CARDS TX致病機制的研究進展*

孫紅匣，王冬梅，王海燕，曲艷杰

(1.內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，內蒙古 包頭 014060；2.包頭市第四醫(yī)院兒科)

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae，MP)是一種胞外非典型細菌，可引起各種呼吸系統(tǒng)疾病，包括咽炎，氣管支氣管炎等，是兒童社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumoniae，CAP)的常見病原體。近年來，肺炎支原體感染率逐年上升，重癥與難治性肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumoniae，MPP)比例也增高。社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(community-acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDS TX)是MP表達的一種新型毒力蛋白，具有ADP-核糖基化和空泡化作用，在MP致病機制中發(fā)揮著主要作用。許多研究表明僅CARDS TX本身就可重現(xiàn)或模擬與MP感染引起相關疾病發(fā)生的炎癥反應和病理學改變，此外，相關研究顯示CARDS TX的量和作用時間與MP感染相關疾病嚴重程度成正相關，但目前仍缺乏高效、特異的CARDS TX的早期及定量檢測手段。目前，國外許多研究逐漸明確了CARDS TX的分子結構、分子致病機制、生物學特性，文章將從CARDS TX的發(fā)現(xiàn)、致病機制、結構功能關系以及在哮喘和其他MP感染相關疾病等方面進行系統(tǒng)綜述。

1 CARDS TX的發(fā)現(xiàn)

早在2006年，Kannan等[1]就發(fā)現(xiàn)了MP表達的一種毒力因子(MPN372)，后被命名為CARDS TX。CARDS TX大小為68-kDa，由591個氨基酸組成，與百日咳毒素(pertussis toxin ,PTX/PT)S1亞基(PTX-S1)具有同源性。它有多個高免疫原性的抗原表位，可引起強烈的血清轉化。Kannan等[1]發(fā)現(xiàn)CARDS TX分布于MP的整個表面，包括尖端細胞器，這種模式與粘附素蛋白P1相似，而且CARDS TX的表達受轉錄和翻譯的環(huán)境信號的影響，在MP感染過程中表達明顯上調[2]，CARDS TX只有與宿主細胞結合、內化后才會發(fā)揮細胞毒性作用，并且這種毒素作用具有時間和劑量依賴性，此外，相關數(shù)據(jù)也顯示CARDS TX轉錄物和蛋白在MP感染時選擇性早期合成。Ramasamy等[3]發(fā)現(xiàn)CARDS TX的細胞內分布具有溫度和時間依賴性，與內質網(wǎng)高爾基中間隔室(ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC)圍繞核周區(qū)域共定位[3]。

2 CARDS TX的致病機制

2.1結合 CARDS TX與宿主細胞結合后才會內化進入宿主細胞。研究顯示宿主氣道上皮細胞表面由表面活性物質覆蓋，約5 %為表面活性蛋白(surfactant protein，SP )，而AnxA2(annexinA 2，AnxA2)是膜聯(lián)蛋白家族成員中的一種蛋白，大小為36 kDa，在細胞表面和胞內均表達[3]。研究顯示CARDS TX能與SP-A(surfactant protein A，SP-A )和AnxA2結合，而且基于SP-A比AnxA2的表達更占優(yōu)勢，SP-A更優(yōu)于作為結合靶標[4-5]。CARDS TX與AnxA2的結合具有特異性和濃度依賴性，研究發(fā)現(xiàn)CARDS TX內化之前與AnxA2共定位，并由CARDS TX的C端介導，敲低或增加AnxA2的表達均會影響CARDS TX的結合、內化以及隨后的空泡化作用，此外，AnxA2還可作為CARDS TX的功能受體參與細胞內運輸[4]。研究顯示當減少或消除AnxA2表達時，仍可檢測到毒素的結合和內化能力，推測可能存在細胞亞群不能有效沉默AnxA2或少量的AnxA2足以促進CARDS TX結合與內化或胞內AnxA2蛋白相對穩(wěn)定或其他受體分子繼續(xù)促進CARDS TX結合和內化[4]。隨后研究發(fā)現(xiàn)CARDS TX特異性結合磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)和鞘磷脂(sphingomyelin ，SM)，PC和SM都含有磷酸膽堿頭部基團，SP-A與DPPC直接相關[5-6]。研究證實A型肉毒桿菌神經毒素的共同受體是由蛋白質和膜脂質成分構成，雖然CARDS TX特異性結合的主要結構成分是PC和SM，但二者能否作為CARDS的共同受體仍有待研究[6]。

