熒光量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究進(jìn)展

高勇 郭艷 安維 韓亞麗 張娟麗

摘要：熒光量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)作為熒光標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域的最為先進(jìn)的技術(shù)，因其無放射污染性、低細(xì)胞毒性以及檢測(cè)技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究中的不可或缺的手段和技術(shù)。本文從各類熒光量子點(diǎn)制備、表面功能化方面的最新技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)論述，對(duì)其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的如細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)追蹤、生物組織成像、疾病早期診斷等方面的研究趨勢(shì)和應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

Abstract： Fluorescent quantum dot labeling technology， as the most advanced technology in the field of fluorescent labeling technology， has become an indispensable means and technology in the research of modern biomedicine because of its advantages of no radioactive contamination， low cytotoxicity and mature detection technology. In this paper， the latest technologies in various quantum dot preparation and surface functionalization are discussed in detail， and the research trends and application prospects in the field of biomedicine， such as intracellular and extracellular material tracking， biological tissue imaging， early disease diagnosis， etc.， are prospected.

關(guān)鍵詞：熒光標(biāo)記;量子點(diǎn);生物醫(yī)藥;應(yīng)用研究

Key words： fluorescent labeling;quantum dots;biomedical;application research

中圖分類號(hào)：Q503 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：1006-4311（2019）30-0280-03

0 ?引言

熒光標(biāo)記技術(shù)與放射性物質(zhì)標(biāo)記、發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記、生物酶標(biāo)記技術(shù)一并被稱為應(yīng)用分析標(biāo)記技術(shù)，由于其無放射性污染、低細(xì)胞毒性以及檢測(cè)方法成熟可靠等突出優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究中的不可或缺的手段和技術(shù)。

熒光量子點(diǎn)（Quantum Dots）[1]作為無機(jī)熒光材料的典型代表，屬于人工制備納米半導(dǎo)體材料，粒徑范圍在1-20nm之間，可依據(jù)其粒徑的大小具備不同的熒光顏色，常見的類型如 II-VI 類（Cd Te、Cd Se、Cd S），II-V類（In P、 In As），I-III-VI2 類（Cu In S2、Ag In S2）和 IV-VI 類（Pb Se）。這些量子點(diǎn)在各種醫(yī)學(xué)應(yīng)用如生物成像，生物信息的傳感和藥物的遞送等眾多的應(yīng)用中發(fā)揮著非常重要的作用。

熒光量子點(diǎn)是近年來被廣泛研究的熒光標(biāo)記探針技術(shù)，相對(duì)于熒光素類、羅丹明類常見有機(jī)熒光標(biāo)記分子，其接受激發(fā)波長(zhǎng)范圍寬，并且產(chǎn)生發(fā)射波長(zhǎng)分布窄，可以實(shí)現(xiàn)一種激發(fā)波長(zhǎng)同時(shí)激發(fā)多種不同粒徑和材質(zhì)的多種量子點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)多種標(biāo)志物的同時(shí)監(jiān)測(cè)，并具有較強(qiáng)的抗光譜漂白能力;由于是穩(wěn)定合成的化學(xué)納米物質(zhì)，其光源穩(wěn)定性好，不易產(chǎn)生熒光淬滅，穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng);可供選擇的低細(xì)胞毒性、高生物相容性量子點(diǎn)逐漸被發(fā)現(xiàn)，能夠進(jìn)行體內(nèi)成像的研究;其生物標(biāo)記方法，可通過其表面的多種化學(xué)基團(tuán)，進(jìn)行生物分子如特異性抗體的標(biāo)記和示蹤。

1 ?熒光量子點(diǎn)的制備

量子點(diǎn)的合成研究是關(guān)于量子點(diǎn)研究的重要內(nèi)容，具有基礎(chǔ)性的地位，一直以來受到國內(nèi)外研究者的重視。目前熒光量子點(diǎn)制備主要分為有機(jī)相合成和水相合成兩大類。另外，近年來生物合成方法也被逐漸的開發(fā)出來。

1.1 有機(jī)相合成

1993年Bawendi[2]出現(xiàn)了一種新的合成方法：“金屬有機(jī)-配位溶劑-高溫”路線，以TOPO和TOP為溶劑、以Cd（Et）2和S（Se、Te）反應(yīng)前驅(qū)體，高溫情況下，向含有Cd（Et）2的TOPO溶液注入S（或Se、Te）的TOP溶液，使其高溫下成核生長(zhǎng)。該合成方法形貌可控，發(fā)光效率高，但是高溫，Cd（Et）2劇毒，不穩(wěn)定，成本高，容易爆炸等缺點(diǎn)限制了其應(yīng)用。Peng[3]在前人的研究的基礎(chǔ)上，從基本的化學(xué)知識(shí)出發(fā)，找到了控制合成的關(guān)鍵因素，主要是針對(duì)Cd（Et）2的劇毒，不穩(wěn)定，合成條件苛刻等方面進(jìn)行了創(chuàng)新研究。最新的制備可以在非極性溶液中對(duì)其形貌生長(zhǎng)進(jìn)行精確控制，以合成應(yīng)用最為廣泛的量子點(diǎn)。

