酒鬼酒發(fā)酵車間空氣源細菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性研究

吳秋蕾，黎有有，鄧麗穎，趙 湖，郝立娟，樊 林，陳義光，張 麗

（1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南吉首 416000；2.酒鬼酒股份有限公司，湖南吉首 416000）

白酒是中國的傳統(tǒng)蒸餾酒，也是世界六大著名蒸餾酒之一。白酒的釀造原料多，工藝獨特，其濃郁的芳香和獨特的風(fēng)味特征為其他蒸餾酒所不能及[1]。酒鬼酒是中國著名的白酒品牌之一，生產(chǎn)所在地湖南省吉首市地處云貴高原余脈武陵山區(qū)中心，是亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，空氣濕潤，四季分明。酒鬼酒誕生于湘西這片神奇的土地上，在繼承湘西少數(shù)民族源遠流長民間工藝的基礎(chǔ)上，大膽創(chuàng)新，使得產(chǎn)品一問世，便以神秘而浪漫的個性文化形象被大眾認同，令人耳目一新[2]。酒鬼酒以其芳香秀雅、綿柔甘洌、醇厚細膩、后味怡暢、香味馥郁、酒體凈爽的獨特感官風(fēng)格深受廣大消費者青睞[3]。

白酒微生物指白酒生產(chǎn)過程中以及生產(chǎn)環(huán)境中的微生物的總稱。人們對白酒微生物的研究主要集中在以下幾個方面：白酒微生物的分離、純化、鑒定和保藏；白酒微生物主要菌群(酵母、細菌、霉菌)的交替演繹規(guī)律的研究以及理化分析；優(yōu)質(zhì)功能菌的選育和應(yīng)用；白酒生產(chǎn)環(huán)境中微生物的種類、數(shù)量的研究[4]。迄今為止，國內(nèi)外對白酒微生物大部分領(lǐng)域的研究已較為成熟，而對白酒生產(chǎn)環(huán)境中微生物的研究較少。酒廠發(fā)酵車間空氣中的微生物是白酒微生物的重要來源[5]。本文采用空氣自然沉降法收集酒鬼酒發(fā)酵車間空氣源細菌（含放線菌），用純培養(yǎng)法分離純化，繼而用基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析法對分離菌株進行多樣性分析，以便較深入地了解酒鬼酒發(fā)酵車間空氣來源細菌多樣性的總體情況，為解開酒鬼酒獨特香型和特殊風(fēng)味形成之謎題提供重要的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備和試劑

高壓滅菌鍋（mLS-3780，SANYO）；生物安全柜（BSC-04IIB2，蘇凈安泰）；恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9050，上海精宏）；光學(xué)顯微鏡（Moticam 2306，Motic）；冷凍干燥儀（HETOLL1500，捷克）；離心機（Centrifuge-5427R，Eppendorf）；PCR擴增儀（PE-9600，BIO-RAD）；凝膠成像儀(GeneSnap 3.0，Syn-Gene)。細菌16SrRNA基因PCR擴增所用酶、引物和試劑購自生物工程上海有限公司（Sangon Biotech）。

1.2 培養(yǎng)基

共采用以下3種培養(yǎng)基為分離和純化培養(yǎng)基，均加制霉菌素100 mg/L抑制霉菌生長，加10%酒鬼酒酒醅浸汁配制[6]，倒平板用于分離，3種培養(yǎng)基配方如下。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(nutrient agar,NA)：牛肉膏粉3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，水1000 mL，pH 7.2～7.4。

麥芽膏-酵母膏培養(yǎng)基(ISP2)：酵母膏4.0 g，葡萄糖4.0 g，麥芽膏5.0 g，微量鹽溶液1 mL，蒸餾水1000 mL，瓊脂20 g，pH7.0～7.4。

高氏Ⅰ號培養(yǎng)基（Coates'mediumⅠagar）：Na-Cl 0.5 g，可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，MgSO40.244 g，瓊脂12 g，pH 7.2～7.4。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣區(qū)簡介和樣品采集

酒鬼酒股份有限公司發(fā)酵車間群位于湖南省吉首市“酒鬼酒地理生態(tài)功能保護區(qū)”的核心位置武吉鎮(zhèn)（28°08'～28°29'N，109°30'～110°04'E），共有8個發(fā)酵車間。本研究選取第五發(fā)酵車間為采樣區(qū)，選取發(fā)酵車間室內(nèi)四角和中央?yún)^(qū)域距墻30 cm以外，高度距地面1 m左右無人員流動的范圍為采樣點，采用自然沉降法[7]收集空氣中微生物。預(yù)先制備好各種分離培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)皿底編好序號，按預(yù)設(shè)順序和采樣計劃分放到各樣點，揭去皿蓋，暴露于空氣當(dāng)中30 min。重新蓋好皿蓋，24 h內(nèi)帶回實驗室。

