我國豬圓環(huán)病毒3 型流行現(xiàn)狀分析及實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)研究進(jìn)展

李 嬌，祖立闖，王文秀，李 峰，沈志強(qiáng)，

（1. 山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus, PCV）屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus）成員，為無囊膜、單股環(huán)狀的DNA 病毒，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小動物病毒[1]。過去確定的PCV 有兩種基因型，即豬圓環(huán)病毒1 型（PCV1）和圓環(huán)病毒2 型（PCV2），PCV1 不產(chǎn)生細(xì)胞病變，對豬無致病性；PCV2 感染與臨床中的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、豬呼吸道病綜合征、肉芽腫性腸炎、壞死性淋巴結(jié)炎、滲出性皮炎、繁殖障礙等疾病密切相關(guān)，統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒病（Porcine circovirus disease,PCVD）或豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒orcine circovirus associated diseases, PCVAD）[2]。PCV2 感染后可在豬只淋巴系統(tǒng)中增殖并引起免疫細(xì)胞損傷，是引起豬群免疫抑制性疾病的主要病原之一，由PCV2 引起的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，具有養(yǎng)豬業(yè)的“隱形殺手”之稱。2015 年6月，美國北卡羅來納州某商品化豬場發(fā)生豬皮炎腎病綜合征和繁殖障礙疫情，主要表現(xiàn)在母豬死亡率升高10.2%，受孕率下降0.6%，患病母豬厭食、皮膚呈現(xiàn)多灶性丘疹、斑點(diǎn)和淺表性皮炎，產(chǎn)弱胎、死胎和木乃伊胎。Palinski 等[3]從患病母豬及流產(chǎn)胎兒體內(nèi)首次檢測出一種新病毒，并通過宏基因組測序及遺傳進(jìn)化分析將其分類于一種新型豬圓環(huán)病毒，命名為豬圓環(huán)病毒3 型（PCV3），隨后我國研究學(xué)者陸續(xù)在湖北、廣東等發(fā)生繁殖障礙母豬以及急性死亡仔豬體內(nèi)也檢測出PCV3。鑒于PCV2 過去對我國養(yǎng)豬業(yè)造成的巨大危害，PCV3 一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就引起了我國研究學(xué)者的高度重視和密切關(guān)注，業(yè)界甚至普遍認(rèn)為PCV3 將是繼PCV2 之后未來幾年內(nèi)危害我國養(yǎng)豬業(yè)較為嚴(yán)重的傳染病之一。本文就目前PCV3 的病原學(xué)特征、流行現(xiàn)狀及實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在掌握我國豬群中PCV3 的流行現(xiàn)狀與流行特點(diǎn)，對逐步提高我國PCV3 實(shí)驗(yàn)室診斷水平，以及對我國PCV3 綜合防控的制定均具有重要的參考價(jià)值。

1 病原學(xué)特征

與PCV1 和PCV2 一樣，PCV3 為無囊膜、單股環(huán)狀的DNA 病毒，病毒基因組全長2.0 kb，包含3個主要開放閱讀框（ORF），分別編碼與PCV1 和PCV2 同源的Rep 蛋白、Cap 蛋白和一個特有的ORF3 蛋白[4]。圓環(huán)病毒屬的病毒粒子理化性質(zhì)相似，PCV3病毒粒子呈二十面體結(jié)構(gòu)，直徑為17～20 nm，病毒對氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑均具有一定的抵抗力，在pH 3.0 酸性環(huán)境條件下及70 ℃高溫環(huán)境下均能存活一段時(shí)間。雖然目前PCV3 通過何種途經(jīng)傳播尚未明確，但Palinski 等[3]從患病母豬及流產(chǎn)胎兒體內(nèi)均檢測到PCV3，揭示懷孕母豬感染PCV3 后，可經(jīng)胎盤垂直傳染仔豬；Ku 等[5]從豬精液中檢出PCV3，揭示PCV3 也可以通過精液傳播，表明PCV3 可垂直傳播。由于PCV2 可隨患病豬的呼吸道、消化道和泌尿生殖道分泌物排出，經(jīng)直接或間接接觸方式傳播，提示PCV3 也有可能通過水平方式傳播，這需要進(jìn)一步的詳細(xì)研究確定。在易感動物方面，從目前的研究資料來看不同年齡、性別的豬均可感染PCV3，但以妊娠母豬和仔豬更易感。

