久久久久久精品古装| 捣出白浆h1v1| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产精品1区2区在线观看. | 正在播放国产对白刺激| 国产在线一区二区三区精| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产成人啪精品午夜网站| 国产又爽黄色视频| 国产精华一区二区三区| 老司机深夜福利视频在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 国产麻豆69| 99国产精品一区二区三区| 丰满的人妻完整版| 国产区一区二久久| 妹子高潮喷水视频| 天堂中文最新版在线下载| 高清在线国产一区| 亚洲少妇的诱惑av| 国产精品偷伦视频观看了| 在线国产一区二区在线| 18禁国产床啪视频网站| 中出人妻视频一区二区| 18禁观看日本| 久久精品成人免费网站| 精品久久久精品久久久| 亚洲av美国av| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产高清激情床上av| 中文欧美无线码| 美女福利国产在线| 一a级毛片在线观看| 一区二区三区精品91| 午夜91福利影院| 久热这里只有精品99| 午夜精品久久久久久毛片777| 日韩免费高清中文字幕av| 国产精品国产av在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 精品一品国产午夜福利视频| 国产成人av教育| 亚洲国产精品合色在线| 国产免费现黄频在线看| 久久人妻av系列| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲精华国产精华精| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美黑人精品巨大| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久久精品区二区三区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 在线观看舔阴道视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 黄频高清免费视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 精品乱码久久久久久99久播| 精品一区二区三区四区五区乱码| 激情视频va一区二区三区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 成人三级做爰电影| 午夜免费成人在线视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 一本大道久久a久久精品| 1024香蕉在线观看| 婷婷丁香在线五月| 精品人妻1区二区| 中国美女看黄片| 在线观看免费高清a一片| 欧美在线黄色| 性少妇av在线| 午夜视频精品福利| 99riav亚洲国产免费| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品久久电影中文字幕 | 极品教师在线免费播放| 国精品久久久久久国模美| 精品一品国产午夜福利视频| 国产亚洲欧美98| 亚洲熟女毛片儿| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久久久久久久免费视频了| 少妇被粗大的猛进出69影院| 大码成人一级视频| 黄色 视频免费看| 久久久久久久精品吃奶| 国产亚洲精品一区二区www | 色婷婷久久久亚洲欧美| 成在线人永久免费视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲第一av免费看| 操出白浆在线播放| 欧美成人午夜精品| 一级片免费观看大全| 9191精品国产免费久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久精品成人免费网站| 热99国产精品久久久久久7| 国产精品.久久久| 搡老乐熟女国产| 国产在线观看jvid| 欧美丝袜亚洲另类 | 欧美日韩瑟瑟在线播放| 叶爱在线成人免费视频播放| 在线国产一区二区在线| 宅男免费午夜| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产成人系列免费观看| 免费不卡黄色视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 黄片大片在线免费观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产日韩欧美亚洲二区| 三级毛片av免费| 一级a爱视频在线免费观看| 国产av精品麻豆| 免费在线观看日本一区| 人妻一区二区av| www.精华液| tube8黄色片| 一进一出抽搐动态| 黄色 视频免费看| 最新的欧美精品一区二区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美 日韩 精品 国产| a级毛片在线看网站| 欧美乱色亚洲激情| 日韩视频一区二区在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲第一青青草原| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| av片东京热男人的天堂| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲美女黄片视频| 免费人成视频x8x8入口观看| av天堂久久9| 韩国精品一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产又色又爽无遮挡免费看| 丝袜人妻中文字幕| av国产精品久久久久影院| 国产亚洲精品第一综合不卡| av超薄肉色丝袜交足视频| 精品少妇久久久久久888优播| 国产99白浆流出| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产成人啪精品午夜网站| 动漫黄色视频在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久久久久久午夜电影 | 国产成人影院久久av| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 免费少妇av软件| 一级,二级,三级黄色视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 黑丝袜美女国产一区| 日韩欧美在线二视频 | 欧美乱妇无乱码| 精品国产国语对白av| 啦啦啦免费观看视频1| tocl精华| 国产免费男女视频| 免费在线观看完整版高清| 免费不卡黄色视频| 精品电影一区二区在线| 国产色视频综合| 一边摸一边做爽爽视频免费| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品一区二区精品视频观看| cao死你这个sao货| av免费在线观看网站| 欧美在线一区亚洲| av免费在线观看网站| av网站免费在线观看视频| www日本在线高清视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 精品久久久精品久久久| 黄频高清免费视频| 成年人午夜在线观看视频| 精品免费久久久久久久清纯 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 下体分泌物呈黄色| 麻豆av在线久日| 国产精品1区2区在线观看. | 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产单亲对白刺激| 国产成人欧美| 久久久久久久精品吃奶| 精品国内亚洲2022精品成人 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 男人舔女人的私密视频| 99国产综合亚洲精品| 正在播放国产对白刺激| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 母亲3免费完整高清在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 在线观看免费高清a一片| 精品视频人人做人人爽| 日韩有码中文字幕| 9热在线视频观看99| 国产欧美亚洲国产| 亚洲精品国产一区二区精华液| 中文字幕制服av| 一级片免费观看大全| 又黄又粗又硬又大视频| 18禁美女被吸乳视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 一夜夜www| 欧美人与性动交α欧美软件| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产成人欧美| 国产成人av教育| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产又色又爽无遮挡免费看| 伦理电影免费视频| 91精品三级在线观看| 久久青草综合色| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产1区2区3区精品| videosex国产| 欧美人与性动交α欧美软件| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品久久视频播放| 999久久久精品免费观看国产| 欧美色视频一区免费| 日韩免费av在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品免费大片| av视频免费观看在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲成人手机| 18禁美女被吸乳视频| 9热在线视频观看99| 亚洲精品自拍成人| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产野战对白在线观看| 亚洲综合色网址| 精品人妻在线不人妻| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 午夜日韩欧美国产| 18禁美女被吸乳视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 午夜福利在线观看吧| 久久香蕉精品热| 欧美色视频一区免费| www.