ZnO薄膜微觀形貌對(duì)腐敗希瓦氏菌生物被膜形成的影響

代 悅 魏旭青 孫 彤* 李秋瑩 段長平 勵(lì)建榮 郁曉君 丁浩宸

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧錦州121013 2 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 3 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧錦州121013 4 遼寧德善藥業(yè)有限公司 遼寧鞍山114104）

生物被膜可以被定義為細(xì)菌的多細(xì)胞群落，由細(xì)菌產(chǎn)生的胞外聚合物固定于生物與非生物表面，它是細(xì)菌在自然界生存的主要形式[1-4]。在食品生產(chǎn)過程中，微生物易附著于營養(yǎng)物質(zhì)表面，從而在食品及其生產(chǎn)設(shè)備表面形成生物被膜[5-7]。生物被膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，包括吸附、微菌落的形成、成熟與分解[8]。腐敗希瓦氏菌屬于革蘭氏陰性好氧桿菌，能夠產(chǎn)生硫化氫、TMA 及氨基酸代謝產(chǎn)物等，有很強(qiáng)的腐敗能力，是大宗水產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)腐敗菌屬之一[9-11]。一旦其在食品貯存和生產(chǎn)設(shè)備表面形成生物被膜，會(huì)難以清除，增加食品污染的幾率，并對(duì)設(shè)備造成損害[12]。因耐腐蝕、耐高溫、易加工、使用壽命長等特點(diǎn)，是不銹鋼制品的優(yōu)良性能，故被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中[13]。食品加工環(huán)境中存在大量水分和營養(yǎng)物質(zhì)，易在不銹鋼表面形成生物被膜[14]。

研究發(fā)現(xiàn)，ZnO 納米顆粒對(duì)大腸桿菌[15-16]、金黃色葡萄球菌[17]、表皮葡萄球菌[18-19]等有良好的抗菌性，可用于制備抗菌涂層。由于ZnO 具有良好的熱穩(wěn)定性、持久性及與人體的相容性，所以其應(yīng)用更加廣泛[20]。制備ZnO 薄膜的方法有溶膠-凝膠法[22]、水熱合成法[23]、脈沖激光沉積法[24]等。有研究表明，ZnO 對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌生物被膜均有抑制作用[23]。本文分別采用溶膠-凝膠法和水熱合成法于不銹鋼表面制備ZnO 薄膜，并在表征分析基礎(chǔ)上，研究ZnO 薄膜微觀結(jié)構(gòu)對(duì)水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制性能及抑制機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

腐敗希瓦氏菌（ATCC8071），美國微生物菌種保藏中心；不銹鋼片（316 L，0.2 mm），上海霸宇集團(tuán)；其它試劑均為分析純級(jí)。

儀器與設(shè)備：電子天平（PL602-L），梅特勒-托利儀器有限公司；接觸角測(cè)量儀（OCA15EC），北京東方德菲儀器有限公司；酶標(biāo)儀（Victor X3），上海珀金埃爾默儀器有限公司；X 射線粉末衍射儀（Rigaku Ultima IV），日本理學(xué)Rigaku 公司；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（S-4800 型），日本日立公司；100 mL 反應(yīng)釜，江蘇中凱亞不銹鋼制品廠；超聲波清洗器（SK8210HP），上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50FBS），上海申安醫(yī)療器械廠；潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD），蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱（LRH型系列），上海一恒科技有限公司；激光共聚焦顯微鏡（TCS-SP5 II），德國徠卡儀器有限公司。

1.2 ZnO 薄膜制備及表征

1.2.1 ZnO 薄膜制備

1） 溶膠-凝膠法制備ZnO 薄膜 分別采用無水乙醇和蒸餾水超聲清洗不銹鋼片，晾干后備用。將0.3 mol/L 醋酸鋅與同濃度單乙醇胺的異丙醇溶液混合，60 ℃恒溫條件下攪拌2 h，得澄清、均勻的溶液，室溫陳化16 h 得具有一定黏度的溶膠。將不銹鋼片緩慢浸入溶膠中，靜置5 s 后，緩慢勻速提拉出液面，室溫干燥后，450 ℃煅燒1 h，得ZnO 薄膜。