2.2內化 大多數(shù)細菌毒素相關的攝取機制始于網(wǎng)格蛋白包被的小窩或不依賴網(wǎng)格蛋白的內吞途徑[7-8]，如假單胞菌外毒素A 和志賀毒素,炭疽毒素通過網(wǎng)格蛋白包被的囊泡和網(wǎng)格蛋白獨立途徑被內吞，霍亂毒素主要由胞腔內膜依賴性機制內吞[8]，而白喉毒素僅限于網(wǎng)格蛋白依賴性內吞。研究發(fā)現(xiàn)重組CARDS TX(recombinant CARDS toxin，rCARDS TX)的內化與網(wǎng)格蛋白介導的內吞機制有關，CARDS TX與宿主表面受體結合后，由網(wǎng)格蛋白介導內化[8]，AnxA2作為功能性受體也參與了CARDS TX的內化以及隨后的ADP-核糖基化和空泡化，這與AnxA2協(xié)助clathrin-和caveola介導的內化并參與巨細胞性細胞吞噬相似[4,8]。

2.3細胞內運輸 細菌毒素利用多種途徑來達到它們的胞內靶點。一些毒素，如白喉毒素(diphtheria toxin ，DT)和肉毒桿菌毒素，在細胞水平以pH依賴性方式跨膜轉運穿過胞質溶膠[3]。其他細菌毒素如志賀毒素(shiga toxin ，ST)，霍亂毒素(cholera toxin，CT)和大腸桿菌不耐熱腸毒素(Escherichia coli heat-labile enterotoxin，LT)，利用逆行轉運途徑到達內質網(wǎng)( endoplasmic reticulum，ER )[3,8-11]。最近Ramasamy等[3]發(fā)現(xiàn)CARDS TX易位通過早期和晚期內涵體(endosomes)和高爾基復合體，并集中在核周區(qū)利用其獨特的KELED序列逆行轉運至ER以實現(xiàn)其細胞毒性能力。KELED序列與他細菌毒素C末端的KDEL序列具有相似作用，介導毒素逆行轉運至ER，不同的是，KELED序列位于D1和D2(tandem C-terminal β-trefoil subdomains ，D2 + D3)，結構域之間，其氨基酸為268-272。為了確定KELED序列介導毒素向ER逆向轉運，Ramasamy等[3]定點誘變將編碼谷氨酸的269,271位或兩者的核苷酸改變?yōu)榫幋a丙氨酸的核苷酸，產生三種CARDS TX構建體即KALED(K1)，KELAD(K2)和KALAD(K3)。研究顯示CARDS TX與ERGIC共定位，KELED到K3的定點誘變，阻止了CARDS TX從高爾基復合體到ER的有效運輸，導致了大量的K3毒素在高爾基復合體累積，與WT(wild-type，WT)CARDS TX的定位相反，而K3突變體不引起IL-1β分泌和空泡形成，但仍具有與WT CARDS TX相似的ADPRT活性，表明KELED相關氨基酸的變化不影響其它的ADPRT/ART活性以及CARDS TX向ER的運輸在毒素介導的細胞毒性中起關鍵作用。此外，與K3相比，K1或K2構建體的ER定位和空泡形成與WT(野生型)相似，表明亮氨酸旁邊至少需要一個帶負電的氨基酸(即谷氨酸)將CARDS TX有效轉移至ER[3]。使用ER-SNAP-trap方法進一步肯定了K3 突變體與calnexin(跨膜分子伴侶)非常有限的共定位是由于缺乏KELED序列[3]。雖然K3 向ER的轉運明顯減少，但并未完全阻斷，表明這種逆向轉運機制并不是唯一途徑，這與Tang等在CT相關研究中觀察到的結果相似。