1.2 水相合成

水相合成的量子點(diǎn)具有無毒性和優(yōu)越的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，Weller[4]研究了引入巰基小分子束縛量子點(diǎn)的生長(zhǎng)，在水相中合成CdTe量子點(diǎn)。董紹俊[5]使用Na2TeO3作為Te源，將其和Cd2+、配體分子、NaBH4加熱回流，得到高質(zhì)量的CdTe量子點(diǎn)。2014年，Wu等[6]水相制備CdTe 量子點(diǎn)，并進(jìn)行蛋白修飾。

1.3 生物合成

利用各種生物體進(jìn)行熒光量子點(diǎn)的胞內(nèi)外合成是近幾年量子點(diǎn)合成一個(gè)研究熱點(diǎn)，2009年pang[7]等提出了全新的“時(shí)-空耦合調(diào)控活細(xì)胞合成策略”，開啟生物合成的先河。目前硫族量子點(diǎn)CdS在生物合成方面研究的最為深入[8]?？晒┥锖铣傻牧孔狱c(diǎn)微生物有細(xì)菌（大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、光合細(xì)菌沼澤紅假單胞菌等），真菌（酵母）等。2015年，Borovaya等[9]首次證實(shí)擔(dān)子真菌系統(tǒng)合成硫化鎘量子點(diǎn)的可能。另外在其他生物機(jī)體如放線菌、藍(lán)藻、植物（番茄毛根等）、病毒（煙草花葉病毒等）、動(dòng)物（蚯蚓）也被發(fā)現(xiàn)可以用來合成量子點(diǎn)[12]。但是這類方法合成的量子點(diǎn)種類有限，且發(fā)光效率不高，以及產(chǎn)能的制約等不足，目前無法大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用。

在上述化學(xué)和生物合成的方法基礎(chǔ)上，量子點(diǎn)制備技術(shù)不斷進(jìn)步，多元素、多材料的復(fù)合結(jié)構(gòu)使得量子點(diǎn)的發(fā)光性質(zhì)更加穩(wěn)定，應(yīng)用更加的廣泛。

2 ?熒光量子點(diǎn)的功能化和標(biāo)記

熒光量子點(diǎn)的功能化主要是對(duì)量子點(diǎn)表面進(jìn)行一系列的修飾，使得可以和生物大分子等物質(zhì)連接，進(jìn)一步在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用。針對(duì)表面修飾基本策略是兩個(gè)：第一個(gè)是包裹，在表面包裹上親水性物質(zhì)，使其親水;第二個(gè)是替換，將表面配體替換成親水的物質(zhì)使其親水。這兩個(gè)策略來自1998年[10][11]Alivisatos和Nie，兩人從不同的角度解決了這個(gè)問題，開啟了生物應(yīng)用的大門;Alivisatos在量子點(diǎn)表面包覆了一層硅，再利用相關(guān)硅烷的反應(yīng)，在量子點(diǎn)表面修飾了親水的氨基，而Nie則利用配體交換策略，在量子點(diǎn)表面修飾了親水的巰基羧酸，之后再利用量子點(diǎn)表面修飾的基團(tuán)進(jìn)行蛋白等大分子連接，作為熒光探針進(jìn)一步的應(yīng)用。早期的比較常用的修飾方法是建立在這2個(gè)策略之上，利用兩親性分子、小分子肽段疏水包裹法[12][13] [14]。水溶性配體交換的方法常用的配體交換試劑有巰基小分子、谷胱甘肽等[14][15][16]，這類修飾的方法有一個(gè)共同的特點(diǎn)是量子點(diǎn)表面的配體發(fā)生了變化，熒光效率會(huì)有不同的下降。還有將量子點(diǎn)包裹在二氧化硅微球中、塊狀共聚物膠束中、聚苯乙烯微球大大提高了檢測(cè)的敏感性，此類的修飾方法基于多個(gè)量子點(diǎn)單體聚合成多個(gè)，檢測(cè)敏感性提高，但修飾方法合成工藝復(fù)雜，要求高，形貌不易控制，修飾后的量子點(diǎn)一般在1-10um，尺寸的增大限制了其應(yīng)用。近年來將量子點(diǎn)使用兩親性聚合物修飾[17][18][19]，這類聚合物有羧甲基殼聚糖和辛胺接枝的聚丙烯酸、聚丙烯馬來酸酸酐等不僅可以保證發(fā)光效率，而且制備的微球粒徑可控、穩(wěn)定，易于工業(yè)化生產(chǎn)。因此采用不同類型的聚合物修飾量子點(diǎn)來達(dá)到應(yīng)用目的是當(dāng)前重要的研究熱點(diǎn)。

功能化的量子點(diǎn)進(jìn)行生物交聯(lián)標(biāo)記常用方法有EDC法、戊二醛法和SMCC（或SPDP）法等。表面有羧基官能團(tuán)的量子點(diǎn)可以使用EDC將其活化后與生物分子的氨基進(jìn)行連接;而表面有羧基官能團(tuán)的量子點(diǎn)則可以使用戊二醛將其活化后再連接生物分子的氨基，或者使用SPDP活化后連接生物分子上的巰基（生物分子無巰基時(shí)還可以用ITL試劑在其氨基上連接上巰基）。