2） 水熱合成法制備ZnO 薄膜 經(jīng)丙酮、乙醇超聲清洗后的不銹鋼片浸于沸騰的0.01 mol/L醋酸鋅與同濃度NaOH 乙醇混合溶液中，30 min后取出，110 ℃烘干1 h，300 ℃煅燒20 min 得種子層。取濃度均為0.02 mol/L 醋酸鋅和六次甲基四胺混合溶液，用氨水調(diào)節(jié)其pH 值至11.2，加入0.5%聚乙烯吡咯烷酮，放入帶種子層的不銹鋼片，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在75%填充率條件下95 ℃水熱反應(yīng)2 h，取出不銹鋼片，480 ℃煅燒2 h，得ZnO薄膜。

將上述樣品放入10 mmol/L 的硬脂酸乙醇溶液中浸泡16 h，室溫干燥得疏水性改性樣品。

1.2.2 ZnO 薄膜表征分析 采用X 射線粉末衍射儀對(duì)不銹鋼、sol-gel 法制備的粉體以及水熱合成法制備的ZnO 薄膜進(jìn)行XRD 分析，檢測(cè)條件：40 kV，50 mA，CuKα 輻射，步寬0.02°，掃描范圍5°～70°。樣品被噴金后，采用發(fā)射掃描電子顯微鏡，在20 kV 條件下觀察ZnO 薄膜表面形貌。采用接觸角測(cè)量儀測(cè)定材料表面的水接觸角，選擇3 個(gè)部位，取平均值。

1.3 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜表征分析

二次活化后，調(diào)節(jié)腐敗希瓦氏菌菌懸液的OD值約為0.5，用LB 肉湯溶液稀釋200 倍。取上述稀釋后的菌懸液1 mL 于無菌離心管中，放入基片（0.5 cm×0.5 cm，不銹鋼片及有ZnO 薄膜的不銹鋼片），在28 ℃培養(yǎng)，得生物被膜。

1.3.1 結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物被膜總量 分別將基片置于無菌離心管中，用1 mL 生理鹽水洗滌2次，去除浮游菌。加入體積分?jǐn)?shù)0.2%的結(jié)晶紫溶液1 mL，染色5 min。取出基片放入另一無菌的離心試管中，用1 mL 生理鹽水洗滌兩次，去除結(jié)晶紫浮色。再加入200 μL 體積分?jǐn)?shù)33%的乙酸溶液，脫色10 min。吸取脫色后溶液于96 孔板中，采用酶標(biāo)儀測(cè)定溶液的OD595值，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行。

1.3.2 超聲波平板法測(cè)定生物被膜的菌落生長曲線 用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）沖洗上述基片3 次，去除浮游菌，再放入10 mL PBS 中，超聲處理10 min（53 kHz、25 ℃）。梯度稀釋菌懸液，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定腐敗希瓦氏菌生物被膜的菌落數(shù)量，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，繪制生長曲線。

1.3.3 生物被膜微觀形貌觀察 取出上述基片，用無菌水沖洗3 次，放入4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛中浸泡4 h，取出，分別于不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（50%，70%，80%，90%）中浸泡30 min，在無水乙醇中浸泡1 h，而后于超凈臺(tái)內(nèi)自然風(fēng)干。樣品噴金處理后，用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察其微觀形貌。

1.3.4 生物被膜多糖粘附素（PIA）的測(cè)定 取出上述基片，用無菌PBS 洗去表面的浮游菌，超聲洗脫生物被膜，用接種環(huán)取生物被膜洗脫液于剛果紅培養(yǎng)基中劃線，28 ℃培養(yǎng)24 h，檢測(cè)生物被膜產(chǎn)生PIA 能力的變化[1]。

1.3.5 生物被膜的胞外多糖（PBS）含量、新陳代謝活性及蛋白含量的測(cè)定 取上述基片，用無菌PBS 沖洗，置于10 mL PBS 中，53 kHz、25 ℃超聲處理10 min，采用硫酸-蒽酮法測(cè)定基片上生物被膜中胞外多糖的含量[26]，采用XTT 比色法測(cè)定基片上被膜菌的新陳代謝活性[27]，采用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定生物被膜中蛋白質(zhì)含量的變化[28]。

