培養(yǎng)條件對(duì)保加利亞乳桿菌中胞外肽酶PrtB基因表達(dá)的影響

盧佳音 李東飛 趙悅含 侯俊財(cái)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030）

乳酸菌菌體在生長(zhǎng)過程中，培養(yǎng)環(huán)境中的肽和游離氨基酸很快被消耗[1]。當(dāng)乳酸菌在發(fā)酵與生長(zhǎng)時(shí)，通常存在許多大分子蛋白質(zhì)及一些無機(jī)氮源，然而這些都不能被乳酸菌直接利用，通常情況下，乳酸菌將這些大分子的蛋白質(zhì)分解掉，補(bǔ)充其自身生長(zhǎng)所需的氨基酸[2]。通常由3 部分構(gòu)成乳酸菌的水解體系：將細(xì)胞外的蛋白質(zhì)水解成多肽的胞外蛋白酶；轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將胞外水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)；胞內(nèi)肽酶將轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的水解產(chǎn)物進(jìn)一步水解為游離氨基酸，在細(xì)胞內(nèi)的一些物質(zhì)代謝與蛋白質(zhì)的合成反應(yīng)中，都會(huì)有它們的參與[3]。根據(jù)研究顯示，有3 種基因是乳酸菌常見的，分別為PrtB、PrtP 和PrtS，而保加利亞乳桿菌為PrtB，乳酸乳球菌為PrtP，嗜熱鏈球菌為PrtS[4]。相對(duì)于其它乳酸菌，有關(guān)保加利亞乳桿菌的蛋白水解酶的基因表達(dá)研究相對(duì)較少[5]，尤其國內(nèi)少有報(bào)道。以RT-PCR 技術(shù)作為主要的檢測(cè)方法，通過設(shè)置不同培養(yǎng)條件，探究保加利亞乳桿菌中PrtB 基因的表達(dá)變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑

菌株：德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus debreuckii ssp.bulgaricus）LB08006、LB08007、LB08012、LB08014、LB08015、LB08016、LB08017，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室分離保存。

主要試劑：EDTA·2Na，Amresco；DEPC，科爾生物有限公司；RNAprep pure 培養(yǎng)細(xì)菌總RNA提取試劑盒，天根生化科技北京有限公司；Primer-ScriptRRT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，寶生物大連工程有限公司；SYBRRPremix Ex TaqTM試劑盒，寶生物大連工程有限公司。

1.2 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將菌株活化后連續(xù)傳代培養(yǎng)，在42 ℃培養(yǎng)條件下，每2 h 取出2 mL 培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)為OD600，測(cè)定其吸光值[6]。

1.3 基因表達(dá)的檢測(cè)方法

根據(jù)課題目的（在轉(zhuǎn)錄水平上探討乳酸菌不同樣本之間關(guān)鍵酶PrtB 基因的表達(dá)變化規(guī)律），主要采用RT-PCR 手段進(jìn)行研究。

1.4 關(guān)鍵酶基因及管家基因的確定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]至[11]中所示方法確關(guān)鍵酶基因及管家基因定。

其目的基因見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 的目的基因Table 1 Target genes for real-time qPCR

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物設(shè)計(jì)與合成

用16s rRNA 作管家基因[12]，根據(jù)GenBank提供的德氏乳桿菌保加利亞亞種ATCC 11842 的DNA 序列（GenBank accession number：NC_ 008054.1）中相應(yīng)基因的序列，采用primer5.0 軟件設(shè)計(jì)基因引物，如表2所示。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物Table 2 The primer of real-time RT-PCR

1.6 RNA 的提取

根據(jù)RNAprep pure 試劑盒法，其提取步驟按照說明書。

1.7 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 參照杜越歐等[13]的方法，利用PrimerScriptR RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （日本Takara Biotechnology），其提取步驟按照說明書。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用Takara 公司的SYBRRPremix Ex TaqTM試劑盒配制PCR 反應(yīng)液，反應(yīng)體系為：SYBRRPremix Ex TaqTM（2×）10 μL；上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL；ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL；dH2O（滅菌蒸餾水）6.8 μL，稀釋cDNA 為原樣品的10 倍，取樣品2 μL；總體系為20 μL[13]。

