響應(yīng)面優(yōu)化紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)提取工藝研究

李曉雪 王菲 崔新爽 楊逢建

摘?要：為研究紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)的最佳工藝條件，本研究以黃酮類物質(zhì)提取率為評價指標(biāo)，采用微波輔助提取法從紫蘇葉中對其進(jìn)行提取。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面Box-Benhnken優(yōu)化技術(shù)對紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)的微波提取工藝加以完善。得出最佳工藝條件為：微波時間30 min、微波功率268 W、液料比15∶1 ml/g、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，實際提取率高達(dá)7.833%，與理論推測值7.849%±0.016%，為開發(fā)紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)提供支撐材料和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫蘇葉;黃酮;微波輔助;響應(yīng)面優(yōu)化;最佳工藝條件

中圖分類號：Q946文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1006-8023（2019）06-0048-07

Optimization of Extraction Process of Flavonoids from Perilla Leaves

by Response Surface Methodology

LI Xiaoxue， WANG Fei， CUI Xinshuang， YANG Fengjian*

（Key Laboratory of Forest Plant Ecology， Ministry of Education， Northeast Forestry University， Harbin 150040）

Abstract：In order to study the optimal technological conditions of flavonoids in the leaves of perilla， this study took the extraction rate of flavonoids as the evaluation index， and used microwave-assisted extraction method to extract flavonoids from the leaves of Perilla. On this basis， the microwave extraction process of flavonoids was improved by response surface Box-Benhnken optimization technology. The optimum conditions were as follows： microwave time was 30 min， microwave power was 268 W， liquid-material ratio was 15∶1 ml/g， volume fraction of ethanol was 80 %， actual extraction rate was as high as 7.833 % and deviation from theoretical value was 7.849 % ± 0.016 %. It provided support materials and theoretical basis for the development of flavonoids in perilla leaves.

Keywords：Perilla leaves; flavonoids; microwave assisted; response surface optimization; optimal process conditions

0?引言

紫蘇（Perilla frutescens（ L.） Britt. ），又稱白蘇，唇形科紫蘇屬，一年生草本植物[1-3]，具有特異芳香氣味[4]。紫蘇葉中的營養(yǎng)成分極其豐富，包括水、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪以及多種維生素等。不僅如此，紫蘇葉中還有紫蘇醇、紫蘇酮、薄荷醇、薄荷酮、丁香油酚及白蘇烯酮等物質(zhì)[5-8]。其中的黃酮類物質(zhì)是植物中主要的多酚類天然產(chǎn)物， 是天然酚性化合物之首。其主要藥理作用為抗肝臟毒性、抗菌、抗氧化、降血脂、抗衰老、抗疲勞和增強(qiáng)免疫功能等[9-11]。

黃酮類物質(zhì)的提取方法有很多，其中，微波輔助提取技術(shù)是借助微波過程中紅外熱導(dǎo)作用，具有較好的受熱條件及穿透性，在植物活性物質(zhì)分離和純化的過程中得以廣泛的應(yīng)用[12]。因此，本研究對紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)的微波輔助提取進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究與分析，通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化對紫蘇葉黃酮類物質(zhì)的最佳提取方法和工藝條件予以分析、確定，為開發(fā)紫蘇葉總黃酮類化合物提供支撐材料和理論依據(jù)[13]。

1?材料與儀器

1.1?材料與試劑

紫蘇葉于2018年9月末采自黑龍江地區(qū)。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）、無水乙醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）、氫氧化鈉（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）、硝酸鋁（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）、亞硝酸鈉（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）等試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

1.2?設(shè)備與儀器

試驗儀器：磁力攪拌水浴鍋（常州恩培儀器制造有限公司）、微波爐（佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器公司）、KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、752N型紫外分光光度計（上海精科實業(yè)有限公司）、旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器（上海一科儀器有限公司）。

