實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雪貂阿留申病病毒核酸檢測(cè)方法的建立*

趙 鵬 郭 智 佟 巍 向志光

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京 100021)(2. 北京城市學(xué)院,北京 100083)

阿留申病病毒(Aleutian disease virus，ADV)屬于細(xì)小病毒。病毒核酸為單鏈DNA[1]。該病毒會(huì)引發(fā)阿留申病(Aleutian disease，AD)又稱漿細(xì)胞增多癥，是一種慢性傳染病，感染后表現(xiàn)終生病毒血癥，持續(xù)性感染，全身淋巴細(xì)胞增生，血清γ-球蛋白增多，腎小球性腎炎，動(dòng)脈炎和肝炎[2]。感染后動(dòng)物一般會(huì)慢性死亡，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行產(chǎn)生巨大影響，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)終止。

目前，ADV的檢測(cè)方法包括如碘凝集實(shí)驗(yàn)、對(duì)流免疫電泳、火箭電泳、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫復(fù)合物法、間接免疫熒光試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、膠體金免疫層析技術(shù)的血清學(xué)檢測(cè)方法以及PCR、熒光定量PCR、PCR-DPLC、核酸雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等分子生物學(xué)方法[3]。

PCR方法檢測(cè)ADV，最大的優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用范圍廣，可以對(duì)血清學(xué)檢測(cè)方法無法檢測(cè)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，例如死胎、組織標(biāo)本，敏感性更強(qiáng)，為糞便、尿液等低病毒樣本檢測(cè)提供了一種新方法[4]。其準(zhǔn)確性與特異性遠(yuǎn)超現(xiàn)在世界公認(rèn)的對(duì)流免疫電泳[5]。

VP2是ADV病毒主要免疫原性抗原，是抗原決定簇的載體，是研究病毒毒力、致病機(jī)理等的首選基因[6]，所以本實(shí)驗(yàn)根據(jù)ADV病毒Utah株的VP2基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病毒與細(xì)胞株： ADV、小鼠多瘤病毒(Polyoma Virus，POLY)、小鼠細(xì)小病毒(Minute virus of mice，MVM)、犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus，CPV)、皰疹病毒(Herpes Simplex virus，HSV)、鼠痘病毒(Ectromelia virus，ECT)、仙臺(tái)病毒(Sendai virus，SV)、小鼠腺病毒(Mouse adenovirus，Mad)； CRFK細(xì)胞。涉及的病毒及細(xì)胞本室保存。

1.1.2引物： 根據(jù)Gene Bank提供的ADV病毒Utah株VP2基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，分別是P2S-F：5′-aca cat taa cca agc tga cac a-3′，P2S-R：5′-tca tct tgt act gca tcc cag g-3′。

1.1.3試劑： Taq DNA聚合酶、核酸提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自Takara公司；pCloneEZ-TA-AMP載體購(gòu)自中美泰和生物技術(shù)有限公司；Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.4測(cè)試樣品： 來源于某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育機(jī)構(gòu)的新鮮雪貂糞便樣品39份。

1.2 方法

1.2.1DNA提取: 參照核酸提取試劑盒說明書提取ADV病毒DNA。

1.2.2目的片段擴(kuò)增及測(cè)序: 病毒DNA擴(kuò)增條件如下：10×Buffer Solution(Mg2+)3 μL，dNTP Mix 3 μL，上下游引物各1 μL，rTaq DNA聚合酶0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 20.5 μL。94 ℃變性5 min；94 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收目的條帶后送測(cè)序。

1.2.3特異性: 使用“1.2.2”中的方法對(duì)ADV、POLY、MVM、CPV、HSV、ECT、SV和Mad這8種DNA病毒進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試本引物的特異性。

1.2.4敏感性: 使用重組質(zhì)粒進(jìn)行敏感性測(cè)試。將目的基因連接到pCloneEZ-TA-AMP克隆載體上并進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在含有氨芐青霉素的平板上生長(zhǎng)8～9 h，挑取菌落在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)震蕩培養(yǎng)。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，PCR鑒定，紫外分光光度計(jì)測(cè)定陽性質(zhì)粒濃度，根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)計(jì)算公式[7]計(jì)算拷貝數(shù)。將質(zhì)粒進(jìn)行連續(xù)10倍梯度稀釋，測(cè)試PCR最低檢測(cè)限。