1.3.2 菌株分離純化和形態(tài)觀察

采樣平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，隨機挑取單菌落進行4分離劃線純化，經(jīng)過鏡檢純度后，使用牛奶管等多種形式保藏備用。根據(jù)菌落的顏色、大小、邊緣、濕潤度、透明度、與培養(yǎng)基結(jié)合程度等特征挑取培養(yǎng)皿上的單菌落進行四分體劃線純化，并做好相應(yīng)菌落特征記錄。細胞形態(tài)用光學(xué)顯微鏡進行觀察，革蘭氏反應(yīng)用革蘭氏染色法和KOH法進行[8-9]。

1.3.3 基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

16SrRNA基因PCR擴增和序列測定使用一對細菌通用引物：正向引物Primer A（對應(yīng)于E.coli的16S rDNA 5’端8-27f位 置）：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物Primer B（對應(yīng)于E.coli16S rDNA 5’端152-1504r位置）：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR擴增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共25個循環(huán)；72℃后延10 min。16S rRNA基因PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用ABI PRISMTM 377XL DNA Sequencer全自動測序儀進行測序。

將測序得到的16SrRNA基因序列提交到Gen-Bank進行注冊并獲取相應(yīng)的序列號。用National Center for Biotechnology Information網(wǎng)站(NCBI;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Ez Bio Cloud server(http://www.ezbiocloud.net/identify[10])所提供的Blast搜索程序(Basic Local Alignment Search Tool)，在GenBank/EMBL/DDBJ等公共數(shù)據(jù)庫中進行在線搜索高度相似序列，調(diào)取同源性高的相關(guān)典型菌株的16SrRNA基因序列組成序列集；運用CLUSTALX[11]軟件中的Alignment程序進行多重序列比對，根據(jù)Kimura模型[12]估算系統(tǒng)進化距離矩陣。采用MEGA 4.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)進行聚類分析和系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建[13]；以重復(fù)取樣1000次自展(bootstrap)法來評估系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[14]。

1.3.4 生物學(xué)特征測定

菌株的表型特征、生理生化特性實驗按照《常見細菌鑒定手冊》[15]所用方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

從不同培養(yǎng)基分離效果來看，NA培養(yǎng)基分離得到的菌落最多且形態(tài)相對來說較豐富，高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上菌落形成單位相對較少且菌落形態(tài)單一。根據(jù)菌落的顏色、大小、邊緣、濕潤度、透明度、與培養(yǎng)基結(jié)合程度等特征，挑取培養(yǎng)皿上的單菌落進行四分體劃線純化4次，最終從本次采集的樣品中分離到127株純培養(yǎng)物。

2.2 類群多樣性

結(jié)合菌落形態(tài)、細胞顯微形態(tài)及部分生理生化實驗結(jié)果綜合分析，去除部分冗余菌株，最終從127個分離菌株中選取72株代表性菌株進行基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析。測定了各菌株的16SrRNA基因全長，并上傳GenBank公共數(shù)據(jù)庫，獲得了相應(yīng)序列號（accession number，見表1）。在NCBI和EzBioCloud進行高度相關(guān)同源序列在線搜索和相似性計算，結(jié)果如表1所示。

從分析結(jié)果可以看出，72株代表性菌株屬于細菌域的4個門(phylum)(Actinobacteria,Deinococcus-Thermus,Firmicutes,Proteobacteria)、17個 科(Aurantimonadaceae,Bacillaceae,Bacillales Family XII,Corynebacteriaceae,Deinococcaceae,Intrasporangiaceae,Microbacteriaceae,Moraxellaceae,Nocardiaceae,Planococcaceae,Propionibacteriaceae,Pseudomonadaceae,Rhizobiaceae,Rhodobacteraceae,Sphingomonadaceae,Staphylococcaceae Xanthomonadaceae)、24個屬(Acinetobacter,Agrococcus,Arsenicicoccus,Arthrobacter,Aurantimonas,Bacillus,Corynebacterium,Deinococcus,Exiguobacterium,Janibacter,Kocuria,Luteococcus,Microbacterium,Micrococcus,Paracoccus,Pararhodobacter,Pseudomonas,Rhodococcus,Shinella,Sphingomonas,Sporosarcina,Staphylococcus,Virgibacillus,Xanthomonas)。多數(shù)菌屬于Actinobacteria門（34株，47.22%），其中Micrococcaceae為優(yōu)勢科，含15株菌株；其次是Proteobacteria門（24株，33.33%）和Firmicutes門（11株，15.28%），還分離到3株屬于分類名稱尚未確定且目前根據(jù)《伯杰氏細菌手冊》暫稱為異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)的細菌。

2.3 物種與遺傳多樣性

按16SrRNA基因序列相似性小于97%的菌株屬于不同物種的歸類原則計[16]，分離自酒鬼酒發(fā)酵車間空氣樣品中的72株代表性菌株可以歸為53個物種（表1）。由表1可知，酒鬼酒發(fā)酵車間空氣樣品中可培養(yǎng)細菌具有較高的物種多樣性。除了4株（JSM 2215012、JSM 2215069、JSM 2215076、JSM 2215097）分別與其相關(guān)的有效發(fā)表已知物種的典型菌株的16SrRNA基因序列相似性為100%外，其他的分離菌株與其相關(guān)的已知物種的典型菌株的16S rRNA基因序列相似性在96.37%～99.88%之間，說明大部分分離菌株與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切的典型菌株之間存在較大的遺傳差異。