2.4ART/ADPRT Kannan等發(fā)現(xiàn)CARDS TX的N-末端區(qū)域與許多ART毒素如PT、CT、DT、LT等的催化結構域共有有限的同一性。研究顯示rCARDS TX相關ART活性具有巰基還原依賴性，與CT和PT相似，CARDS TX的ADP-核糖基化涉及通過ART活性將來自NAD+的ADP-核糖基基團轉移至靶蛋白中的特定氨基酸。由于所有ADP-核糖基化毒素在沒有其特異性受體的情況下也表現(xiàn)出NAD糖水解酶(NADase)活性，Kannan等[12]使用[羰基-14C] NAD進一步定義了具有完整NADase活性的最小CARDS毒素區(qū)。 與FL(全長)一樣，CARDS TX的所有C-末端截短變體均顯示出不同程度的NADase活性。大部分N-末端缺失產生不溶性蛋白質，通過有限的蛋白水解獲取了可溶性的?38kDa和?33kDa產物，并對它們進行N-末端測序顯示它們分別由殘基264-591和308-591組成。 此外，Johnson等發(fā)現(xiàn)來自M. penetrans大小為78-kDa蛋白質即MYPE9110，也表現(xiàn)出ART活性，但MYPE9110和CARDS TX靶向結合不同的宿主蛋白質[3]。除了在 MP 的不同菌株中可以檢出CARDS TX，支原體屬中的其他微生物也發(fā)現(xiàn)了類似CARDS TX的ART。

2.5空泡化作用 早在2006年，Kannan等已經證明了rCARDS TX具有ART活性和空泡作用，結果顯示這種微小空泡在核周區(qū)域開始形成，后逐漸增大融合最后導致細胞壞死，而且這種空泡作用具有劑量和時間依賴性。此外，研究發(fā)現(xiàn)CARDS TX的空泡化作用與RAS癌基因家族中Rab 9介導的細胞內吞作用相關[13]，rCARDS TX誘導的酸性空泡起源于內吞途徑的Rab9相關區(qū)室，Rab9和液泡型ATP合成酶(vacuolartype ATPase，V-ATPase)均參與CARDS TX介導的液泡形成，V-ATPase與內吞體和溶酶體功能相似，使用 V-ATPase抑制劑巴弗洛霉素A1可阻斷或減少空泡樣改變，這表明rCARDS毒素介導的空泡形成依賴于V-ATPase酶[13]。CARDS TX的空泡特性與C末端結構域直接相關，而且N端截短都減少空泡形成，這表明N端區(qū)域在維持C端區(qū)域的構象完整性方面可能發(fā)揮作用[12]。