3 ?熒光量子點(diǎn)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

量子點(diǎn)生物學(xué)應(yīng)用的起步始于1998年，Alivisatos和Nie同時(shí)創(chuàng)新性的解決了量子點(diǎn)標(biāo)記后的生物相容性難題，實(shí)現(xiàn)生物大分子與量子點(diǎn)的結(jié)合。隨后量子點(diǎn)開始廣泛應(yīng)用于包括DNA檢測(cè)技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)的多種生物技術(shù)中。

3.1 量子點(diǎn)在體內(nèi)應(yīng)用

Alivisatos等人采用兩種量子點(diǎn)標(biāo)記小鼠的成纖維細(xì)胞，證明可以將生物分子通過靜電力、氫鍵或者親和力結(jié)合在量子點(diǎn)表面。Nie等人使用巰基乙酸改性過的CdSe量子點(diǎn)，與轉(zhuǎn)鐵蛋白化學(xué)交聯(lián)后，可借助轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，可追蹤供體-受體反應(yīng)。Gao[20]等利用單細(xì)胞標(biāo)記分析更加高效將量子點(diǎn)在生物細(xì)胞方面的應(yīng)用向前推進(jìn)。張炎[21]等研究了新型水溶性量子點(diǎn)Zn3In2S6與抗CEA抗體形成熒光探針，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株進(jìn)行靶向標(biāo)記，合成的熒光探針的細(xì)胞毒性大幅降低。Nafiujjaman[22]的研究表明，新型的Cl-GQDs-N量子點(diǎn)直徑在30nm左右，并且在體外試驗(yàn)中表明，對(duì)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞，均沒有毒性作用，具備在細(xì)胞成像方面的應(yīng)用前景。

3.2 生物成像方面

由于近紅外光（650-900nm波長(zhǎng)范圍）不易被生物體內(nèi)背景吸收，所以量子點(diǎn)在活體成像方面具備不可比擬的優(yōu)勢(shì)。Akerman M E，Gao等人[23][24]證實(shí)通過小鼠靜脈注射生物標(biāo)記的量子點(diǎn)后，量子點(diǎn)能夠特異性的聚集在小鼠的特定組織上并且成功的顯像。

3.3 量子點(diǎn)在體外診斷

量子點(diǎn)應(yīng)用在體外診斷中，主要用作為熒光探針作為信號(hào)物質(zhì)，從而直接或間接的用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)。李萌[25]等采用EDC/NHS的辦法將HCV核心抗原的一株抗體偶聯(lián)到量子點(diǎn)上，磁微粒連接另一株抗體，建立雙抗體測(cè)HCV核心抗原的快速檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間和靈敏度較傳統(tǒng)的ELISA都有提高。郭愛玲[26]等使用EDC/NHS將制備好的CdS量子點(diǎn)與單增李斯特菌抗體IgG偶聯(lián)，偶聯(lián)CdS量子點(diǎn)的單增李斯特菌抗體的特性沒有發(fā)生變化，之后采用直接熒光法在熒光顯微鏡下快速靈敏地檢測(cè)出了單增李斯特菌。余皓[27]等制備CdSe/ZnS量子點(diǎn)，再將量子點(diǎn)標(biāo)記抗抗鈣素單抗，制備成免疫層析試紙條及其配套熒光檢測(cè)設(shè)備用于檢測(cè)血液中PCT，檢測(cè)結(jié)果和現(xiàn)有方法一致，具有無需前處理可全進(jìn)行血測(cè)量、熒光檢測(cè)設(shè)備成本低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。Hao Yu[28]等將量子點(diǎn)多色的功能和層析紙條結(jié)合，采用雙色（575nm和640nm）量子點(diǎn)分別標(biāo)記CRP和PCT的抗體構(gòu)建免疫層析系統(tǒng)，同時(shí)在血液中快速檢測(cè)CRP和PCT。Jinghua He[29]等使用量子點(diǎn)作為熒光探針，雙抗體夾心法在試紙條上檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物CA724和羅氏的電化學(xué)發(fā)光法基本一致，開始向腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)領(lǐng)域延伸。

4 ?展望

熒光量子點(diǎn)作為標(biāo)記物有著其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：較大的斯托克斯位移，從而不受激發(fā)光源的干擾;可以實(shí)現(xiàn)多色熒光，而激發(fā)光波長(zhǎng)一種即可;抗光漂白性極強(qiáng)，有著非常長(zhǎng)的熒光壽命;有著很高的量子產(chǎn)率，熒光信號(hào)極強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)熒光量子點(diǎn)的制備和標(biāo)記方法進(jìn)行了大量的研究，我國學(xué)者對(duì)量子點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用進(jìn)行了較深入的研究，對(duì)進(jìn)一步商業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化夯實(shí)了基礎(chǔ)。

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