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    兩種檢測生鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶的方法比對

    2019-12-04 08:07:40郝苗苗徐偉良李春冬孫春玲
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2019年22期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)酰胺酶微孔試劑盒

    郝苗苗 ,徐偉良 ,3,李春冬 ,3, 孫春玲

    (1.錫林郭勒職業(yè)學院,內(nèi)蒙古錫林浩特 026000;2.錫林郭勒食品檢驗檢測和風險評估中心,內(nèi)蒙古錫林浩特 026000;3.錫林郭勒生物工程研究院,內(nèi)蒙古錫林浩特 026000)

    乳及乳制品在生產(chǎn)、加工過程中抗生素的殘留嚴重危害人體健康[1-3]。近年來,隨著國家對生鮮乳品質(zhì)監(jiān)控力度加大,一些不法分子為了謀求經(jīng)濟利益,通過人為添加β-內(nèi)酰胺酶以分解乳中的抗生素類藥物,使“高抗奶”變?yōu)椤盁o抗奶”[4]。2001年9月,我國農(nóng)業(yè)部頒布了《無公害食品生鮮牛乳》行業(yè)標準,規(guī)定生鮮乳中“不得檢出”抗生素[5]。衛(wèi)生部于2009年3月發(fā)布了《全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項整治近期工作重點及要求》和《全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項整治抽檢工作指導原則和方案》的通知,明確指出β-內(nèi)酰胺酶是非食品用物質(zhì)且屬違法添加劑。

    常用的β-內(nèi)酰胺酶檢測方法主要有微生物法、理化檢測法、儀器檢測法、免疫法和試劑盒檢測等方法?,F(xiàn)今常使用的檢測方法為微生物法中的杯蝶法[6-9]、快速檢測的試劑盒法[10-12],2種方法各有優(yōu)缺點。因此,試驗研究對比杯蝶法與試劑盒法的差異,以供人們在檢測過程中根據(jù)實際需求選擇最優(yōu)方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗樣品為10份生鮮奶樣;藤黃微球菌(Micrococcus luteus) CMCC(B)28001,中國醫(yī)學細菌保藏管理中心提供;β-內(nèi)酰胺酶標準品(600萬U/mL),中國食品藥品檢定研究院提供;青霉素G標準品(99.8%)、舒巴坦(99.4%),Dr.Ehrentorfer公司提供;0.1 mol/L Tris-HCl溶液(pH值7.0,含 0.1%BSA);抗生素檢定培養(yǎng)Ⅱ號、營養(yǎng)瓊脂、腦心浸液培養(yǎng)基,北京陸橋公司提供;無水磷酸二氫鉀,無水磷酸氫二鉀,國藥公司提供;β-內(nèi)酰胺酶殘留試劑盒,勤幫生物技術(shù)有限公司提供。

    1.2 杯蝶法[6]

    1.2.1 菌懸液的制備

    將藤黃微球菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上,于36℃下培養(yǎng)24~36 h直至長出單個菌落。挑取單菌落于無菌的5 mL腦心浸液培養(yǎng)基,經(jīng)36℃下培養(yǎng)20~24 h至菌液渾濁,測定菌懸液濃度在1×108~1×109CFU/mL,菌懸液應(yīng)在4℃下保藏5 d內(nèi)使用。

    1.2.2 樣品的制備

    將待檢樣品充分混勻,取1mL待檢樣品分別置于4支1.5 mL離心管中,分別標為A,B,C,D,每個樣品做3個平行,共12管。同時做陽性對照和陰性對照樣品,陽性對照樣品為滅菌后并經(jīng)檢測為陰性的牛乳,經(jīng)添加β-內(nèi)酰胺酶標準品至終質(zhì)量濃度為0.5 U/L。陰性對照樣品為滅菌后并經(jīng)檢測為陰性的牛乳。制備操作同待檢樣品。

    1.2.3 檢測用平板的制備

    菌懸液按1∶20加入到無菌約50℃的抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號中,充分搖勻。取無菌培養(yǎng)皿,加入15 mL含菌的抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號,凝固后在其表面放置4個無菌牛津杯,備用。

    1.2.4 樣品的測定

    各離心管標準物質(zhì)添加量見表1。

    表1 各離心管標準物質(zhì)添加量

    按照表1分別將青霉素G標準溶液、β-內(nèi)酰胺酶標準溶液、舒巴坦標準溶液加入到待檢樣品及陽性/陰性對照樣品中?;靹蚝螅瑢⑸鲜鯝~D試樣各取200 μL加入放置于檢測用平板上的4個無菌牛津杯中,于36℃下培養(yǎng)18~22 h,測量抑菌圈直徑。每個樣品取3次平行試驗平均值。