2?實驗方法

2.1?紫蘇總黃酮含量測定

2.1.1?標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，溶于5 ml甲醇，配置濃度為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，蒸餾水為空白樣品。取0.5 ml標(biāo)準(zhǔn)溶液置于比色管中，加入0.5 ml 5%亞硝酸鈉、0.5 ml 10%硝酸鋁、4.0 ml 4%氫氧化鈉和4.5 ml 95%無水乙醇，混勻避光靜止15 min，在510 nm波長下測定吸光值[14]。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]，所得曲線如圖1所示。

對蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1中所有數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，所得的線性方程y=0.621 1x+0.005 6， R2=0.999 3。

2.1.2?總黃酮含量的測定

將樣品用蒸餾水溶解，稀釋50倍后，按照上述方法測定OD值（吸光度）。之后，通過蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算樣品的總黃酮含量，計算公式：

y=c×vm×100%。

式中： y代表總黃酮含量，%;c代表樣品濃度，g/ml;v代表樣品液體總體積，ml;m代表樣品質(zhì)量，mg[16]。

2.1.3?數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

單因素試驗數(shù)據(jù)采用Excel2010進(jìn)行繪制處理，響應(yīng)面試驗結(jié)果用Design Expert 8.0.6軟件分析。

2.2?單因素試驗

2.2.1?乙醇體積分?jǐn)?shù)對紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)提取率的影響

每組稱取紫蘇葉5 g，微波功率為230 W，液料比為15∶1 ml/g，微波時間30 min，在乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%下進(jìn)行提取，研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)提取率的影響。

2.2.2?液料比對紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)提取率的影響

稱取紫蘇葉5 g，微波功率為230 W，選取80%的無水乙醇，時間30 min，分別在液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 ml/g 5種情況下進(jìn)行提取，探究不同液料比對試驗結(jié)果的影響。

2.2.3?微波時間對紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)提取率的影響

稱取5 g干燥的紫蘇葉，將其按15∶1 ml/g的液料比溶入80%的無水乙醇中，在微波功率為230 W下分別提取10、20、25、30、35 min，考察不同提取時間對紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)提取率的影響。

2.2.4?微波功率對紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)提取率的影響

稱取5 g干燥的紫蘇葉，80%的無水乙醇，將其按15∶1 ml/g的液料比混合，在微波功率分別為120、230、385、540、700 W下提取30 min，探究不同微波功率對紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)提取率的影響。

2.3?響應(yīng)面試驗因素與水平的選取

為了更進(jìn)一步研究微波輔助提取法提取紫蘇葉中黃酮物質(zhì)過程中諸多因素之間的關(guān)系，根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果，應(yīng)用Box-Behnken試驗設(shè)計原理選取微波功率、微波時間和液料比3個影響程度較高的因素，在響應(yīng)面分析方法下進(jìn)行試驗工藝參數(shù)的優(yōu)化，最大程度地對黃酮類物質(zhì)進(jìn)行提取。并且對三個因素的影響程度進(jìn)行了橫向?qū)Ρ?。其中試驗因素與水平表見表1。

3?結(jié)果與討論

3.1單因素試驗結(jié)果

3.1.1?乙醇體積分?jǐn)?shù)

黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加逐漸發(fā)生變化，呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢[17]，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時提取率達(dá)到最高（圖2）。試驗發(fā)現(xiàn)，水分子為主要的升溫來源，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%～80%時，水含量較高，增大了溶液對物料的滲透性，從而提高了黃酮類物質(zhì)的提取率。但隨著乙醇比例的增大，水分子逐漸減小，對物料的升溫速度產(chǎn)生了影響，阻礙黃酮類物質(zhì)的溶出，從而影響提取率。故選用70%～90%的無水乙醇進(jìn)行優(yōu)化試驗。