2 流行病學(xué)監(jiān)測情況

隨著PCV3 的日益流行以及我國對PCV3 感染的逐步重視，我國研究學(xué)者對國內(nèi)PCV3 的感染情況進(jìn)行了大量的流行病學(xué)監(jiān)測，筆者通過對監(jiān)測結(jié)果的整理匯總，分析出我國豬群PCV3 流行的幾個顯著特點(diǎn)。

2.1 流行范圍廣

如表1 所示，PCV3 的流行范圍已經(jīng)遍布了我國山東、浙江、安徽、江蘇、江西、湖南、湖北、福建、河南、吉林、廣西、貴州、廣東、海南、上海、四川、云南等17 個省市。

表1 我國PCV3 流行病學(xué)監(jiān)測情況匯總

2.2 不同區(qū)域感染率差異較大

如表1 所示，不同地區(qū)PCV3 的感染率差異較大，呈現(xiàn)出顯著的區(qū)域性流行特點(diǎn)。如2017 年廣東、海南、廣西、湖南等華南地區(qū)的感染率高達(dá)46.3%，而2017 年河南駐馬店市的感染率僅為4.17%；如2016—2017 年廣西省的感染率高達(dá)24.31%，而2016—2017 年貴州省和河南省的感染率僅為4.87%和4.61%。

2.3 與其他病原的混合感染情況較嚴(yán)重

如表2 所示，PCV3 與PCV2、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRSV）、豬瘟（CSFV）普遍存在二重、三重的混合感染，其中在部分地區(qū)PCV3 與PCV2 混合感染率高達(dá)30.26%，混合感染增加了疫病的診斷與防控難度，造成的經(jīng)濟(jì)損失更加巨大，應(yīng)加強(qiáng)重視。

表2 我國豬群中PCV3 與其它致病原混合感染情況匯總

3 分子流行病學(xué)研究情況

分子流行病學(xué)研究可以從分子水平發(fā)現(xiàn)PCV3 流行病毒株之間的差異以及遺傳和衍化規(guī)律，明確PCV3 不同流行毒株的基因亞型與變異情況，揭示PCV3 與PCV2 的交叉保護(hù)效果，能夠?yàn)椴煌貐^(qū)因地制宜地制定防控措施提供指導(dǎo)依據(jù)。賀會利等[22]對PCR 檢測為PCV3 陽性的廣西豬病料樣品進(jìn)行PCV3 Cap 基因的遺傳變異分析，該Cap 基因與GenBank 中登錄的18 株P(guān)CV3 毒株Cap 基因序列同源性分別在96.9%～99.5%之間，屬于3b 壓群，而與PCV1 毒株和PCV2 毒株的核苷酸序列同源性僅有43.0%和45.8%，且B 細(xì)胞抗原表位差異明顯，在PCV1 特有的B 細(xì)胞抗原表位（92～103 aa）、PCV2 特有的B 細(xì)胞抗原表位（69～83 aa、117～131 aa 和231～233 aa）及PCV1、PCV2 共 有 的B 細(xì) 胞 抗 原 表 位（156 ～162 aa 和179～192 aa）均無相似性，鑒于PCV3 與PCV2 在核衣殼Cap 蛋白的抗原表位上無任何相似性，推測PCV3 毒株和PCV2 毒株的抗原交叉保護(hù)性極低，現(xiàn)有的PCV2 疫苗無法為PCV3 感染提供有效的免疫保護(hù)作用，已商品化的PCV2 血清抗體檢測試劑盒也無法對PCV3 感染的抗體滴度進(jìn)行檢測。湛洋等[7]對2 株P(guān)CV3 Cap 基因進(jìn)行遺傳變異和抗原性預(yù)測分析，結(jié)果表明2 個Cap 基因均屬于PCV3 毒株，與GenBank 中參考的PCV3 Cap 基因序列同源性均在97%以上，Cap 蛋白的氨基酸序列與5 個美國報(bào)道的PCV3 參考毒株的Cap 蛋白氨基酸相似性達(dá)98%，與PCV2 Cap 蛋白氨基酸相似性僅為30%；三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，盡管PCV3 Cap 蛋白也包含一個jelly roll 折疊，但與PCV2 Cap 蛋白表面結(jié)構(gòu)的差異很大，這種結(jié)構(gòu)的差異進(jìn)一步會對構(gòu)象型表位的識別產(chǎn)生影響，與PCV2 Cap 蛋白質(zhì)亞基相比，PCV3 Cap 蛋白質(zhì)亞基含有更多的loops 結(jié)構(gòu)，在圓環(huán)病毒侵染細(xì)胞的時(shí)候，核衣殼Cap 蛋白參與了病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，這些loops 結(jié)構(gòu)是由非典型的二級結(jié)構(gòu)組成，在與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用過程中展現(xiàn)出高度的動態(tài)性，因而使得其致病機(jī)制更加復(fù)雜。根據(jù)上述抗原性和結(jié)構(gòu)分析，PCV3 和PCV2 Cap 蛋白質(zhì)不具有共同的線性抗原表位，PCV3 和PCV2 之間不具有交叉免疫保護(hù)，提示常規(guī)PCV2 疫苗對PCV3 的流行無法提供良好的免疫保護(hù)，需要開發(fā)新型疫苗以及制定更具針對性的防控措施來控制PCV3 的流行與暴發(fā)。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