    1.2.5 結(jié)果判定

    陰性對照樣品應(yīng)A,B,D產(chǎn)生抑菌圈,且A,B抑菌圈直徑差異<3 mm,C抑菌圈直徑小于D抑菌圈,且抑菌圈直徑差異≥3 mm,且3次平行試驗結(jié)果一致。陽性對照樣品應(yīng)B,D產(chǎn)生抑菌圈,且A抑菌圈直徑小于B抑菌圈直徑,差異≥3 mm,C抑菌圈直徑小于D抑菌圈,且抑菌圈直徑差異≥3 mm,且3次平行試驗結(jié)果一致。以對照組結(jié)果為前提,檢測系統(tǒng)成立,可對樣品結(jié)果進行如下判定:

    (1) 若樣品結(jié)果中B,D產(chǎn)生抑菌圈,且C抑菌圈直徑小于D抑菌圈,抑菌圈直徑差異≥3 mm,3次平行試驗結(jié)果一致時,進行如下判定:①A抑菌圈直徑小于B抑菌圈直徑,差異≥3 mm,3次平行試驗結(jié)果一致,則判定該樣品檢出β-內(nèi)酰胺酶,報告β-內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果為陽性。②A,B抑菌圈差異<3 mm,3次平行試驗結(jié)果一致,則判定該樣品未檢出β-內(nèi)酰胺酶,報告β-內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果為陰性。

    (2)當樣品結(jié)果中A不產(chǎn)生抑菌圈且B產(chǎn)生的抑菌圈<11 mm或A、B均不產(chǎn)生抑菌圈,應(yīng)將樣品稀釋10倍,再按照該方法進行檢測。

    1.3 試劑盒法

    將樣品與試劑條恢復(fù)至室溫,迷你金屬浴提前預(yù)熱至35℃。從試劑桶中取出白色微孔試劑,開蓋,吸取250 μL均勻樣品至該微孔中,充分混勻,蓋好蓋板膜。將微孔放入45±5℃的恒溫箱,保溫15 min,取出后回溫3 min。取出試劑桶,打開后取出所需的紅色微孔試劑和試紙條并標記。用微量移液器吸取200 μL待檢樣本于微孔中,緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻,將微孔放入迷你金屬孔中,孵育3 min。在35℃條件下,將試紙條插入微孔中一手柄端向上,吸水墊端向下,并使吸水墊充分浸入溶液中,反應(yīng)3 min。從微孔中取出試紙條,輕輕刮去試紙條下端的吸水墊,并進行結(jié)果判讀。反應(yīng)完成5 min內(nèi)讀取結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    分別采用杯蝶法與試劑盒法對10份生鮮乳進行β-內(nèi)酰胺酶檢測。

    杯蝶法與試劑盒法結(jié)果見表2。

    表2 杯蝶法與試劑盒法結(jié)果

    由表2可以看出,10份樣品經(jīng)杯蝶法檢測有3份陽性樣品,陽性檢出率為42.9%。用試劑盒法可檢測出1份陽性樣品,陽性檢測率為10%,檢出率低于杯蝶法。與試劑盒檢測相比杯碟法檢測時間過長。

    3 結(jié)論

    杯蝶法是微生物法測定β-內(nèi)酰胺酶的主要方法,該法采用對青霉素類藥物絕對敏感的藤黃微球菌作為標準菌株,在樣品中加入青霉素G作為對照,利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶活性的特性,通過比對加入舒巴坦與未加入舒巴坦的樣品所產(chǎn)生抑菌圈的大小,間接測定樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶類藥物。此方法對樣品進行3個平行測試,重復(fù)性好,陰陽性對照均符合標準要求,適合大批量檢測,檢測結(jié)果相對準確。

    試劑盒法利用間接競爭法測定β-內(nèi)酰胺酶,其基本原理是β-內(nèi)酰胺酶可分解β-內(nèi)酰胺類抗生,通過快速測定β-內(nèi)酰胺反應(yīng)后殘留的酶含量,從而檢測牛奶中殘留的β-內(nèi)酰胺。根據(jù)樣本中β-內(nèi)酰胺酶含量的變化可使檢測試劑條發(fā)生顏色深淺的變化,從而進行測定。此方法適用于現(xiàn)場的快速檢測,對環(huán)境要求不高,檢測速度雖快但易出現(xiàn)假陰性結(jié)果,如需進行確證仍應(yīng)按照標準的微生物杯蝶法進行確證。

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