2.6過敏反應和炎癥反應 MP不僅可以誘導炎癥，也可以通過在甘油代謝過程中產生的CARDS TX、核酸酶和過氧化氫發(fā)揮細胞毒性[14]。研究發(fā)現(xiàn)僅rCARDS TX就可誘導各種炎性因子、趨化因子的釋放，淋巴細胞(如CD4+T和CD19+B)、漿細胞的浸潤、嗜酸性粒細胞的增多，黏液化生和AHR(airway hyperreactivity)等反應[6,15,31]。Maselli等[16]在靈長類動物中進一步證實了僅CARDS TX可導致MP感染類似的組織病理學改變，且CARDS TX在炎癥反應中起主要作用。用rCARDS TX干預BALB/cJ小鼠和狒狒后，動物以劑量和活性依賴性方式增加促炎性細胞因子(IL-1α，1β，IL-6, IL-12, IL-17，TNF-α，IFN-γ)和幾種生長因子和趨化因子(KC，IL-8，RANTES和G-CSF)的表達。CARDS TX具有高度免疫原性表位，能引起強烈的免疫原性反應，如驚人的IgM和IgG血清轉換。相關研究顯示CARDS TX作為一種可溶性的炎癥觸發(fā)因子，在 MP感染控制穩(wěn)定一段時間后仍具有激發(fā)氣道過敏性炎癥的功能[1]。單劑rCARDS足以誘導混合嗜酸性粒細胞-淋巴細胞炎癥、加重氣道高反應性[2,15-17,31]，IL- 4、IL- 13、CCL17和CCL22的增加提示rCARDS TX暴露后募集Th-2細胞，rCARDS TX暴露導致AHR表征為增加氣道阻力和肺部順應性降低，肺功能障礙和炎癥性病變依賴于CD4 +細胞[15,17,31]。CARDS TX通過其NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)組分的ADP核糖基化共定位并激活炎性小體，釋放IL-1β[18]，ADP-核糖基化是一種獨特的共價蛋白翻譯后修飾，炎癥小體激活和IL-1β釋放需要CARDS TX的內化和ADPRT活性[18]，向ER有效運輸CARDS TX也是誘導液泡形成和IL-1β釋放的關鍵步驟[3], Segovia等也證實了NLRP3炎性小體是MP感染引起的炎癥和免疫應答的關鍵調節(jié)劑[19]。CARDS TX干預小鼠可引起血清總IgE和CARDS TX特異性IgE的增加， Medina等[17]發(fā)現(xiàn)血清IgE的增加需要CARDS TX酶活性和STAT6，二者缺一不可。IgM和IgA的血清學應答可作為Mp感染的早期指標[20]，IgG抗體在感染發(fā)生后4-6周達到峰值，完整的特異性體液免疫對Mp的感染具有重要保護作用。有研究者報道，在急性感染和慢性感染定植狀態(tài)下，Mp的IgG水平降低或不存在[21]。

3 結構與功能關系

最新研究顯示CARDS TX具有獨特的的KELED序列，高效介導CARDS TX向ER運輸，CARDS TX向ER有效轉運對誘導液泡形成和IL-1β分泌至關重要[3]。早在20世紀末，人們通過使用PCR介導的定點誘變以用UGG替換每個UGA密碼子以表達全長編碼序列長度rCARDS TX。目前已獲取了MP不同臨床分離株(S1、 M129， L2，J1和RJL1)CARDS TX的全長DNA序列，CARDS TX序列在MP各臨床分離株中具有多態(tài)性。CARDS TX由17個α螺旋和43個β折疊組成，N-末端mART(mono-ADP ribosyltransferase，mART)結構域(N-terminal mART domain ,D1)和C-末端串聯(lián)β-三葉草結構域構(D2 + D3)，這三個結構域構成一個三角形分子，結構域1(D1)容納ADP-核糖基化活性，結構域2(D2)和3(D3)負責受體識別，結合，內化和空泡化[4,6,12]。串聯(lián)的C端結構域D2 + D3空間結構與蓖麻蛋白B相似，不同的是，CARDS TX D2 + D3β-三葉草結構域不具有半乳糖結合位點[6]。D3的顯著特征是其芳香族氨基酸含量，其中15個簇形與杜克嗜血菌(haemophilus ducreyi)的細胞致密擴張毒素(cytolethal distending toxin，CDT)中發(fā)現(xiàn)的芳香斑塊相似， 可以介導CARDS TX進入宿主細胞[6]。CARDS TX介導的空泡化也存在于D2 + D3中，并且獨立于D1或mART活性[12]。CARDS TX--炎性體相互作用的分子基礎可能涉及CARDS TX ART和相鄰的H4-S6-H5基序，后者介導D1-D3界面處的相互作用。也有研究表明PC，DPPC和SM結合活性位于D2 + D3，C-末端20殘基的截短消除了CARDS TX與細胞表面的結合和隨后的內化，表明受體結合功能位于D3中。CARDS TX結構和功能關系在細菌ADP-核糖基化毒素家族中具有獨特性,PTX，CTx和熱不穩(wěn)定腸毒素的mART結構域與CARDS TX D1最密切相關,但是代替β-三葉形，它們具有與碳水化合物結合的多肽的五聚體。盡管CARDS TX，CDT和蓖麻毒素在結構上通常被認為相似，其中每個具有與兩個β-三葉域結構配對的細胞毒性催化結構域，但從功能角度來看，CARDS TX相對于這些毒素仍然是獨特的，因為蓖麻毒蛋白和CDT具有N - 葡糖苷水解酶和核酸酶催化活性[6]。