1.3.6 生物被膜激光共聚焦顯微鏡觀察 將0.01%吖啶橙（AO）溶液和0.1%碘化丙啶（PI）溶液用前混合。上述有生物被膜附著的基片用PBS洗滌3 次，滴加AO、PI 混合染液避光染色15 min，PBS 洗滌3 次，吸干多余水分，加10 μL 抗熒光淬滅封片劑封閉，4 ℃避光保存，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 不銹鋼及其表面ZnO 薄膜的XRD 表征分析

XRD 分析結(jié)果表明，sol-gel 法制備的ZnO 薄膜主要成分為六方纖鋅礦型ZnO，在2θ 為31.7°，34.4°，36.2°，47.5°，56.6°，62.8°，66.3°，67.9°和69.1°出現(xiàn)衍射峰，分別對(duì)應(yīng)ZnO 的（100）、（002）、（101）、（102）、（110）、（103）、（200）、（112）和（201）晶面，衍射峰強(qiáng)度較高，說明樣品的結(jié)晶度好，晶粒尺寸較大。水熱合成法制備的ZnO 薄膜主要成分亦為六方纖鋅礦型ZnO，由于測(cè)定樣品厚度有限，所以其衍射峰強(qiáng)度略低，且（002） 晶面很強(qiáng)，樣品延某一生長面優(yōu)勢(shì)生長。

2.2 不銹鋼片及ZnO 薄膜的SEM 表征

圖1 不銹鋼片及ZnO 薄膜XRD 譜圖Fig.1 XRD patterns of the stainless steel sheet and ZnO films

樣品微觀形貌表征結(jié)果表明，不銹鋼表面較平滑，有少量突起的條紋。sol-gel 法制備的ZnO薄膜由大量的納米顆粒堆積而成，顆粒呈無規(guī)則形狀，粒徑40～60 nm，分散均勻，有少量團(tuán)聚。水熱合成法制備的ZnO 薄膜由大量縱向生長的ZnO納米棒組成，直徑約50 nm，分布均勻，該結(jié)果與XRD 分析結(jié)果一致，是因ZnO 晶體延某一特定的生長方向優(yōu)勢(shì)生長而成。

圖2 不銹鋼片及ZnO 薄膜掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of stainless steel sheet and ZnO films

2.3 不銹鋼片及ZnO 薄膜的親疏水性表征

由表1可見，樣品均具有疏水性，且ZnO 薄膜比不銹鋼片的疏水性強(qiáng)，其中sol-gel 法的ZnO 薄膜疏水性相對(duì)較弱，水熱合成法的ZnO 薄膜疏水性較強(qiáng)。不銹鋼片及ZnO 薄膜經(jīng)硬脂酸浸漬改性后，其表面的親水性活性基團(tuán)與硬脂酸的-COOH結(jié)合，使其疏水性基團(tuán)指向薄膜外端，樣品表現(xiàn)為疏水性。ZnO 薄膜較粗糙，有較多孔隙，當(dāng)水在其表面潤濕時(shí)，形成較多的空氣空腔，其疏水性增強(qiáng)。水熱合成法制備的ZnO 薄膜由向外生長的納米棒組成，孔隙多，其疏水性強(qiáng)。

表1 不銹鋼片及ZnO 薄膜水接觸角Table 1 The water contact angle of stainless steel and ZnO films

2.4 腐敗希瓦氏菌生物被膜的粘附及被膜菌生長曲線

由圖3可見，腐敗希瓦氏菌生物被膜的粘附總量和被膜菌數(shù)量在生物被膜培養(yǎng)過程中逐漸增大。2 h 前，生物被膜粘附率及被膜菌數(shù)量增加快速，生物被膜從可逆附著轉(zhuǎn)化為不可逆附著，此為生物被膜的生化作用階段和菌體附著階段。2～12 h，生物被膜的粘附量及被膜菌數(shù)量增加，生物被膜中的粘附多糖及蛋白等粘附成分為被膜菌的生長提供養(yǎng)分，生物被膜進(jìn)入生長期。12～36 h，生物被膜的粘附量持續(xù)增長，而被膜菌總量的增長速度顯著降低，即生物被膜粘附量的增加并未促進(jìn)被膜菌的生長，說明生物被膜進(jìn)入成熟期。36 h后，雖然被膜菌總數(shù)緩慢增加，但生物被膜粘附率急劇下降，說明粘附物質(zhì)開始脫落，生物被膜進(jìn)入衰退期。在此期間，被膜菌利用殘留生物被膜中的胞外多糖和其它營養(yǎng)成分繼續(xù)生長。