3.1.2?微波時間

隨著提取時間的延長，黃酮提取率也在逐漸上升，在30 min時提取率最高，隨后又呈現(xiàn)下降的趨勢（圖3）。其原因可能是由于隨著時間的延長，黃酮類物質(zhì)不斷地從紫蘇葉中溶出，在30 min時幾乎全部溶出;但由于長時間的微波輻射，使一些熱不穩(wěn)定的黃酮變性損失，或者導(dǎo)致溶劑有所揮發(fā)，從而使提取率下降。因此，選用25～35 min的微波提取時間進(jìn)行優(yōu)化試驗。

3.1.3?微波功率

隨著微波功率的增大，黃酮提取率不斷升高，但上升速度趨于緩慢（圖4）?？赡苁且驗樵谖⒉ㄝ椛涞倪^程中，溶質(zhì)吸收微波的能力逐漸增強(qiáng)[18]，在微波功率230 W時達(dá)到飽和點，黃酮的提取率最大。但隨著功率的不斷上升，黃酮類物質(zhì)的損失程度也在不斷加大。綜合考慮，選擇120～385 W的微波功率進(jìn)行優(yōu)化試驗。

3.1.4?液料比

隨著液料比的增大，黃酮類物質(zhì)的提取率逐漸升高（圖5）。這表明在溶質(zhì)一定的情況下，加入的乙醇比例越多，黃酮提取率越高。這可能是因為濃度差加大利于黃酮類物質(zhì)從原料中溶出，在15∶1 ml/g的比例下黃酮類物質(zhì)全部融出;在臨界點（15∶1 ml/g）之后，試驗產(chǎn)生的雜質(zhì)一并隨著液料比的升高而增大，從而影響黃酮的提取率。綜合考慮，應(yīng)選取10∶1～20∶1 ml/g進(jìn)行優(yōu)化試驗。

3.2?響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果

3.2.1?響應(yīng)模型的建立與顯著性檢驗

設(shè)計方案與結(jié)果見表2。其主要目的是用來分析試驗誤差，以黃酮得率（R）為響應(yīng)值進(jìn)行回歸擬合，最終得到二次多元回歸方程模型：

R=+7.82+0.025A+0.14B-0.038C-0.10A·B+

0.000A·C+0.025B·C-0.22A2-0.40B2-0.20C2

由方差分析結(jié)果（表3）可知，所得出的回歸方程中不同變量與響應(yīng)值之間影響的顯著程度是由由F值的大小決定的，即F值越大，影響程度越強(qiáng);相反F值越小，影響程度越弱。因此，在應(yīng)用微波輔助提取法提取黃酮類物質(zhì)的過程中各個因素對黃酮提取率的影響程度依次為：B-功率>C-料液比>A-時間。P>0.05差異性不顯著，P<0.01差異性極顯著。其中總模型方程P模型=0.0002<0.05表現(xiàn)為顯著，不同處理條件之間的差異極顯著;P失擬=0.541 3>0.05說明差異之間不顯著。標(biāo)準(zhǔn)方差反映一個數(shù)據(jù)集的離散程度，數(shù)據(jù)整體分布離平均值越近，標(biāo)準(zhǔn)方差就越?。ū?）。反之，數(shù)據(jù)分布離平均值越遠(yuǎn)，標(biāo)準(zhǔn)方差越大。模型的精確度與變異系數(shù)（CV）有關(guān)，CV的值（1.08%）越低精確度越高。系數(shù)R2的值為0.967 5>0.9，說明該模型的擬合程度良好。

3.2.2?響應(yīng)曲面圖和等高線圖分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件擬合出相應(yīng)的曲面圖和等高線（如圖6～圖8所示），依據(jù)黃酮類物質(zhì)提取率的回歸模型做出響應(yīng)面圖，可以直觀地反映各因素之間的交互作用對黃酮提取率的影響，并確定最佳提取工藝條件。