4 CARDS TX與MP相關疾病

研究發(fā)現(xiàn)MP持續(xù)存在與哮喘的急性發(fā)作和惡化、復發(fā)有關，為治療增加難度[22,26]，最近的證據(jù)表明，可以通過大環(huán)內酯類藥物抑制氣道炎癥以及根除肺炎支原體來改善哮喘控制[29]。但有研究表明MP的持續(xù)存在與哮喘的癥狀與長期控制沒有顯著相關[23,30]。之前研究顯示單次暴露于CARDS TX足以誘導小鼠哮喘樣疾病,并且加重AHR[15,17]。CARDS TX的粘膜暴露引起嗜酸性粒細胞增加、AHR增高相對應的升高的T輔助2型炎癥反應、血清總IgE和CARDS TX特異性IgE的增加，特異性IgE識別CARDS TX N-末端的表位(N端1-249個氨基酸中)，但不與C端肽結合[1,15,17]，CCL-17和CCL-22的增加引起淋巴細胞和嗜酸性粒細胞募集并增加IL-4和IL-13的表達，嗜酸性粒細胞介導的肺部炎癥和AHR增加在哮喘中發(fā)揮重要作用[24]。FL(全長)和N-末端肽可誘導肥大細胞致敏、脫顆粒[17]。有證據(jù)表明炎癥小體和IL-1β在哮喘的疾病進展過程中發(fā)揮重要作用，哮喘患者血清或痰液標本IL-1β水平明顯高于非哮喘患者或無癥狀哮喘患者，IL-1β的表達減少或IL-1β受體減少均會降低哮喘的氣道過敏和支氣管周圍炎癥[18]，而CARDS TX通過其NLRP3組分的ADP核糖基化共定位并激活炎性小體[18]釋放IL-1β, 炎癥小體激活也導致肺損傷和肺重塑，這與哮喘和慢性阻塞肺病的發(fā)病機制有關[25]，Maselli等[16]也進一步證實了CARDS TX與哮喘預后不良有關。

在兒科疾病中，MP除了與哮喘相關外，也是CAP的常見病原體，此外MP也與慢性肺病和肺外疾病有關[24]。據(jù)報道，MP約占所有下呼吸道感染的10-40 %[27]。有研究表明自身免疫可能是MP相關的遲發(fā)性腦炎以及急性橫貫性脊髓炎，GBS(Guillain-Barré syndrome)，多發(fā)性神經根病和視神經炎的發(fā)病機制[2]。MP感染也與1 %～5 %的皮膚并發(fā)癥如多形紅斑和MP引起的皮疹和粘膜炎( Mycoplasmainduced rash and mucositis ，MIRM)表現(xiàn)為輕微紅斑丘疹，水皰疹中毒性表皮壞死松解和極少史蒂文- 約翰遜(Stevens-Johnson)綜合征[24,28]。MP感染的血液學表現(xiàn)包括由于自身免疫性冷凝集素引起的溶血性貧血和由于交叉反應性抗體使血漿血管性血友病因子裂解蛋白酶失活引起的血栓性血小板減少性紫癜，對于其他全身并發(fā)癥，需要進一步研究闡明病理路徑[24]，但是CARDS TX如何在這些疾病發(fā)揮作用尚未明確。

綜上所述，CARDS TX在MP致病機制中發(fā)揮主要作用，它的分子結構、致病機制、生物學特性等方面逐漸明確，但CARDS TX的內化受體、細胞內轉運機制可能存在其它途徑，仍需進一步研究。CARDS TX許多氣道反應性疾病和肺外并發(fā)癥直接相關，但其分子致病機制尚未明確。CARDS TX與MP感染相關疾病嚴重程度成正相關，但目前仍無法進行CARDS TX的早期及定量檢測，CARDS TX的早期定量檢測有望為MP感染相關疾病的早期診斷、診治、病情嚴重程度判斷及預后等提供實驗室依據(jù)，為臨床工作提供新的思路。