正交實驗法優(yōu)化黃芩中總黃酮的提取工藝

江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇 淮安 223001

黃芩是唇形科植物黃芩的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，主要用于治療濕熱痞滿、瀉痢、黃疸、肺熱咳嗽、高熱煩渴、瘡毒、胎動不安等癥[1]。黃芩中含有的成分為黃酮類、萜類、揮發(fā)油等化合物[2-4]，其中主要活性成分為黃酮類化合物。研究顯示黃酮類化合物具有抗菌、抗病毒、神經(jīng)及肝臟保護(hù)等作用[5]?；诖?，本實驗采用正交實驗法，以總黃酮得率為考察指標(biāo)，對黃芩總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 黃芩(淮安廣濟(jì)大藥房)；蘆丁 98%(南京廣潤生物制品有限公司)；亞硝酸鈉(萊陽市康德化工有限公司)；結(jié)晶三氯化鋁(天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鈉(上海實意化學(xué)試劑有限公司)；無水乙醇(萊陽市康德化工有限公司)。

1.2 儀器 子華牌循環(huán)水真空泵(鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司)；T6型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；ME203E型分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠)；SY5200-D型超聲波清洗機(jī)(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司)。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱定蘆丁對照品，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解并定容，得到0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取0.2 mg/mL濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40 mL，分別置于5mL EP管中，各加體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇至2.4 mL，加5%的亞硝酸鈉0.24 mL，搖勻靜置6 min，加10%的硝酸鋁溶液0.24 mL，混勻后放置5 min，加1 mol/L的氫氧化鈉0.8 mL，再加70%的乙醇0.32 mL，于510 nm波長處測量吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，以蘆丁濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 供試品溶液的配制及總黃酮得率的測定 黃芩藥材粉碎，精密稱取不同重量的黃芩，再按不同的料液比加入一定量的乙醇，在不同的提取時間和提取次數(shù)的條件下分別進(jìn)行加熱回流提取，離心，過濾。所得濾液置于250mL容量瓶中，冷卻，用相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇定容，搖勻，即得樣品溶液。按“2.1”項方法操作，加5%的亞硝酸鈉0.24 mL，搖勻靜置6 min，加10%的硝酸鋁溶液0.24 mL，混勻放置5 min，加1mol/L的氫氧化鈉0.8 mL，再加70%的乙醇0.32 mL，于510 nm波長處測量吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求出黃芩提取液中總黃酮的得率。

2.3 正交實驗因素水平表 由于黃芩中的主要有效成分是黃酮類化合物，難溶于水而易溶于有機(jī)溶劑。根據(jù)工藝要求，選擇料液比、乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時間4個主要因素，以總黃酮得率作為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗，因素水平表，見表1。

表1 正交實驗法因素水平表

2.4 驗證性實驗 稱取同一批黃芩粉末3份，按上述正交實驗最佳優(yōu)化工藝條件進(jìn)行加熱回流提取，按“2.2”項方法操作測定黃芩總黃酮的得率。

3 結(jié)果

3.1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線 回歸處理后得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.005X+0.0884，其中相關(guān)系數(shù)R2=0.9981，表明蘆丁濃度在0～200 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.2 正交實驗 正交實驗設(shè)計結(jié)果和極差分析結(jié)果分別見表2和表3。由表3可得，D的極差R最大，其次是B、A、C。極差越大，該因素對得率的影響程度越高。因此，在采用乙醇回流提取法時，以總黃酮的得率為指標(biāo)，4個因素對總黃酮得率的主次影響順序為：D>B>A>C，即提取次數(shù)>料液比>乙醇濃度>提取時間。從各因素水平看(K值分析)，A因素為K2>K3>K1，B因素為K1>K2>K3，C因素為K3>K2>K1，D因素為K3>K2>K1。由上述分析可以確定最佳提取工藝條件為A2B1C3D3，即乙醇濃度70%，料液比為1∶9，提取時間為3 h，提取次數(shù)為4次。

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

表3 極差結(jié)果分析

注：表中Ki值為在各水平因素下總黃酮含量的平均值，R為極差，即平均值的最大值和最小值的差值。

3.3 驗證性實驗 按照得出的最佳提取條件A2B1C3D3，即以70%乙醇，料液比1∶9，回流提取4次，每次3 h進(jìn)行提取，3次總黃酮得率分別為6.51%、7.19%、6.76%，表明該方法穩(wěn)定可行，適合黃芩總黃酮的提取。

4 討論

黃芩中黃酮類物質(zhì)屬于中等極性物質(zhì)，易溶于有機(jī)溶劑，而難溶于水。本實驗選用含水乙醇作為提取溶劑，以總黃酮得率為評價指標(biāo)，采用正交實驗法優(yōu)化黃芩中總黃酮的提取工藝條件，得到70%乙醇，料液比1∶9，回流提取4次，提取時間每次3 h為最佳提取條件。通過驗證實驗，證明黃芩在最佳提取條件下總黃酮得率高，提取工藝條件穩(wěn)定可靠。通過分析極差，提取次數(shù)對總黃酮含量影響最大，其次分別是料液比、乙醇濃度和提取時間。因此，在實際操作中，要綜合考慮工業(yè)生產(chǎn)和節(jié)約成本。在進(jìn)行黃芩中總黃酮的提取時，要注意各工藝參數(shù)的調(diào)控。

表4 方差分析

注釋:C矯正數(shù)=T2/9=43.82/9=208.1287

總平方和=SST=(4.152+4.562+4.682+5.892+5.002+4.722+5.562+4.932+3.792-208.1287=3.3429

SSA=(13.392+15.612+14.282)/3-C=0.83

SSB=(15.62+14.492+13.192)/3-C=0.97

SSC=(13.82+14.242+15.242)/3-C=0.36

SSD=(12.942+14.842+15.502)/3-C=1.178

誤差平方和=3.3429-0.83-0.97-0.36-1.178=0.005

F因=3-1=2

均方=SS/df

(0.42+0.49+0.18+0.59)/8=0.21

F比=MS/0.21

黃芩在臨床上應(yīng)用廣泛，其提取物保留黃芩的有效成分群，因此作為很多中成藥的原料藥。除了傳統(tǒng)意義上的抗菌、抗病毒等生物活性外，近年來對黃芩抗腫瘤活性的研究也日趨深入[6]。本實驗優(yōu)化黃芩總黃酮的提取工藝，具有很高的開發(fā)潛力。