響應(yīng)面優(yōu)化紅毛藻多糖提取工藝及抗光氧化活性

張一非，陳艷紅,2,3,4，伍 菱,2,3,4，姜澤東,2,3,4，黃高凌,2,3,4，朱艷冰,2,3,4，倪 輝,2,3,4，李清彪,2,3,4

( 1.集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021； 2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361021； 3.廈門(mén)南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361021； 4.廈門(mén)市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361021 )

紅毛藻(Bangiafusco-purpurea)又稱紅毛菜、紅發(fā)菜等，屬紅藻門(mén)、紅毛菜綱、紅毛菜目[1]，是我國(guó)東南沿海海域獨(dú)有的珍貴經(jīng)濟(jì)海藻，福建省莆田市南日島海域是其主要產(chǎn)地之一。相關(guān)研究表明，紅毛藻具有祛陰去火[2]和預(yù)防動(dòng)脈粥狀硬化[3]、心腦血管疾病[4]等食藥用功效，深受東南沿海地區(qū)人們的喜愛(ài)。研究表明，紅毛藻中總糖含量占27%[5-6]。孫惠潔[7]研究發(fā)現(xiàn)，紅毛藻多糖能夠清除DPPH自由基，表明其具有體外抗氧化活性。宋田源等[8]研究表明，紅毛藻多糖具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性，具有潛在的降血壓功效。余剛等[9]研究表明，紅毛藻多糖能夠誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7活化，釋放一氧化氮和腫瘤壞死因子，具有潛在的免疫誘導(dǎo)活性。這些有益的生物活性使紅毛藻多糖在生物醫(yī)藥、特殊膳食食品、功能性食品等領(lǐng)域具有的良好的應(yīng)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景。

目前，多糖的分離一般采用沉淀法，利用大多數(shù)多糖在有機(jī)溶劑中的溶解度小的原理，向提取液中加入陽(yáng)離子表面活性劑如乙醇或季胺鹽類等，使水溶性多糖沉淀析出，但其特異性不高[7]。劉艷芳等[10]通過(guò)酶法輔助對(duì)毛頭鬼傘(Coprinuscomatus)子實(shí)體粗多糖提取工藝進(jìn)行改良，使其提取率得到顯著提高；劉啟順等[11]篩選出纖維素酶、果膠酶和蛋白酶3種酶高效提取小球藻(Chorella)藻渣多糖，并采用正交試驗(yàn)對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化，使提取率得到顯著提高。目前，關(guān)于紅毛藻多糖提取工藝的研究鮮有報(bào)道。孫惠潔等[7]用物理方法(超聲輔助提取法)優(yōu)化了提取工藝，使紅毛藻粗多糖提取率相比熱水浸提法提高了38.39%。纖維素和果膠是細(xì)胞壁的主要成分，也是阻礙紅毛藻細(xì)胞間質(zhì)和胞內(nèi)大分子物質(zhì)溶出的主要因素，利用纖維素酶、果膠酶水解細(xì)胞壁可降低這種阻礙作用[12]。據(jù)此，本研究利用纖維素酶、果膠酶輔助提取紅毛藻多糖，在考察不同酶和各工藝參數(shù)對(duì)多糖提取率影響的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶法輔助提取紅毛藻多糖的工藝，為其規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。此外，基于前期研究發(fā)現(xiàn)，紅毛藻多糖具有潛在的抗氧化活性[7]，在本研究中進(jìn)一步利用人皮膚成纖維細(xì)胞抗光氧化模型分析其抗紫外損傷活性，為紅毛藻多糖在抗紫外損傷生物醫(yī)學(xué)敷料和護(hù)膚品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮紅毛藻采集于福建莆田市南日島海域；纖維素酶(來(lái)源于黑曲霉)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，果膠酶(來(lái)源于黑曲霉)，100X青鏈雙抗溶液(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，人皮膚成纖維細(xì)胞(上海素爾生物科技有限公司)，胎牛血清(FBS)(中國(guó)睿鉑賽生物科技公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；無(wú)水乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設(shè)備