鑒于PCV3 與PCV2 引起的臨床表現(xiàn)極其相似，二者均可引起豬的皮炎腎病綜合征、繁殖障礙以及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。患病母豬表現(xiàn)厭食，皮膚出現(xiàn)多灶性丘疹、斑點(diǎn)和淺表性皮炎，死亡率增加，受孕率降低，生產(chǎn)性能下降，流產(chǎn)率增加，產(chǎn)弱胎、死胎、木乃伊胎。仔豬可主要表現(xiàn)為呼吸、泌尿、腸道、淋巴、心血管、神經(jīng)、繁殖系統(tǒng)以及皮膚的功能紊亂等系列癥狀，且在臨床中二者具有一定的混合感染率，增加了PCV3 臨床診斷的難度，故目前對PCV3 感染的確診主要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，包括分子生物學(xué)診斷技術(shù)和免疫學(xué)診斷技術(shù)。

4.1 分子生物學(xué)診斷方法

分子生物學(xué)檢測方法可以檢測到病原體特定的核苷酸序列，且具有簡便、高效、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)，在動物疫病診斷方面的應(yīng)用越來越廣泛，逐步成為動物疫病診斷的主流方法，尤其在新發(fā)動物疫病的診斷方面顯示出了巨大的優(yōu)越性。目前，用于PCV3 的分子生物學(xué)診斷方法主要有PCR 方法、套式PCR 方法、熒光定量PCR 方法和LAMP 方法。

4.1.1 PCR 方法 PCR 技術(shù)指在DNA 聚合酶催化下，以母鏈DNA 為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA 互補(bǔ)的子鏈DNA 的過程，是一項(xiàng)DNA 體外合成放大技術(shù)，能快速、特異地在體外擴(kuò)增DNA。徐朋麗等[23]根據(jù)GenBank 中PCV3 全基因序列在其保守區(qū)設(shè)計(jì)1 對特異性引物，并優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測PCV3 的PCR 方法，該方法僅對PCV3 檢測為陽性，而檢測PCV2、PRRSV、CSFV、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）等其它常見病原均為陰性，對PCV3 的最低檢出量為61.9 拷貝/μL，應(yīng)用該方法檢測133 份臨床樣品，PCV3 陽性感染率為29%，該方法的建立使PCV3 的檢測更為快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用，為PCV3感染的早期診斷提供了有力的技術(shù)支持。