使用ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試驗(yàn)，不同反應(yīng)體系樣品做3 個(gè)重復(fù)。通過兩步法PCR 擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：預(yù)變性的條件：95 ℃30 s；PCR 反應(yīng)：95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 循環(huán)。

1.9 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1.9.1 不同生長(zhǎng)階段對(duì)胞外肽酶PrtB 基因表達(dá)的影響 活化好試驗(yàn)用菌，通過測(cè)定其生長(zhǎng)曲線來選擇本試驗(yàn)用菌種。分別在6，12，18 h 與24 h提取發(fā)酵液，再提取菌體RNA。

1.9.2 不同氮源對(duì)胞外肽酶PrtB 基因表達(dá)的影響 采用液體MRS 培養(yǎng)基、無氮液體MRS 培養(yǎng)基與含酪蛋白胨液體MRS 培養(yǎng)基，將試驗(yàn)用菌接入其中，調(diào)整pH 6.2，42 ℃，12 h。

1.9.3 不同初始pH 對(duì)胞外肽酶PrtB 基因表達(dá)的影響 7 株保加利亞乳桿菌經(jīng)活化分別接種于初始pH 5.6，5.9，6.2，6.5 的液體MRS 培養(yǎng)基中，42℃，12 h。

1.9.4 不同溫度對(duì)胞外肽酶PrtB 基因表達(dá)的影響 將恒溫水浴鍋溫度的設(shè)置為30，37，42 ℃和45 ℃，在pH 6.2 條件下發(fā)酵12 h。

首先提取RNA，隨后測(cè)定其濃度與完整性，再將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后通過RT-PCR 檢測(cè)。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 數(shù)據(jù)處理分析

分析基因CT 值，求得標(biāo)化后的-△△CT 值，通過2-△△CT 法評(píng)估目的基因的相對(duì)表達(dá)量[14]。用SPSS（11.5）軟件進(jìn)行方差和雙因素試驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

相對(duì)于其它方法，RT-PCR 具有更高的靈敏性與準(zhǔn)確性，鑒別乳酸菌的菌種與其基因差異更加普遍[7，15-16]。

2.1 RNA 的數(shù)量和質(zhì)量

RNA 的數(shù)量與質(zhì)量決定了后續(xù)試驗(yàn)?zāi)芊癯晒?，其中，總RNA 的數(shù)量是反轉(zhuǎn)率效率的關(guān)鍵點(diǎn)。圖1中，23S 與16S 均能被清晰觀察到，此結(jié)果說明RNA 有很小程度的降解。

基因組DNA 可被試劑盒提供的DNA 酶（DNase I） 高效提取。在這種條件下能有效預(yù)防RNA 樣品被基因組DNA 污染，發(fā)生非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致RNA 的表達(dá)量高于實(shí)際量。本試驗(yàn)提取的RNA 樣品經(jīng)檢測(cè)，可用于后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試驗(yàn)。

圖1 RNA 樣品電泳圖Fig.1 Electrophoresis of RNA

利用反轉(zhuǎn)錄法將得到的RNA 轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，通過PCR 試驗(yàn)，根據(jù)條帶的大小與目的基因作對(duì)比，由此可以確定二者的相似度。若沒有出現(xiàn)雜條帶，且在適宜的亮度區(qū)間內(nèi)，則證明通過反轉(zhuǎn)率合成的cDNA 無污染現(xiàn)象，引物具有良好的特異性。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果

如圖2所示，在熔解曲線中，只出現(xiàn)單一峰，由此可以排除形成的引物二聚體和非特異產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，說明引物具有非常好的特異性。

通過擴(kuò)增曲線圖3發(fā)現(xiàn)，管家基因與目的基因PrtB 不僅擴(kuò)增效率極好，而且穩(wěn)定性也非常好，CT 值的重復(fù)性非常好。

圖2 管家基因和目的基因PCR 產(chǎn)物的熔解曲線Fig.2 The melt curves of PCR products of endogenous reference gene and target gene

圖3 管家基因和目的基因PCR 產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線Fig.3 The amplification curves of PCR products of endogenous reference gene and target gene