自偷自拍.com| 久久久久视频综合| 在线永久观看黄色视频| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲九九香蕉| 黄色成人免费大全| 成年人黄色毛片网站| 999久久久国产精品视频| 免费不卡黄色视频| avwww免费| www.熟女人妻精品国产| 在线天堂中文资源库| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| av免费在线观看网站| 成人手机av| 亚洲全国av大片| e午夜精品久久久久久久| 国产精品久久久av美女十八| 久久ye,这里只有精品| 久久久久精品人妻al黑| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美成人午夜精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 看免费av毛片| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 又黄又爽又免费观看的视频| 十分钟在线观看高清视频www| 91麻豆av在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| tocl精华| 中文亚洲av片在线观看爽 | 精品少妇久久久久久888优播| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产亚洲欧美精品永久| 久久久国产欧美日韩av| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 91国产中文字幕| 亚洲精品成人av观看孕妇| 69av精品久久久久久| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久久久久久国产电影| 狂野欧美激情性xxxx| 国产主播在线观看一区二区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 国产99久久九九免费精品| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 制服诱惑二区| 男女午夜视频在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 黄色视频不卡| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 十八禁人妻一区二区| 嫩草影视91久久| 中文字幕色久视频| 久久精品国产清高在天天线| 男男h啪啪无遮挡| 久久99一区二区三区| 激情视频va一区二区三区| 中文字幕人妻熟女乱码| 身体一侧抽搐| 欧美精品一区二区免费开放| 动漫黄色视频在线观看| 久久性视频一级片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲成国产人片在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲精品av麻豆狂野| а√天堂www在线а√下载 | e午夜精品久久久久久久| 一区二区日韩欧美中文字幕| 精品国内亚洲2022精品成人 | 在线国产一区二区在线| 一级片免费观看大全| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久久久国产一级毛片高清牌| 在线免费观看的www视频| 色综合婷婷激情| 人成视频在线观看免费观看| 欧美 日韩 精品 国产| 中文字幕色久视频| 高清视频免费观看一区二区| 韩国av一区二区三区四区| 1024视频免费在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲国产中文字幕在线视频| 美女高潮到喷水免费观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美日韩一级在线毛片| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 99热网站在线观看| 亚洲成人免费av在线播放| 老司机福利观看| 人妻 亚洲 视频| 国产1区2区3区精品| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 99久久综合精品五月天人人| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲一区中文字幕在线| 免费观看a级毛片全部| 国产又爽黄色视频| 欧美最黄视频在线播放免费 | 亚洲熟女精品中文字幕| 国产一区有黄有色的免费视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 高清视频免费观看一区二区| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| av在线播放免费不卡| 婷婷丁香在线五月| 搡老岳熟女国产| 中文字幕色久视频| 精品一区二区三卡| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久久精品免费免费高清| 国产高清videossex| 人妻一区二区av| 窝窝影院91人妻| 成人免费观看视频高清| 午夜91福利影院| 黄频高清免费视频| 曰老女人黄片| 日韩人妻精品一区2区三区| 日本黄色视频三级网站网址 | 国产精品国产高清国产av | 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲av成人一区二区三| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲成人免费av在线播放| 精品久久久久久久久久免费视频 | 久久午夜亚洲精品久久| 搡老岳熟女国产| 国精品久久久久久国模美| а√天堂www在线а√下载 | 大码成人一级视频| 国产欧美亚洲国产| 欧美日韩精品网址| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 1024香蕉在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 又大又爽又粗| videos熟女内射| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 人成视频在线观看免费观看| 99久久人妻综合| 正在播放国产对白刺激| 国产av精品麻豆| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产成人免费观看mmmm| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产在视频线精品| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久热这里只有精品99| 午夜91福利影院| tocl精华| 精品人妻在线不人妻| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 欧美日韩视频精品一区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| tocl精华| 午夜福利一区二区在线看| 国产在视频线精品| 99香蕉大伊视频| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产av一区二区精品久久| 亚洲一区二区三区不卡视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 在线永久观看黄色视频| 国产精品久久久久成人av| 精品熟女少妇八av免费久了| 丰满的人妻完整版| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 一进一出抽搐动态| 亚洲,欧美精品.| 美女国产高潮福利片在线看| 免费不卡黄色视频| 日本黄色日本黄色录像| 又紧又爽又黄一区二区| 中出人妻视频一区二区| 90打野战视频偷拍视频| 热re99久久精品国产66热6| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 丝袜美腿诱惑在线| 国产精品综合久久久久久久免费 | 久久性视频一级片|