4.1.2 套式PCR 方法 套式PCR 技術(shù)是常規(guī)PCR的一種改進(jìn)模式，其先利用外引物進(jìn)行一輪PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，再以外引物的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用內(nèi)引物進(jìn)行第二輪PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，通過第二輪PCR擴(kuò)增一方面可有效降低或避免了臨床病料樣品中大量的蛋白和脂類對PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的影響，另一方面因其已經(jīng)進(jìn)行了一次核酸的體外擴(kuò)增，模板中的核酸含量顯著升高，PCR 的敏感性將大幅提高。楊永寧等[24]根據(jù)GenBank 中PCV3 基因序列，設(shè)計(jì)合成內(nèi)外2 對引物，經(jīng)過套式PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測PCV3 的套式PCR 方法，該方法檢測PCV2、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）均為陰性，外引物擴(kuò)增的檢測靈敏度為17 ng DNA，內(nèi)引物擴(kuò)增的檢測靈敏度為0.17 ng DNA，該方法在檢測124 份臨床病料樣品的應(yīng)用中，外引物共檢測出陽性樣品22 份，內(nèi)引物共檢測出陽性樣品28 份，表明該套式PCR 具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性和臨床適用性，可以用于臨床病料中PCV3 的快速低含量檢測。

4.1.3 熒光定量PCR 方法 熒光定量PCR 方法是在常規(guī)PCR 反應(yīng)體系中加入熒光分子，利用熒光信號的累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個PCR 反應(yīng)進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析，整個PCR 反應(yīng)和檢測都在反應(yīng)管中進(jìn)行，樣品污染的概率大幅降低，敏感性更高，特異性更強(qiáng)。李暢等[25]根據(jù)PCV3 ORF2基因組保守序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan 探針，通過優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，建立快速檢測PCV3 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測方法，該方法的檢測靈敏度為1.29×102拷貝/μL，比常規(guī)PCR 的靈敏度高100 倍，該方法檢測PCV2、PRRSV、豬輪狀病毒（RV）、豬鏈球菌、豬肺炎支原體等疫病均為陰性，批次內(nèi)重復(fù)和批次間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于1.5%，應(yīng)用該方法對2016—2017 年間收集的124 份來自湖北省等地的豬病料DNA 樣品進(jìn)行檢測，PCV3 陽性率為8.06%，建立的TaqMan 熒光定量PCR 能夠靈敏特異地檢測PCV3，為PCV3 臨床感染的早期診斷、流行病學(xué)調(diào)查、定量分析PCV3 感染程度以及發(fā)病機(jī)制研究提供了一種快速、簡便、特異、敏感、準(zhǔn)確的分子生物學(xué)檢測技術(shù)。

4.1.4 LAMP 方法 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是日本研究學(xué)者于2000 年發(fā)明的一種體外恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該方法不需要昂貴的儀器設(shè)備，在等溫條件下就能快速完成反應(yīng)，具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用、高效、快速和簡便等特點(diǎn)，已經(jīng)用于多種豬病原檢測。姜辰龍等[26]根據(jù)PCV3 ORF2 基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，并通過對Bst DNA 聚合酶、引物最佳濃度比例、Mg2+、dNTPs 和甜菜堿濃度等反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測PCV3 的LAMP 檢測方法，該方法59 ℃恒溫?cái)U(kuò)增36 min 即可出現(xiàn)梯形條帶，且產(chǎn)物亦可通過SYBR GreenⅠ染色進(jìn)行判斷，該方法最低檢測限為1.0×101拷貝/μL，檢測PCV1、PCV2、PRRSV、CSFV、PRV 均為陰性，應(yīng)用該方法檢測68 份呼吸道病豬淋巴結(jié)樣品，PCV3 陽性率達(dá)30.9%，該方法與常規(guī)PCR 檢測結(jié)果的符合率為95.6%。相對傳統(tǒng)PCR 方法而言，LAMP 方法敏感特異，簡便快速，可用于PCV3 的檢測和臨床診斷。

4.2 免疫學(xué)診斷方法

免疫學(xué)檢測方法具有樣品易于采集、檢測快速、操作簡單、高通量等優(yōu)點(diǎn)，特別適合于大批量樣品的檢測和流行病學(xué)調(diào)查，特異、敏感的血清學(xué)檢測方法并用于豬群中PCV3 感染的血清學(xué)檢測對于PCV3 感染的早期診斷是十分必要的。目前，用于PCV3 的免疫學(xué)診斷方法主要有間接ELISA 方法和雙抗體夾心ELISA 方法。