振蕩培養(yǎng)箱(ZQZY-CF，上海知楚儀器有限公司)，高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(FW80，天津市泰斯特儀器有限公司)，pH酸度計(jì)(FE20/EL20，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司)，F(xiàn)ree Zone 6 plus真空冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Labconco公司)，BioTek Cytation-5細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)伯騰儀器有限公司)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 酶法輔助提取紅毛藻多糖

紅毛藻經(jīng)水洗凈、烘干、打粉、過(guò)篩后得紅毛藻粉末。按料液比1∶20(m/V)將紅毛藻藻粉與水混勻[13]，加入纖維素酶(或果膠酶)(纖維素酶：2.00 U/mL；果膠酶：0.22 U/mL)，于45 ℃水浴鍋中酶解90 min。酶解液經(jīng)熱水(100 ℃)抽提2.0 h，冷卻到室溫，4000 r/min離心20 min棄藻渣。加入3倍體積乙醇攪拌，靜置過(guò)夜，4000 r/min離心20 min，收集沉淀產(chǎn)物透析，冷凍干燥得紅毛藻多糖。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

固定條件：酶活性為纖維素酶，2.00 U/mL(或果膠酶，0.22 U/mL)[14]；酶解溫度50 ℃(果膠酶為45 ℃)；酶解時(shí)間2.0 h(果膠酶為1.2 h)；酶解pH為8.0(果膠酶為8.0)。改變單一因素，考察酶解pH、纖維素(果膠酶)酶活性、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)紅毛藻多糖提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果取3次重復(fù)的平均值。按下式計(jì)算提取率：

提取率/%=m1/m×100%

式中，m1為紅毛藻多糖粉末質(zhì)量(g)，m為紅毛藻粉末質(zhì)量(g)。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取三因素三水平試驗(yàn)表1～2，利用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行工藝條件優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果取3次重復(fù)的平均值。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平(纖維素酶)

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平(果膠酶)

1.4 紅毛藻多糖的抗光氧化損傷活性分析

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人皮膚成纖維細(xì)胞采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[9]。

試驗(yàn)組：不同質(zhì)量濃度(0、1、10、20、100、200 μg/mL)的紅毛藻多糖；空白組：生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

試驗(yàn)組1與空白組1不經(jīng)紫外線輻照，用于多糖對(duì)細(xì)胞活力影響的分析。

試驗(yàn)組2與空白組2經(jīng)過(guò)紫外線輻照20 min，輻照強(qiáng)度16.20 J/cm2，用于抗光氧化活性分析。

對(duì)照組：生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，不經(jīng)紫外線照射。

1.4.2 紅毛藻多糖對(duì)細(xì)胞活力影響及抗光氧化損傷活性分析

通過(guò)噻唑藍(lán)法[15]測(cè)定紅毛藻多糖對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞活力的影響。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期的人皮膚成纖維細(xì)胞以3×104個(gè)/mL的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，用不同質(zhì)量濃度的多糖樣品溶液(0～200 μg/mL)孵育2.0 h，除去上清液后，每孔加入終含量為5%的噻唑藍(lán)—磷酸鹽緩沖溶液50 μL，繼續(xù)孵育30 min，移去上清液后，加入100 μL的二甲基亞砜，振蕩20 min，于Cytation-5細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量570 nm處吸光值(OD570)。按下式計(jì)算細(xì)胞活力。

式中，V為細(xì)胞活力，A為試驗(yàn)組OD570，B為空白組OD570，C為對(duì)照組OD570。

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素對(duì)紅毛藻多糖提取率的影響

2.1.1 pH的影響

酶解pH對(duì)紅毛藻多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。pH為6.0～9.0時(shí)，隨著pH的升高，纖維素酶輔助提取紅毛藻多糖的提取率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，在pH為10.0時(shí)略有提高；果膠酶處理的紅毛藻多糖提取率隨pH的增大無(wú)顯著變化，在pH為6.0時(shí)，提取率高于其他試驗(yàn)組且二者提取率接近。綜上，將pH=6.0選為固定因素。