在這72株代表性菌株中，其中至少有5株（JSM 2215019、JSM 2215034、JSM 2215039、JSM 2215042和JSM 2215109）與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切的已知物種的典型菌株的16SrRNA基因序列存在較大的差異，可能代表新的分類單元（potential new taxa）?；谶@些菌株和與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切的典型菌株的16SrRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹見圖1。其中JSM 2215034和JSM 2215109的16SrRNA基因序列與已知物種的典型菌株差異較大，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近的典型菌株是Corynebacterium caseiLMG S-19264T和Deinococcus grandisDSM 3963T（圖1），它 們 之 間 的16S rRNA基因序列相似性分別為96.43%和96.37%，可能代表了Corynebacterium屬和Deinococcus屬的新物種。菌株JSM 2215019、JSM 2215039和JSM 2215042分別與Sphingomonas panniC52T、Arthrobacter agilisDSM 20550T和Paracoccus aestuariiB7T的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切（圖1）。雖然這3株菌株與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切的典型菌株之間的16S rRNA基因序列相似性均高于97%（分別為97.24%、97.39%、97.25%），但是它們在表型特征上與各自相關(guān)的典型菌株卻存在一定的差異，且它們在系統(tǒng)進化樹上各自形成了獨立亞分支，可能分別代表Sphingomonas，Arthrobacter，Paracoccus屬的3個潛在新種（potential novel species）。

然而最終確定這些菌株的分類地位，還需要綜合分析其形態(tài)特征、細胞化學(xué)特征、生理生化特征以及與其相對應(yīng)的相關(guān)典型菌株基因組間的DNA-DNA同源性分析等多相分類(polyphasic taxonomy)研究結(jié)果才可下定論，這些多相分類工作正在進行中，這些菌株部分生理生化特征見表2。

3 討論

本研究采用純培養(yǎng)法和基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析對分離自酒鬼酒發(fā)酵車間空氣樣品中的可培養(yǎng)細菌的多樣性進行了研究。用于系統(tǒng)發(fā)育分析的72株菌分別歸屬于細菌域的4個門、17個科、24個屬。按16SrRNA基因序列相似性大于97%的菌株屬于同一物種的歸類原則計，這72株代表性菌株可以歸為53個物種。大部分的分離菌株與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切的已知物種典型菌株之間的16SrRNA基因序列都具有較大的遺傳差異，除了4株(JSM 2215012、JSM 2215069、JSM 2215076、JSM 2215097)分別與其相關(guān)的有效發(fā)表已知物種的典型菌株的16SrRNA基因序列相似性為100%外，其他的分離菌株與其相關(guān)的已知物種的典型菌株的16S rRNA基因序列相似性在96.37%～99.88%之間，其中有5株(JSM 2215019、JSM 2215034、JSM 2215039、JSM 2215042和JSM 2215109)菌株分別代表Sphingomonas,Corynebacterium,Arthrobacter,Paracoccus和Deinococcus屬的潛在新種。這些結(jié)果均表明了酒鬼酒發(fā)酵車間空氣樣品中存在較高的類群多樣性。

表1 分離菌株與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切的典型菌株間的發(fā)育關(guān)系

圖1 基于16SrRNA基因序列構(gòu)建的5個代表潛在新類群菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 潛在新類群代表5菌株的部分生理生化特征

據(jù)相關(guān)文獻報道，白酒生產(chǎn)過程中發(fā)酵后釀造微生物細菌優(yōu)勢菌為芽孢桿菌屬[17-20]，而本研究的72株分離自酒鬼酒發(fā)酵車間空氣樣品中可培養(yǎng)細菌代表性菌株中也存在一定數(shù)量的革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢菌（6株，其中Bacillaceae科5株，Bacillales Family XII科1株），但本研究成果表明發(fā)酵車間空氣樣品可培養(yǎng)細菌中優(yōu)勢菌為非芽孢菌（66株；91.67%），其中占優(yōu)勢的是34株放線菌門（Actinobacteria）和24株變形菌門（Proteobacteria）菌株（表1）。其中異常球菌-棲熱菌門包括一些能抵抗高劑量輻射、耐熱等在各種嚴(yán)酷逆境環(huán)境中生存的球狀細菌，它們有著極強的生存能力[21]。而在酒鬼酒發(fā)酵車間空氣分離到的這3株異常球菌-棲熱菌門菌株，是否表明酒鬼酒發(fā)酵過程中高溫產(chǎn)酒環(huán)境微生物主要來源于發(fā)酵車間空氣中的微生物，是否對酒鬼酒發(fā)酵過程中高溫產(chǎn)酒環(huán)境耐熱機制起到一定的作用，探究其適應(yīng)高溫環(huán)境的耐熱機理，分布規(guī)律與來源等課題值得深入研究。