4.2.1 間接ELISA 方法 間接ELISA 方法是將診斷抗原直接固定在固相載體上，封閉后加入待檢抗體，加入酶標(biāo)記抗體和底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與待檢抗體的量呈正相關(guān)，具有操作簡單、快速，易于標(biāo)準(zhǔn)化，適合臨床上檢測大量樣品等優(yōu)點(diǎn)。王俊偉等[27]以PCV3 陽性病料為模板，PCR 擴(kuò)增截短的ORF2 基因，并將其克隆至pET30a載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)獲得了重組Cap 蛋白，以純化后的重組Cap 蛋白作為包被抗原，建立PCV3 抗體的間接ELISA，該方法的批內(nèi)和批間系數(shù)均小于10%，該方法檢測PCV2、CSFV、PRRSV、PRV 陽性血清均為陰性，該方法檢測采集的439 份臨床豬血清，PCV3 抗體陽性檢出率為60.59%，為當(dāng)前PCV3 的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供一種快速、簡便、敏感、特異的抗體檢測方法。

4.2.2 雙抗體夾心ELISA 方法 雙抗體夾心ELISA的方法是將第一種抗體（捕獲抗體）包被在固相載體上，封閉后加入待檢抗原，溫育后加入第二種抗體（檢測抗體），捕獲抗體和檢測抗體可以是針對不同表位的兩種單抗，也可以是針對同一抗原的一種單抗與一種多抗，加入酶標(biāo)記抗體和底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與待檢抗原的量直接相關(guān)，根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。于俊楠等[28]以抗PCV3 重組Cap 蛋白的單克隆抗體作為包被抗體，以抗Cap 蛋白的兔源多克隆抗體為檢測抗體，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測PCV3 的雙抗體夾心ELISA 方法，該方法檢測PCV2、PRV、豬乙型腦炎病毒（JEV）均為陰性，該方法批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于5%，該方法檢測采集的19 份臨床病料樣品，檢測出11 份陽性樣品，與常規(guī)PCR 方法的符合率達(dá)84.6%。夾心ELISA 檢測方法具有良好的特異性、靈敏性和可重復(fù)性，可用于臨床中PCV3 的檢測，特別適合于PCV3 的大面積流行病學(xué)調(diào)查。

5 結(jié)語

鑒于PCV2 對我國養(yǎng)豬業(yè)的嚴(yán)重影響，對PCV3的流行以及造成的潛在危害必須有清醒的認(rèn)識和足夠的重視。病原學(xué)監(jiān)測表明，我國豬群中已存在PCV3 的流行，且不同區(qū)域感染率差異較大，PCV3與其他病原的混合感染情況較嚴(yán)重，而且PCV3 與PCV2 之間不存在交叉免疫保護(hù)性，現(xiàn)有的商品化PCV2 疫苗無法為PCV3 的感染提供有效的免疫保護(hù)。對于PCV3 的各種實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，LAMP 方法對儀器設(shè)備要求較低，特別適合基層實(shí)驗(yàn)室快速檢測，但敏感性太高，易導(dǎo)致假陽性。ELISA 方法操作簡單、檢測快速、高通量，特別適合用于大批量的流行病學(xué)調(diào)查。PCR 方法操作簡單，是目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PCV3 臨床診斷和流行病學(xué)監(jiān)測的主要方法，但PCR 方法不能定量且對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳時(shí)需使用溴化乙錠（EB），污染環(huán)境和威脅人體健康。熒光PCR 方法彌補(bǔ)了常規(guī)PCR 不能定量以及EB的污染問題，但對儀器和操作人員技術(shù)水平要求均較高，檢測成本也較高，有條件的實(shí)驗(yàn)室可選擇使用。相信隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)診斷技術(shù)的不斷改善與標(biāo)準(zhǔn)化，以及我國對PCV3 防控措施的不斷完善，我國PCV3 的各種實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)必將會走向不斷成熟與完善，PCV3 的流行將會得到逐步控制，從而保障我國養(yǎng)豬業(yè)健康與穩(wěn)定發(fā)展。