圖1 pH對(duì)紅毛藻多糖提取率的影響

2.1.2 酶活性的影響

纖維素酶和果膠酶的酶活性對(duì)紅毛藻多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。纖維素酶活性在0～2.50 U/mL時(shí)，隨酶活性增大，提取率升高，在酶活性達(dá)到2.50 U/mL時(shí)，提取率最高可達(dá)11.45%，活性超過(guò)2.50 U/mL時(shí)，提取率下降(圖2a)；果膠酶處理曲線趨勢(shì)與纖維素酶相似，果膠酶活性在0.165 U/mL時(shí)的提取率最高，達(dá)到10.35%(圖2b)。這是由于纖維素和果膠作為細(xì)胞壁的主要成分，在該反應(yīng)體系中兩種酶分別水解紅毛藻細(xì)胞壁中的纖維素和果膠，僅使細(xì)胞壁被水解，而酶的活性升高可以使酶與藻粉的接觸更充分，提升水解效率，由于底物與酶結(jié)合的位點(diǎn)有限[16]，當(dāng)酶活性過(guò)高時(shí)，底物質(zhì)量濃度不夠則會(huì)造成酶的浪費(fèi)，故最佳的纖維素酶活性為2.50 U/mL，果膠酶活性為0.165 U/mL，且果膠酶催化效率高于纖維素酶。

2.1.3 酶解時(shí)間的影響

酶解時(shí)間對(duì)紅毛藻多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。隨著酶解時(shí)間的增加，提取率均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，而纖維素酶最佳酶解時(shí)間為100 min，果膠酶的最佳酶解時(shí)間為80 min。這是由于隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞壁的纖維素或果膠成分逐漸被水解，多糖逐漸溶出，但由于纖維素酶和果膠酶也可水解紅毛藻多糖中的糖苷鍵，導(dǎo)致分解作用加劇，提取率在接下來(lái)的一段時(shí)間內(nèi)稍有下降[17]。

圖2 纖維素酶活性(a)和果膠酶活性(b)對(duì)紅毛藻多糖提取率的影響

圖3 酶解時(shí)間對(duì)紅毛藻多糖提取率的影響

2.1.4 酶解溫度的影響

酶解溫度對(duì)紅毛藻多糖提取率的影響見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，隨著酶解溫度的升高，提取率逐漸上升后突然下降，這是由于纖維素酶和果膠酶都存在一個(gè)最適溫度即酶活性最高時(shí)的溫度，在此溫度下酶的催化效率最高，當(dāng)溫度較高時(shí)酶的穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致了酶活性下降，作用效率下降[16]。纖維素酶的適宜溫度為45～65 ℃，果膠酶的適宜溫度為20～70 ℃，以50 ℃效果最好，這與文獻(xiàn)[18]利用果膠酶酶解果汁得到的優(yōu)化結(jié)果一致。

圖4 酶解溫度對(duì)紅毛藻多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 中心組合試驗(yàn)結(jié)果

考慮pH對(duì)紅毛藻多糖水解的影響，故通過(guò)單因素試驗(yàn)選取pH=6.0作為固定因素，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[19-21]，選取的主要因素有酶解溫度、酶解時(shí)間和酶活性，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)點(diǎn)共17個(gè)，其中分析因子12個(gè)，以及用于估計(jì)誤差的零點(diǎn)5個(gè)[22]。以紅毛藻多糖提取率作為響應(yīng)值，進(jìn)行酶輔助提取紅毛藻多糖的工藝條件優(yōu)化，試驗(yàn)方案及紅毛藻多糖提取率見(jiàn)表3、4。