3.2.3?優(yōu)化結(jié)果的驗證、對比試驗

通過對響應(yīng)面數(shù)據(jù)的分析與單因素試驗進(jìn)行綜合對比研究，對回歸模型方程進(jìn)行解析得出黃酮的最佳提取率為7.849%。于此同時微波輔助提取法的最佳工藝參數(shù)為：提取時間30 min，微波功率268 W，液料比15∶1 ml/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%。以優(yōu)化得出的實驗參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)驗證試驗，所得到真實的平均提取值為7.833%，與模型預(yù)測值較為相符。通過對表5中兩個數(shù)據(jù)對比可知，應(yīng)用微波輔助提取法得到的提取率高于超聲波輔助的得率。同時超聲輔助提取法受有效作用區(qū)域的限制，容易在提取物周圍形成超聲空白區(qū);還會造成一定程度的噪音。

4?結(jié)論

通過單因素試驗，確定了黃酮類物質(zhì)的最佳提取方法。在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析優(yōu)化法對微波輔助提取紫蘇葉總黃酮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建了二次回歸方程模型。通過響應(yīng)面圖對各因素及其交互作用予以研究和分析，得出微波輔助提取法的最佳提取工藝條件為：時間30 min、微波功率268 W、液料比15∶1 ml/g、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，為紫蘇葉的精深加工利用以及提高其附加值提供了理論的依據(jù)。

【參?考?文?獻(xiàn)】

[1]劉芳潔.紫蘇不同部位乙醇提取物對蘋果樹腐爛病的影響及機(jī)制[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（17）：97-101.

LIU F J. Effect and mechanism of ethanol extracts from different parts of Perilla frutescens on apple tree canker[J]. Jiangsu Agricultural Science， 2018， 46（17）：97-101.

[2]張琛武，郭佳琪，郭寶林.紫蘇中酚酸類成分研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥，2017，19（11）：1651-1658.

ZHANG C W， GUO J Q， GUO B L. Review on research of phenolic acids in Perilla frutescens[J]. Modern Chinese Medicine， 2017， 19（11）：1651-1658.

[3]魏長玲，郭寶林.紫蘇葉揮發(fā)油的不同化學(xué)型及研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2015，40（15）：2937-2944.

WEI C L， GUO B L. Advances in research of volatile oil and its different chemotypes in leaves of Perilla frutescens[J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine， 2015， 40（15）：2937-2944.

[4]閔文莉，曹喜濤，季更生，等.調(diào)控脂肪酸合成植物轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展[J].發(fā)酵科技通訊，2017，46（2）：107-112.

MIN W L， CAO X T， JI G S， et al. Researches of plant transcription factors involving in fatty acid synthesis[J]. Communications on Fermentation Technology， 2017， 46（2）：107-112.

[5]吳存兵，張鈺涓，邵伯進(jìn)，等.響應(yīng)面優(yōu)化泡沫法提取紫蘇餅粕蛋白的工藝[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017，44（4）：574-579.

WU C B， ZHANG Y J， SHAO B J， et al. Optimization of foam separation of protein from perilla seed meal using the response surface method[J]. Journal of Anhui Agricultural University， 2017， 44（4）：574-579.

[6]李武強(qiáng)，黃曉鵬，馬嘉偉，等.響應(yīng)面法優(yōu)化桔梗切片遠(yuǎn)紅外干燥工藝[J].林業(yè)機(jī)械與木工設(shè)備，2019，47（8）：47-51.

LI W Q， HUANG X P， MA J W， et al. Optimization of far infrared drying process of platycodon grandiflorum slice by response surface methodology[J].Forestry Machinery & Woodworking Equipment，2019，47（8）：47-51.

[7]朱雙全.紫蘇化學(xué)成分及藥理學(xué)研究進(jìn)展概要[J].生物化工，2018，4（2）：148-149.

ZHU S Q. Summary of research progress on the chemical constituents and pharmacology of Perilla[J]. Biological Chemical， 2018， 4（2）：148-149.

[8]楊慧，馬培，林明寶，等.紫蘇葉化學(xué)成分、抗炎作用及其作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2017，31（3）：279-286.