2.3 不同生長(zhǎng)階段胞外肽酶PrtB 基因表達(dá)情況分析

2.3.1 保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)曲線 為探究保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期與穩(wěn)定期，提取RNA。本研究篩選出7 株菌，其中LB08012、LB08014 和LB08016 生長(zhǎng)狀況最好。如圖4所示，在確保培養(yǎng)條件一致的情況下，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為2 h 時(shí)3 株菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；培養(yǎng)時(shí)間16 h 達(dá)到穩(wěn)定期。LB08014 活力最強(qiáng)，LB08012 活力最弱。

2.3.2 PrtB 在菌株不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)情況分析 由菌體生長(zhǎng)曲線可見，2～16 h，3 株菌株達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期在18～24 h。將6，12，18，24 h 為設(shè)置為目的時(shí)間。

如圖5所示，選取的3 株菌在生長(zhǎng)過程中，目的基因PrtB 在對(duì)數(shù)初期與穩(wěn)定期的表達(dá)量都顯著下降。選取的4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，培養(yǎng)時(shí)間為6 h 時(shí)PrtB 基因的表達(dá)量最大。培養(yǎng)時(shí)間12 h 時(shí)菌株LB08012 中的PrtB 基因表達(dá)量明顯下降（P<0.01）。LB08014 中，目的基因PrtB 在培養(yǎng)時(shí)間12 h 時(shí)的表達(dá)量下降幅度最小，下降2.5 倍。到達(dá)對(duì)數(shù)末期時(shí)，其趨于穩(wěn)定。穩(wěn)定期時(shí)，不發(fā)生顯著改變，與對(duì)數(shù)初期相比有極顯著的差異（P<0.01）。

為探究PrtB 基因受菌株、培養(yǎng)時(shí)間與二者因素對(duì)相對(duì)表達(dá)量的影響采用雙因素試驗(yàn)的方法。通過表3可以發(fā)現(xiàn)，PrtB 基因受到菌株與培養(yǎng)時(shí)間的影響顯著（P<0.001），不僅如此，二者間交互作用也同樣顯著（P<0.001）。

圖4 保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of Lacbobacillus bulgaricus

圖5 菌體不同生長(zhǎng)階段目的基因PrtB 表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Kinesis of the target gene PrtB during the different growth phase

表3 3 個(gè)菌株不同生長(zhǎng)時(shí)期目的基因的相對(duì)表達(dá)分析Table 3 Analysis of the relativity quality of the target genes during’ different growth phase of three strains

2.4 不同氮源對(duì)PrtB 基因表達(dá)的影響

乳酸菌生長(zhǎng)體系中的蛋白質(zhì)通常情況下會(huì)被乳酸菌水解，轉(zhuǎn)化為氨基酸與小分子游離氨基酸來維持菌體自身的生長(zhǎng)。

由表4可以看出，氮源條件對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（P<0.05），且PrtB 基因的表達(dá)在不同菌株之間同樣存在顯著差異。此外，如圖6所示，N 缺乏條件與正常MRS 培養(yǎng)條件相比，PrtB 的表達(dá)量呈上升的趨勢(shì)（P<0.05），平均上調(diào)2.4 倍，其在LB08015 中變化最大，在LB08012 中變化最小；添加酪蛋白胨后，PrtB 的表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05），平均下調(diào)4.1 倍。其在LB08012 中的下降趨勢(shì)最為顯著。

2.5 不同初始pH 對(duì)PrtB 基因表達(dá)的影響

不同的pH 環(huán)境會(huì)對(duì)酶活性影響顯著。

通過調(diào)整不同的初始pH，PrtB 基因的表達(dá)見表5和圖7。圖7中，pH 顯著影響PrtB 基因的表達(dá)，不僅如此，PrtB 基因的表達(dá)在不同菌株之間同樣存在顯著差異。在LB08006、LB08007、LB08012和LB08016 中，隨著初始pH 的提高，PrtB 基因的表達(dá)水平上調(diào)。在初始pH6.5 的培養(yǎng)條件下PrtB的表達(dá)量與初始pH5.6 相比，上調(diào)5.0 倍，LB08016 與LB08006、LB08007 和LB08012PrtB 的PrtB 表達(dá)量相比差異極顯著 （P<0.01）；而 在LB08014 和LB08017 中，當(dāng)調(diào)整初始pH 為5.6時(shí)，其表達(dá)量明顯低于初始pH5.9、初始pH 6.2 和初始pH 6.5；在LB08015 中，PrtB 的表達(dá)呈先上升后下降的規(guī)律。