比較ZnO 薄膜及不銹鋼表面的生物被膜生長情況，不銹鋼片表面的生物被膜粘附量和被膜菌總數(shù)增加的速度較快，ZnO 薄膜表面的生物被膜粘附物較少，且被膜菌增長速度較慢，說明ZnO 薄膜具有抑制腐敗希瓦氏菌生物被膜粘附和生長的性能，且水熱合成法制備的ZnO 薄膜對(duì)腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制性能優(yōu)于sol-gel 法制備的樣品。分析認(rèn)為，薄膜表面的疏水性及抗菌性能均對(duì)其生物被膜抑制性能有影響。材料表面的疏水性越強(qiáng)，生物被膜的粘附性越差，粘附物為被膜菌提供的養(yǎng)分減少，表現(xiàn)為表面生物被膜粘附總量和被膜菌總數(shù)較少。同時(shí)，由于ZnO 薄膜樣品具有抗菌性，所以當(dāng)生物被膜附著于其表面，其溶出的Zn2+進(jìn)入生物被膜，破壞被膜菌的細(xì)胞膜完整性，使被膜菌是生長速度顯著降低。水熱合成法制備的ZnO 薄膜由納米棒組成，具有更大的比表面積和更強(qiáng)的疏水性，其抑制生物被膜的性能最優(yōu)。

圖3 不銹鋼片及不ZnO 薄膜上生物被膜的粘附（A）及被膜菌生長曲線（B）Fig.3 The grow curve of the biofilm adhesion （A） and total number of live biofilm bacteria （B） on the stainless steel and ZnO films

2.5 腐敗希瓦氏菌生物被膜微觀形貌

不銹鋼片及ZnO 薄膜上生物被膜在不同生長階段的掃描電鏡表征結(jié)果見圖4。生物被膜培養(yǎng)2 h 后，材料表面有多糖及蛋白質(zhì)粘附物質(zhì)，未見完整菌體，說明此時(shí)為生物被膜形成的初始粘附階段。12 h 時(shí)，材料表面粘附物質(zhì)顯著增多，可見少量體積較小的菌體。36 h 時(shí)，生物被膜粘附物表面的生物被膜粘附物很多，可見體積很大的完整菌體，說明此階段生物被膜上的腐敗希瓦氏菌生長狀態(tài)良好，營養(yǎng)豐富，即生物被膜進(jìn)入成熟期。48 h 時(shí)，生物被膜粘附物的完整性被破壞，菌體體積明顯減小，且ZnO 薄膜表面可見形態(tài)不完整的菌體，說明部分被膜菌的細(xì)胞膜完整性被ZnO 破壞，生物被膜進(jìn)入衰退期。此結(jié)果與圖3的分析結(jié)果一致。

圖4 不銹鋼片及ZnO 薄膜表面生物被膜的微觀形貌Fig.4 The microstructures of the biofilms on the stainless steel sheet and ZnO films

2.6 薄膜表面腐敗希瓦氏菌生物被膜CLSM 表征

生物被膜經(jīng)AO 和PI 混合染液染色后于激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見紅綠熒光，生物被膜中活菌被AO 染為綠色，死菌被PI 染為紅色，如圖5所示。

圖5 不銹鋼片及ZnO 薄膜表面生物被膜的CLSM 圖Fig.5 The CLSM images of the biofilms on the stainless steel sheet and ZnO films

由圖5可見，生物被膜培養(yǎng)2 h 后，表面有少量活菌。而后，被膜菌中活菌增多，36 h 時(shí)可見較多的活菌。48 h 時(shí)，活菌總數(shù)減少，且出現(xiàn)死菌，其中水熱合成法制備的ZnO 薄膜表面的死菌數(shù)量最多，說明該樣品具有較強(qiáng)的抑菌性能。此結(jié)果與圖3、圖4的分析結(jié)果一致。