2.2.2 模型方差分析結(jié)果

根據(jù)表1、2的因素水平選取，參考表3、4結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.5軟件分析，結(jié)果見(jiàn)表5、6。由表5、6可見(jiàn)，兩種酶試驗(yàn)所選模型均極顯著(P<0.01)，且果膠酶模型的純誤差不顯著，纖維素酶模型的純誤差顯著(失擬項(xiàng)P纖維素酶=0.0403，失擬項(xiàng)P果膠酶= 0.9262)，纖維素酶模型擬合結(jié)果不理想。纖維素酶試驗(yàn)中一次項(xiàng)中酶解時(shí)間(B)對(duì)紅毛藻多糖提取率影響最大；二次項(xiàng)中3個(gè)因素對(duì)紅毛藻多糖提取率影響皆極顯著(P<0.01)；交互項(xiàng)中兩兩無(wú)顯著影響，擬合效果不理想。果膠酶試驗(yàn)一次項(xiàng)中酶解溫度(A)對(duì)紅毛藻多糖提取率影響較大，達(dá)顯著水平(P<0.05)；二次項(xiàng)中酶解溫度(A)、酶解時(shí)間(B)和酶活性(C)對(duì)紅毛藻多糖提取率影響均極顯著(P<0.01)；交互項(xiàng)AC之間具有顯著影響(P<0.05)。由此可知，響應(yīng)值受各因素的影響并非線性關(guān)系，其影響程度為酶解溫度>酶解時(shí)間>酶活性。采用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)表5、6的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得如下回歸方程：

Y纖維素酶=16.97+0.076A-0.55B+0.21C-0.51AB+0.38AC-0.11BC-4.65A2-4.84B2-3.68C2

Y果膠酶=16.72+0.37A-0.08B-0.067C+0.088AB-0.50AC+0.022BC-4.99A2-3.65B2-4.55C2

表3 纖維素酶Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 果膠酶Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 纖維素酶回歸模型方差分析

注：*顯著影響(P<0.05)；**極顯著影響(P<0.01).下同.

表6 果膠酶回歸模型方差分析

2.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

響應(yīng)曲面三維圖可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度和因素間的交互作用強(qiáng)弱。等高線的形狀反映出交互作用影響效應(yīng)的強(qiáng)弱與大小[24]。

纖維素酶輔助提取多糖的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖5，其優(yōu)化效果不明顯，三因素之間的兩兩交互作用弱，故纖維素酶對(duì)紅毛藻多糖提取的作用效果較差，以上結(jié)果與表5回歸方程方差分析結(jié)果一致。

由圖6等高線可見(jiàn)，當(dāng)固定其中一個(gè)因素，提取率都會(huì)隨另一因素的增大而增大，但增大到一個(gè)峰值后又開(kāi)始緩慢下降[25]。固定酶活性為0.22 U/mL時(shí)，酶解溫度(A)和酶解時(shí)間的(B)交互作用對(duì)紅毛藻多糖提取率的影響與上文描述一致。響應(yīng)面發(fā)生了彎曲，表明果膠酶活性(C)與酶解時(shí)間(B)對(duì)紅毛藻多糖的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。比較圖6a、c，發(fā)現(xiàn)酶解溫度(A)與酶活性(C)的交互作用對(duì)多糖提取率的影響顯著。由3D等高線圖(圖6d)可見(jiàn)，酶解時(shí)間(B)對(duì)紅毛藻多糖提取率的影響大于酶活性(C)的影響，兩個(gè)因素的交互作用不顯著。以上結(jié)果與表5回歸方程方差分析結(jié)果一致。

圖5 纖維素酶輔助提取紅毛藻多糖的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果a.纖維素酶酶解溫度和時(shí)間對(duì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖； b.纖維素酶酶解溫度和時(shí)間對(duì)提取率影響的等高線圖； c.纖維素酶酶解溫度和酶活性對(duì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖； d.纖維素酶酶解溫度和酶活性對(duì)提取率影響的等高線圖； e.纖維素酶酶解時(shí)間和酶活性對(duì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖； f.纖維素酶酶解時(shí)間和酶活性對(duì)提取率影響的等高線圖.