綜上，當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)環(huán)境的pH 值為5.9，6.2，6.5 時(shí)，相比于對(duì)照組，LB08006、LB08007、LB08012和LB08016 中目的基因顯著上調(diào)，LB08014、LB08015 和LB08017 中的目的基因顯著下調(diào)。菌株的差異與培養(yǎng)條件共同影響其基因的表達(dá)。

圖6 不同氮源培養(yǎng)下目的基因PrtB 表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化Fig.6 Kinesis of the target gene PrtB at the different nitrogen source cultivation

圖7 不同初始pH 培養(yǎng)下目的基因PrtB 表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化Fig.7 Kinesis of the target gene PrtB at the different initial pH cultivation

表4 不同氮源培養(yǎng)下PrtB 的相對(duì)表達(dá)量（n=3）Table 4 The relative quantity of PrtB at the different nitrogen source cultivation（n=3）

表5 不同初始pH 培養(yǎng)下PrtB 的相對(duì)表達(dá)量（n=3）Table 5 The relative quantity of PrtB in the different initial pH cultivation（n=3）

2.6 不同溫度對(duì)PrtB 基因表達(dá)的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溫度通過干擾蛋白酶的活性來干擾菌體的生長(zhǎng)。本研究通過調(diào)整溫度條件來探究PrtB 基因表達(dá)的改變。

如表6與圖8所示，12h 后，溫度差異會(huì)給PrtB 的表達(dá)帶來影響。在LB08006、LB08016 和LB08017 3 種保加利亞乳桿菌中，30 ℃時(shí)PrtB 的表達(dá)量最高，在37，42 ℃和45 ℃時(shí)較30 ℃有所下降。其中，在37、42 ℃和45 ℃時(shí)，其呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。

在LB08007、LB08012、LB08014 和LB08015中PrtB 基因的表達(dá)變化呈先上升再下降的趨勢(shì)，在37 ℃時(shí)達(dá)到最高，相對(duì)于對(duì)照組分別上調(diào)了1.3、2.3、5.3 倍和15.5 倍。在LB08015 中差異最大，在LB08007 中差異最小（P＜0.05）；45 ℃時(shí)目的PrtB 基因的表達(dá)量最低，與對(duì)照組相比分別下降了50，41.7，5.6 倍和1.9 倍。

表6 不同初始溫度培養(yǎng)下PrtB 的相對(duì)表達(dá)量（n=3）Table 6 The relative quantity of PrtB in the different temperature cultivation（n=3）

圖8 不同溫度培養(yǎng)下目的基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化Fig.8 Kinesis of the target gene in the different temperature cultivation

3 討論

乳酸菌中，乳酸桿菌蛋白的水解能力比乳酸球菌的水解能力強(qiáng)[17-18]。本試驗(yàn)選取保加利亞乳桿菌為目的菌株。胞外酶、轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)與胞內(nèi)酶為構(gòu)成蛋白水解體系的主要成分。保加利亞乳桿菌的蛋白水解體系中的胞外酶經(jīng)過基因鑒定為PrtB 基因，其最重要的功能就是將大分子蛋白水解為多肽。在乳酸菌研究領(lǐng)域，廣泛應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)來探討不同樣本或同一樣本在不同處理前、后某一基因的表達(dá)水平。

伴隨著菌體的不斷生長(zhǎng)，胞外酶PrtB 基因表達(dá)水平有所上升，在對(duì)數(shù)期至穩(wěn)定期區(qū)間，其變化趨勢(shì)為下降，達(dá)到穩(wěn)定期后無顯著變化的趨勢(shì)。其蛋白在轉(zhuǎn)綠與翻譯的過程中，由于生物學(xué)差異，造成PrtB 的差異。不僅如此，PrtB 的表達(dá)水平在不同菌株之間存在顯著差異，這可能是由于菌體自身的生物學(xué)活性導(dǎo)致的[19-20]。本研究與Leila Sadat-Mekmene 等[21]的發(fā)現(xiàn)一致，其通過探究不同生長(zhǎng)時(shí)期胞外蛋白酶的變化，得出在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胞外酶基因的表達(dá)量最大，與菌體生長(zhǎng)呈正相關(guān)。試驗(yàn)中PrtB 基因表達(dá)的下降趨勢(shì)與Nicoline Vermeulen 等[15]的研究結(jié)果一致，其認(rèn)為對(duì)數(shù)期與穩(wěn)定期Lactobacillus sanfranciscensis DSM 20451T中蛋白酶OppF、DtpT 和PepT 在面團(tuán)發(fā)酵過程中基因表達(dá)的水平都是下降的。綜上所述，在對(duì)數(shù)初期，保加利亞乳桿菌蛋白酶表達(dá)量最大，其它時(shí)期相對(duì)較小。