YANG H， MA P， LIN M B， et al. Research progress in chemical constituents， anti-inflammatory effect and mechanism of Folium Perillae[J]. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology， 2017， 31（3）：279-286.

[9]許丹妮，蘇秀芳，秦蘭清.超聲波輔助法提取假蘋婆樹皮總黃酮及其抗氧化作用研究[J].廣東化工，2019，46（6）：38-40.

XU D N， SU X F， QIN L Q. Study on ultrasonic-assisted extraction and the antioxidation of total flavonoids from Sterculia Lanceolata Blark[J]. Guangdong Chemical， 2019， 46（6）：38-40.

[10]王婷，徐俞悅，陳素紅，等.松針的保健功效及相關(guān)產(chǎn)品研究進(jìn)展[J].中草藥，2018，49（17）：4171-4177

WANG T， XU Y Y， CHEN S H， et al. Research progress on health benefits of pine needles and related health products[J]. Chinese Herbal Medicine， 2018， 49（17）：4171-4177.

[11]楊耀森，闞淇濱，蘇建青，等.七味地藿顆粒黃酮的提取工藝優(yōu)化研究[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2019，40（4）：47-52.

YANG Y S， KAN Q B， SU J Q. Optimization of extraction technology of flavonoids from Qiweidihuo Granule[J]. Advances in Animal Medicine， 2019， 40（4）：47-52.

[12]李占君，張志環(huán)，張厚良，等.紫蘇籽精油提取工藝及其脂肪酸構(gòu)成的研究[J].森林工程，2019，35（1）：36-41.

LI Z J， ZHANG Z H， ZHANG H L， et al. Study on extraction process of essential oil from Perilla frutescens and its fatty acid composition[J]. Forest Engineering， 2019， 35（1）：36-41.

[13]黃紅雨，趙虎，金曉艷.紫蘇葉花青素提取工藝及其活性研究[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（14）：50-57.

HUANG H Y， ZHAO H， JIN X Y. Study on extraction process and activity of anthocyanin from Perilla frutescens leaves[J]. Food Research and Development， 2018， 39（14）：50-57.

[14]張子?xùn)|，張圓圓，孟永斌，等.沙棗果總黃酮類化合物的富集研究[J].植物研究，2018，38（3）：467-474.

ZHANG Z D， ZHANG Y Y， MENG Y B， et al. Flavonoids enrichment from Elaeagnus angustifolia fruit[J]. Plant Research， 2018， 38（3）：467-474.

[15]羅教，楊玉萍，黨宗福.銀杏葉總黃酮提取條件研究[J].遼寧化工，2019（4）：310-312.

LUO J， YANG Y P， DANG Z F. Study on the condition of extracting favonoids from Ginkgo biloba leaves[J]. Liaoning Chemical Industry， 2019（4）：310-312.

[16]楊嵐，楊玲，李邦耀，等.寧夏不同產(chǎn)地沙棘黃酮類物質(zhì)含量及抗氧化活性的研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2018，24（14）：22-24.

YANG L， YANG L， LI B Y， et al. Study on flavonoid content and antioxidant activity of Hippophae rhamnoides from different areas in Ningxia[J]. Anhui Agricultural Science Bulletin， 2018， 24（14）：22-24.

[17]黃艷玲，熊建文，蔡錦源，等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取艾葉總黃酮的工藝研究[J].輕工科技，2019，35（2）：40-43.

HUANG Y L， XIONG J W， CAI J Y， et al. Response surface method was used to optimize the microwave-assisted extraction of total flavonoids from Artemisiaargyi leaves[J]. Light Industrial Technology， 2019， 35（2）：40-43.

[18]崔建強(qiáng)，唐靜，王燕，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化花生殼中木犀草素的微波提取工藝[J].化學(xué)與生物工程，2017，34（4）：42-46.

CUI J Q， TANG J， WANG Y， et al. Optimization on microwave extraction process of mignonette from peanut shells by response surface methodology[J]. Chemical and Biological Engineering， 2017， 34（4）：42-46.