圖6 果膠酶輔助提取紅毛藻多糖的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果a.果膠酶酶解溫度和時(shí)間對(duì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖； b.果膠酶酶解溫度和時(shí)間對(duì)提取率影響的等高線圖； c.果膠酶酶解溫度和酶活性對(duì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖； d.果膠酶酶解溫度和酶活性對(duì)提取率影響的等高線圖； e.果膠酶酶解時(shí)間和酶活性對(duì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖； f.果膠酶酶解時(shí)間和酶活性對(duì)提取率影響的等高線圖.

2.2.4 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

用Design-Expert 8.0.5軟件分析得出的最佳工藝為：選用果膠酶，酶活性0.22 U/mL、酶解時(shí)間99.78 min、酶解溫度50.19 ℃。該條件下紅毛藻多糖的最高提取率為16.72%。根據(jù)實(shí)際操作調(diào)整酶解時(shí)間為100 min，酶解溫度為50 ℃，酶活性為0.22 U/mL，與中心組合試驗(yàn)的零點(diǎn)試驗(yàn)條件一致，得紅毛藻多糖提取率為(16.60±0.13)%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差較小，表明回歸模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合程度高，回歸方程能真實(shí)地反映酶解時(shí)間、酶解溫度、酶活性對(duì)提取率的影響，該模型有可行性。

2.2.5 紅毛藻多糖毒性及抗氧化活性

以未照射紫外線并且未添加紅毛藻多糖的細(xì)胞活力為100%，在測(cè)試多糖質(zhì)量濃度為1～100 μg/mL時(shí)，隨著多糖質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞活力無(wú)顯著變化，表明多糖質(zhì)量濃度為1～100 μg/mL時(shí)，對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞無(wú)顯著毒性作用，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞活力產(chǎn)生抑制作用(圖7a)。參考文獻(xiàn)[26]試驗(yàn)方法，16.20 J/cm2輻射20 min后人皮膚成纖維細(xì)胞活力為56.26%，接近50%。隨著多糖質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞活力逐漸上升，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為10～20 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力可恢復(fù)至96.53%～98.49%，表明紅毛藻多糖具有抵抗人皮膚細(xì)胞光氧化紫外線損傷的能力，且多糖質(zhì)量濃度為10～20 μg/mL時(shí)效果最佳(圖7b)。

圖7 不同質(zhì)量濃度的紅毛藻多糖對(duì)細(xì)胞毒性的影響(a)和對(duì)細(xì)胞抗光氧化活力的影響(b)不同字母表示差異顯著(P<0.05).

3 討 論

3.1 紅毛藻多糖的提取工藝研究

近年來(lái)，隨著海藻多糖優(yōu)良的理化性質(zhì)(如凝膠、乳化、保濕)和有益生物活性的逐漸發(fā)掘，海藻多糖被廣泛應(yīng)用于食品、生物醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域，因此對(duì)多糖的高效提取工藝的研究與開(kāi)發(fā)越來(lái)越受到關(guān)注。海藻多糖的提取通常采用機(jī)械粉碎藻體，對(duì)得到的藻粉中的多糖類物質(zhì)進(jìn)行熱水抽提，繼而通過(guò)利用多糖在有機(jī)溶劑中的溶解度小的原理，向抽提液中加入乙醇或季胺鹽類等使多糖沉淀析出[7]。為提高多糖提取率，Rodriguez-Jasso等[27]利用微波提取法自褐藻中提取硫酸酯化多糖，與原始方法相比提取率提高了31.01%。孫惠潔[7]利用超聲波輔助提取法提取紅毛藻多糖的提取率為9.69%，比用熱水提取紅毛藻多糖的提取率高38.39%。周峙苗[28]利用纖維素酶輔助提取羊棲菜(Sargassumfusiforme)多糖，是熱水浸提工藝的粗多糖得率的2.2倍，使其提取效率顯著提高。纖維素和果膠是海藻細(xì)胞壁的主要成分，也是海藻細(xì)胞間質(zhì)和胞內(nèi)大分子物質(zhì)溶出的主要屏障。因此，本研究分別利用纖維素酶和果膠酶輔助提取紅毛藻多糖，經(jīng)正交法考察各工藝參數(shù)以及響應(yīng)面法優(yōu)化紅毛藻多糖的酶解工藝，由于纖維素酶提取效果不理想，選出果膠酶進(jìn)行輔助提取，模擬得到最佳提取工藝為pH 6.0、酶活性0.22 U/mL、酶解時(shí)間100 min、酶解溫度50 ℃，試驗(yàn)結(jié)果與熱水浸提法相比提升了64.04%，與孫惠潔[7]利用物理方法輔助提取紅毛藻多糖的提取率相比提升了41.62%。