目的基因PrtB 在無氮源條件下表達(dá)量有所增加。本試驗(yàn)中，添加酪蛋白胨條件與正常MRS培養(yǎng)條件相比，PrtB 的表達(dá)量顯著下調(diào)。這是由于當(dāng)培養(yǎng)基添加了酪蛋白胨后，菌體的繁殖非常迅速，穩(wěn)定期后，菌體蛋白基因表達(dá)因游離氨基酸的積累而受到抑制。氮源可以抑制PrtB 基因在蛋白質(zhì)水解體系中的表達(dá)。

當(dāng)初始pH 增加時(shí)，其基因的表達(dá)有所增加。這與Rina Wu 等[22]得到的結(jié)論一致，其對(duì)Lactobacillus casei Zhang 中PepP 基因 在pH 2.5 和pH6.4 環(huán)境中的表達(dá)進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示該基因在低pH 值下的表達(dá)水平也較低，而PrtB 會(huì)因生物學(xué)的差異而在一些菌株中下降。這種差異同樣表現(xiàn)在蛋白的水平上。pH 值對(duì)蛋白的水解率的影響因菌株的差異而有所不同，當(dāng)菌體細(xì)胞膜上的電荷受的pH 值影響時(shí)，其膜的通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致其蛋白酶的活性與氮源吸收率的改變；在較低的pH 條件下，乳酸菌無法平衡細(xì)胞內(nèi)的pH 穩(wěn)定，使得細(xì)胞內(nèi)的pH 也降低，抑制乳酸菌生長(zhǎng)[23]。同樣，菌株的特性決定了抑制的情況[24]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在LB08007、LB08012、LB08014 和LB08015 中，PrtB 基因的表達(dá)量先上升后下降，在37 ℃最高，45 ℃最低。30 ℃時(shí)，低溫同樣使得表達(dá)量很低，一部分菌體處于休眠狀態(tài)。不僅如此，酶活性也受低溫的影響。PrtB 基因的表達(dá)在37 ℃上升，45 ℃下降可能是因?yàn)?7 ℃為最適的生長(zhǎng)溫度，菌體處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，所需肽與氨基酸也更多，更多的蛋白質(zhì)被蛋白酶分解，進(jìn)而蛋白酶表達(dá)水平較高。

綜合以上分析，PrtB 基因活性顯著影響發(fā)酵劑的品質(zhì)。其菌屬與生長(zhǎng)環(huán)境共同決定其蛋白的水解特性。通過研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時(shí)間、氮源種類、初始pH 和培養(yǎng)溫度是影響其活性的主要條件。

4 結(jié)論

PrtB 基因的表達(dá)受培養(yǎng)時(shí)間、氮源種類和含量、初始pH 和培養(yǎng)溫度的影響。LB08012、LB08014、LB08016 中，PrtB 基因在對(duì)數(shù)初期至穩(wěn)定期表達(dá)量顯著下降，到穩(wěn)定期PrtB 基因已不表達(dá)。PrtB 的表達(dá)量在N 缺乏條件下上升（P<0.05），平均上調(diào)2.4 倍，不同的菌種，上升的幅度有差異。PrtB 的表達(dá)量在添加酪蛋白胨時(shí)顯著下調(diào)，平均 下調(diào)4.1 倍。隨著初始pH 的提高，PrtB 在LB08006、LB08007、LB08012 和LB08016 中 表 達(dá)量上調(diào)。在LB08016 中，PrtB 上升幅度最為顯著，上調(diào)10.0 倍；在LB08014 和LB08017 中，PrtB 的表達(dá)量隨pH 值的升高顯著下調(diào)；在LB08015 中，PrtB 的表達(dá)隨著pH 值的升高而下降。在45 ℃條件下PrtB 的表達(dá)量與對(duì)照組（30 ℃下）相比顯著下降（P<0.05）。