1.2.5樣品檢測(cè): 雪貂糞便樣品進(jìn)行處理。按1∶10的比例將糞便和DMEM培養(yǎng)基混合震蕩，離心12 000 r/min 30 min，取上清液作為樣品提取DNA[8]。提取方法按照核酸提取試劑盒說明書中的方法操作。使用“1.2.2”中的方法進(jìn)行PCR，測(cè)試時(shí)同時(shí)設(shè)立環(huán)境對(duì)照、空白對(duì)照、CRFK細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)照、病毒核酸對(duì)照、質(zhì)粒陽性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

通過電泳檢測(cè)，在500 bp位置上方出現(xiàn)條帶，具體見圖1。

圖1 ADV擴(kuò)增結(jié)果注：M：DL2000 DNA marker；1：空白對(duì)照；2：ADVFig.1 ADV amplification resultsNote：M: DL2000 DNA marker; 1: blank control; 2: ADV

目的條帶測(cè)序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示與報(bào)道的ADV病毒Utah株VP2基因的核酸序列和氨基酸序列同源性高達(dá)99%，片段長(zhǎng)度為531 bp。

2.2 特異性

將ADV、POLY、MVM、CPV、HSV、ECTR、SV、Mad的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，只有ADV得到單一目的條帶，長(zhǎng)度為531 bp，POLY、MVM、CPV、HSV、ECT、SV、Mad均沒有擴(kuò)增出目的條帶，結(jié)果見表1。

表1 引物特異性測(cè)試結(jié)果Table 1 primer specific test results

2.3 敏感性

測(cè)試質(zhì)粒濃度為23.485ng/μL，通過計(jì)算得出質(zhì)?？截悢?shù)為9.06×109copy/μL。經(jīng)連續(xù)10倍梯度稀釋進(jìn)行PCR檢測(cè)，在10-8稀釋度仍可檢測(cè)出ADV陽性條帶，確定此方法的最低檢出限在90.6 copy/μL，結(jié)果見圖2。

圖2 方法敏感性結(jié)果注：M：DL2000 DNA marker；1：空白對(duì)照；2：10-6；3：10-7；4：10-8；5：10-9；6：10-10；7：10-11；8：10-12；9：10-13；10：10-14；11：10-15；12：10-16Fig.2 method sensitivity resultsNote：M: DL2000 DNA marker; 1: blank control; 2: 10-6; 3: 10-7;4: 10-8; 5: 10-9; 6: 10-10; 7: 10-11;8: 10- 12;9:10-13;10:10-14;11:10-15;12:10-16

2.4 雪貂樣品檢測(cè)結(jié)果

在環(huán)境對(duì)照、空白對(duì)照、CRFK細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)照、病毒核酸對(duì)照、質(zhì)粒陽性對(duì)照成立的情況下，39份雪貂糞便樣品均未檢測(cè)出ADV，檢測(cè)結(jié)果具體見表2。

表2 39份雪貂糞便樣品ADV病毒核酸檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of detection of ADV virus nucleic acid in 39 samples of ferrets

3 討論

雪貂作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物目前逐漸廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究。我國(guó)對(duì)雪貂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化開始時(shí)間較晚，因此對(duì)雪貂進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制具有重要意義。

阿留申病毒是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雪貂必須排查的病原。通過建立的PCR檢測(cè)方法，可以直接、快速檢測(cè)出雪貂是否攜帶ADV，以此來預(yù)防和控制疾病擴(kuò)散起重要作用。本實(shí)驗(yàn)建立的PCR檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)，可以作為ADV的一般檢測(cè)方法使用。

PCR方法作為一種較為敏感的病原檢測(cè)方法，可以對(duì)動(dòng)物病原攜帶情況進(jìn)行評(píng)估。雖然ADV在自然界廣泛存在，但使用本實(shí)驗(yàn)建立的PCR方法并未在實(shí)驗(yàn)雪貂糞便樣品中檢出陽性。這可以說明，該雪貂動(dòng)物群體ADV病毒無流行狀況。全面評(píng)價(jià)動(dòng)物的微生物質(zhì)量仍需結(jié)合血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行。