2.7 薄膜表面腐敗希瓦氏菌生物被膜PIA 變化

生物被膜產(chǎn)生多糖粘附素（PIA）的能力是衡量微生物形成生物被膜能力的重要指標(biāo)，采用剛果紅平板法檢測(cè)其變化，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不銹鋼及ZnO 薄膜表面生物被膜PIA 圖Fig.6 PIA images of biofilms on the stainless steel an ZnO films with the extending of incubation time

由圖6可見，生物被膜培養(yǎng)4 h 后，仍具有較強(qiáng)的產(chǎn)生PIA 的能力，說明此時(shí)生物被膜的粘附能力很強(qiáng)，有利于被膜生長。培養(yǎng)12 h 后，生物被膜產(chǎn)生PIA 的能力顯著下降，生物被膜粘附物質(zhì)的增長速度下降。培養(yǎng)36 h 后，生物被膜產(chǎn)生PIA的能力進(jìn)一步顯著下降，此時(shí)生物被膜粘附量達(dá)到最大，繼而被膜粘附物質(zhì)開始脫落，即生物被膜進(jìn)入衰退期。此外，同期不同材料表面的生物被膜產(chǎn)生PIA 的能力無差別，說明影響生物被膜粘附的主要因素是材料表面的疏水性。

2.8 腐敗希瓦氏菌生物被膜的EPS 含量、蛋白含量及新陳代謝活性的變化

胞外多糖（EPS）是生物被膜的重要組成成分，生物被膜合成EPS 的能力與被膜菌的生長速率及所處生長時(shí)期有關(guān)。由圖7可見，生物被膜生長過程中，其合成EPS 能力、蛋白含量及新陳代謝活性均逐漸增強(qiáng)，且不銹鋼片上的量遠(yuǎn)高于同期ZnO薄膜上的量，其變化趨勢(shì)與生物被膜粘附總量（圖3（1））一致，說明生物被膜中EPS 和蛋白均為其主要營養(yǎng)成分，為被膜菌的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)。由圖7（3）可見，水熱合成法制備的ZnO 薄膜表面的被膜菌生長速度和總量遠(yuǎn)低于其它2 個(gè)樣品，說明其抗菌能力極強(qiáng)，顯著抑制了被膜菌的代謝和生長，這可能是由于該結(jié)構(gòu)的ZnO 薄膜中的納米棒縱列結(jié)構(gòu)形成了較大的比表面積，與被膜菌的接觸面積增大，且可能有針刺狀結(jié)構(gòu)輔助離子浸出而破壞菌體細(xì)胞的完整性。此外，36 h 后被膜菌的新陳代謝活性下降，說明此時(shí)進(jìn)入生物被膜的衰退期。

圖7 不銹鋼片及ZnO 薄膜表面生物被膜的EPS、蛋白含量及新陳代謝活性的變化Fig.7 The content of EPS and protein，the metabolic activity of the biofilms on the stainless steel sheet and ZnO films

3 結(jié)論

采用sol-gel 法和水熱合成法在不銹鋼片表面制備的ZnO 薄膜具有不同的微觀結(jié)構(gòu)。sol-gel法制備的ZnO 薄膜由大量無規(guī)則形狀的納米顆粒堆積而成，分散均勻，有少量團(tuán)聚；水熱合成法制備的ZnO 薄膜由縱向生長的、均勻的ZnO 納米棒組成，且后者的疏水性更強(qiáng)。ZnO 薄膜對(duì)腐敗希瓦氏菌生物被膜具有抑制性能，且水熱合成法制備的ZnO 薄膜的抗生物被膜性能最優(yōu)。腐敗希瓦氏菌生物被膜的粘附總量和被膜菌數(shù)量均隨生物被膜培養(yǎng)時(shí)間的延長而增大。進(jìn)入衰退期后，生物被膜的粘附物質(zhì)開始脫落。材料表面的疏水性及抗菌性能均對(duì)其生物被膜抑制性能有影響，其中疏水性是影響生物被膜粘附的主要因素，ZnO 薄膜的抗菌成分破壞了被膜菌的完整性和新陳代謝能力。