染色質免疫沉淀技術及其應用

王遠锏

摘? ?要：染色質免疫沉淀技術是一種利用抗原抗體結合的特異性來檢測蛋白質與基因互作的技術，具有高效率但是低重復性的特點，影響實驗結果分辨率的因素包括檢測樣品使用量、DNA片段斷裂程度、抗體親和性等。隨著該技術的不斷發(fā)展，其應用范圍也逐漸擴大到如DNA測序、蛋白質修飾、對細胞類型特異性串聯染色質表觀遺傳修飾研究等方面，并逐步與如高通量測序技術、免疫熒光技術等其他研究手段相結合，在蛋白質尤其是組蛋白及其修飾產物與DNA互作研究領域發(fā)揮作用。

關鍵詞：染色質免疫技術? 蛋白質基因互作

中圖分類號：R446? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：1674-098X（2019）07（a）-0120-02

目前研究蛋白質與DNA互作的手段較多，其中染色質免疫沉淀技術是一種可以在體內活性環(huán)境下測定基因與蛋白互作的手段，自該技術創(chuàng)建以來，從單個蛋白與DNA互作、數個蛋白與DNA互作進而發(fā)展到目的蛋白與未知序列互作的研究，進一步延伸出檢測組蛋白修飾與DNA片段測序應用，再與免疫熒光技術、高通量測序技術、基因芯片技術等相結合，在其他研究領域也有著廣泛應用。

1? 染色質免疫沉淀技術原理

染色質免疫沉淀技術（Chromatin immunoprecitation， ChIP）是一種利用抗原抗體特異性結合反應在生理狀態(tài)下測定蛋白質與DNA互作的技術。首先將研究的細胞進行固定化，常用的固定化手段是使用福爾馬林固定，再使細胞維持在一個自然穩(wěn)定的狀態(tài)，同時甲醛還可以將將DNA與蛋白質進行交聯，以便于進一步操作。之后將DNA打斷成為200～1000bp的片段，可以使用超聲波處理隨機將DNA打破，也可以使用核酸酶特異性酶切長鏈。使用特異性抗體將與蛋白質相互結合的DNA片段進行沉淀，得到的沉淀進行進一步純化。之后使用如蛋白酶K[1]等手段將沉淀進行解交聯并使用層析等純化DNA片段，以便于進一步對目標DNA進行擴增與分析。之后使用PCR等對得到的DNA片段構建其相應的測序文庫，最后使用高通量測序技術對DNA進行測序，分析與蛋白的結合位點。最后對蛋白與DNA的結合位點進行驗證。

2? 影響ChIP檢測結果的因素

ChIP可重復性較低，干擾因素較多，主要是影響DNA片段、蛋白質交聯體與相應抗體的結合程度，包括檢測樣品使用量、DNA片段斷裂程度、抗體親和性等方面。樣品使用量直接影響的是DNA與蛋白交聯體破碎程度與抗體結合底物量，當樣品使用量過大時，對DNA的破碎程度不夠，在進一步的抗原抗體結合沉淀與DNA測序等過程均有較大影響。DNA片段的斷裂程度主要由處理手段決定，常見的如超聲波處理斷裂DNA片段中，超聲波破碎儀器的型號、超聲波的頻率等就是常見的影響ChIP檢測結果的因素。不同的超聲波破碎儀的工作原理、工作最佳條件不同，將影響底物破碎程度，張媛媛[2]等人的研究對三種不同型號的超聲波破碎儀 Bandelin Sonopuls HD 2070，Covaris M220 Focused-ultrasonicator、Bioruptor Plus.其中 Bandelin sonopuls HD 2070 為探頭式超聲破碎儀，而其他兩種破碎儀器為非接觸式超聲破碎儀，且后者的破碎效果更好，CHIP檢測結果分辨率更高。超聲波的頻率、處理時間與次數對ChIP實驗結果也有明顯影響，房艷華[3]等人對斜臥青霉轉錄調控因子Hac1進行實驗，在最佳菌絲用量為1g菌絲/10mL ChIP緩沖液下，25W超聲功率，工作時間5s，間隔時間40s，超聲30次可以得到最佳分辨率的分析結果?？贵w親和性也是影響結果的重要因素之一，一般ChIP實驗需要使用標準試劑盒或者已經經試驗證明有效的抗體，對于未檢測過的抗體最好使用IP/IHC/ICC進行檢測[4]。另外，部分抗體受染色質溶液中的抑制因子影響較大，因此需要對抗體的用量和染色質溶液比例進行調整。

3? 染色質免疫沉淀技術的應用

ChIP及其衍生技術目前在蛋白質-DNA互作、DNA測序、蛋白質尤其是組蛋白的修飾研究、細胞類型特異性串聯染色質表觀遺傳修飾研究等方面均有廣泛應用。在蛋白質-DNA互作方面，孫瑞[5]等人通過染色質免疫共沉淀確定了對核盤菌中Forkhead家族轉錄因子成員SsFox-E2可以參與調控核盤菌的有性生殖，進而對子囊盤的發(fā)育產生影響。組蛋白與DNA直接組裝成核小體并影響著基因表達，組蛋白修飾基團的變化將直接影響其與DNA的結合情況并影響基因表達及表達產物量的大小，王文靜[6]等利用ChIP確定組蛋白結合的DNA片段序列，PCR擴增并經過電泳檢測確定組蛋白H3K9m2和H3K4m3是可能引起miR-338-3p下調的，進而引起如食道癌等疾病的發(fā)生。在檢測復雜組織中特異性細胞表觀遺傳修飾領域ChIP也發(fā)揮著重要作用，Mari Mito等人針對高等真核生物神經系統(tǒng)設計出了一種串聯染色質免疫沉淀測序（tchip-Seq），這種手段通過使一種染色質組分FLAG-標記組蛋白h2b在Camk2a陽性錐體細胞中表達，并以細胞類型特異性的方式純化染色質。針對一種主要與活性啟動子相關的染色質修飾H3K4me3使用抗體的染色質免疫沉淀，從而觀察Camk2a陽性錐體細胞中組蛋白修飾情況。通過這種手段在與神經元功能相關與關系未知的基因上游發(fā)現了數百個H3K4me3，以此證明這種串聯染色質免疫沉淀測序可以做為一種研究體內特定細胞類型表觀遺傳修飾的通用方法。

參考文獻

[1] 吳彤， 王瑞明， 黃磊，等. 蛋白酶K的研究進展[J]. 食品工業(yè)科技， 2013， 34（14）：380-384.

[2] 張媛媛，黃冬梅，鄧班，等.植物葉片染色質免疫共沉淀方法的優(yōu)化[J].福建農林大學學報（自然科學版），2018，47（3）：329-335.

[3] 房艷華， 韋小敏， 李肖，等. 斜臥青霉轉錄調控蛋白Hac1染色質免疫共沉淀分析方法的建立[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版， 2018（3）.

[4] NISHIKORI S，HATTORI T，FUCHS S M，et al. Broad ranges of affinity and specificity of anti-histone antibodies revealed by a quantitative peptide immunoprecipitation assay[J].Journal of Molecular Biology，2012，424（ 5） ： 391-399.

[5] Mito M ， Kadota M ， Tanaka K ， et al. Cell Type-Specific Survey of Epigenetic Modifications by Tandem Chromatin Immunoprecipitation Sequencing[J]. Scientific Reports， 2018， 8（1）：1143.