3.2 紅毛藻多糖的抗氧化生物活性

由于海藻多糖能夠有效地抑制和清除自由基，海藻多糖的抗氧化活性被廣泛研究。劉洪麗等[29]通過(guò)觀察馬尾藻(Sargassum)多糖對(duì)小鼠細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力的影響，得到馬尾藻多糖能夠有效清除羥自由基并且隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，對(duì)抗過(guò)氧化氫溶血的能力有所提高。劉亮等[30]選取紫菜(Porphyra)多糖進(jìn)行抗氧化作用研究，發(fā)現(xiàn)紫菜多糖能有效清除DPPH·和·OH，并且抑制小鼠肝組織的脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)由于Fe2+和H2O2引起的肝組織損傷。紅毛藻多糖具有潛在的降血壓和抗氧化等作用。孫惠潔[7]利用DPPH法對(duì)紅毛藻多糖的體外抗氧化進(jìn)行初步的研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)DEAE Cellulose-52得到3種紅毛藻多糖片段均具有清除DPPH自由基的活性，隨著多糖質(zhì)量濃度的升高，對(duì)DPPH自由基的清除能力顯著增強(qiáng)。本試驗(yàn)在紅毛藻多糖體外抗氧化試驗(yàn)基礎(chǔ)之上對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞抗氧化損傷研究，以紫外誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞的光氧化為模型，探究其紅毛藻多糖對(duì)細(xì)胞作用效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，10～20 μg/mL的紅毛藻多糖能夠使受到UVA損傷的人皮膚成纖維細(xì)胞活力恢復(fù)至初始狀態(tài)的96.53%～98.49%，具有極強(qiáng)的防止紫外線氧化損傷效果，因此為紅毛藻多糖在護(hù)膚品和抗紫外損傷的生物醫(yī)學(xué)敷料中的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

綜上，本試驗(yàn)優(yōu)化了紅毛藻多糖的提取工藝，并初步揭示了其具有抵抗人皮膚細(xì)胞光氧化紫外損傷的活性，研究結(jié)果為進(jìn)一步研究紅毛藻多糖抗紫外光氧化損傷奠定研究基礎(chǔ)，同時(shí)也為紅毛藻多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

研究了酶輔助提取紅毛藻多糖的最優(yōu)條件，通過(guò)單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面法優(yōu)化了紅毛藻多糖提工藝，得到如下結(jié)論：

(1)酶輔助提取紅毛藻多糖的優(yōu)化工藝條件為：選用果膠酶，pH 6、酶活性0.22 U/mL、酶解時(shí)間100 min、酶解溫度50 ℃。

(2)此優(yōu)化條件下得到紅毛藻多糖提取率為(16.60±0.13)%，與預(yù)測(cè)值(16.72%)的相對(duì)誤差在允許范圍內(nèi)(0.12%)，表明該模型擬合效果合理可靠。

(3) 紅毛藻多糖在1～100 μg/mL時(shí)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞無(wú)顯著毒性作用，紅毛藻多糖具有抵抗人皮膚成纖維細(xì)胞光氧化能力，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為10～20 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力可恢復(fù)至96.53%～98.49%。