miR-145通過調(diào)控解聚素-金屬蛋白酶17對MCF-7乳腺癌細胞的影響

張 蘭，鄭 健，張雪鵬，胡寶山，李長仔，張晉冀

0 引 言

解聚素-金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）屬于ADAM 家族，許多文獻報道ADAM17 在惡性腫瘤中表達明顯增多，而在正常組織中趨于正常［1-4］。ADAM17 可通過轉(zhuǎn)化某種因子、調(diào)節(jié)蛋白等多種途徑激活表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）配體，進而下游通路發(fā)揮作用，從而大大增強了腫瘤細胞的增殖、遷移能力［5-10］。本課題組前期發(fā)現(xiàn)通過抑制ADAM17 后，乳腺癌細胞的增殖力和侵襲力均明顯下降［11］。研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-145（miR-145）在多種腫瘤中的表達降低，并可通過負性調(diào)控ADAM17表達，促進腫瘤細胞的增殖和侵襲；但在乳腺癌中，miR-145對ADAM17的調(diào)控作用鮮見報道［1-2］。本研究高表達miR-145后，觀察MCF-7細胞增殖、侵襲的變化和對ADAM17、EGFR 的調(diào)控，探討miR-145 通過下調(diào)ADAM17 對乳腺癌細胞生物學行為的作用，為ADAM17 成為乳腺癌靶向治療的潛在靶點提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料MCF-7 細胞株購于中國醫(yī)學科學院天津血液研究所；miR-145 mimics 及NC 序列由廣州銳博公司設計合成。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組MCF-7 人乳腺癌細胞在37℃、5%CO2飽和濕度培育箱中常規(guī)培育、傳代。將MCF-7 乳腺癌細胞分3 組，即轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染miR-145 mimics）、對照組（未行轉(zhuǎn)染）、無義序列組（轉(zhuǎn)染無意義miRNA）。細胞達到80%融合時，轉(zhuǎn)染過程嚴格按照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 說明書進行，對照組（加入等體積PBS 緩沖液）、轉(zhuǎn)染組（空白培養(yǎng)基+Lipofectamine 2000+miR-145 mimics）、無義序列組（空白培養(yǎng)基+Lipofectamine 2000+NC-miRNA），轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L，轉(zhuǎn)染6 h，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 qPCR 檢測各組miR-145，ADAM17、EGFR 的mRNA 表達細胞轉(zhuǎn)染48～72 h 后，應用Trizol 法提取細胞總RNA，6 孔板每孔1mL Trizol，充分裂解，靜置10 min，加入200 μL 氯仿，混勻，靜置3 min，4 ℃，12 000×g，15 min，移出上層水相，加等體積異丙醇，混勻，靜置10 min，再次離心，棄去上清，加DEPC 水配制的75%冷乙醇洗滌，離心，棄去上清，充分干燥，DEPC 水10 μL 溶解，RNA 純度測定260 nm/280 nm 的比值在1.8～2.0 之間時，RNA 純度能夠滿足實驗要求。PCR引物序列如下：MiR-145：莖環(huán)引物 序 列 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGGGAT-3′；上游引物序列5′-CCTCACGGTCCAGTTTTCCC-3′；下游引物序 列 5′CCATGACCTCAAGAACAGTATTTCC-3′；U6：莖 環(huán) 引 物 序 列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGTG-3′；上游引物序列5′-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下 游 引 物 序 列5′-GAGGTATTCGCACCAGAGGA-3′；ADAM17：上 游 引 物 序 列5′-ACCCAGAGTTTTTATGTAGCAGGG-3′；下游引物序列5′-AACTGCCCAGCAAATCAGGG-3′；EGFR：上游引物5′-CTTCTGGAGGGTGAGCCAAG-3′；下游引物5′-GCGATGGACGGGATCTTAGG-3′；β-actin：上游引物5′-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3′；下游引物5′-CGTGCTCGATGGGGTACTTC-3′

配制擴增引物、反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物，引物儲存液、工作液存于-20 ℃冰箱。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明合成cDNA，條件為37 ℃，50 min。qPCR 采用20μL 反應體系，條件：95 ℃10 min；95 ℃10 s；56 ℃20 s；72 ℃10 s；進行qPCR 擴增45 個循環(huán)。miR-145 以U6 為內(nèi)參檢測相對表達量，ADAM17、EGFR 以βactin為內(nèi)參檢測相對表達量。

1.4 MTT 檢測各組MCF-7 乳腺癌細胞的生長、增殖能力MTT 技術(shù)的檢測時間分別為轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，同時檢測每個分組波長在490nm處的A值，重復3次，取平均值。細胞抑制率計算公式如下：

細胞抑制率＝（1－實驗組A 值/對照組A 值）×100%［12］

1.5 細胞侵襲力測定將細胞重懸以5×105個/mL的濃度接種到Transwell 小室的上室面，下室加入完全培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2飽和濕度培育箱中培育24 h。切取聚碳酸酯膜，蘇木精染色，中性樹膠封固。高鏡下觀察，隨機均勻取5 個視野進行采圖，計數(shù)，計算5 個野穿膜細胞數(shù)的平均值，3 組實驗同時進行。

1.6 ADAM17、EGFR 蛋白表達采用蛋白印跡法測定蛋白表達量，RIPA 法提取細胞總蛋白質(zhì)，PBS沖洗細胞3次，瀝干，加入RIPA 裂解液，冰上充分裂解，離心，吸取上清，BCA 法測定蛋白濃度，隨后進行SDS-PAGE 凝膠電泳，每個樣本上樣量30 μg，濃縮膠電壓90 V 約30 min，分離膠電壓120 V 約60 min，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜200 mA 恒流電轉(zhuǎn)，一抗4 ℃孵育過夜，次日洗膜，二抗搖床孵育2 h，孵育結(jié)束后，再次洗膜，而后顯色。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，使用SNK法。進行兩兩組間比較，MTT 檢測結(jié)果采用重復測量資料方差分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 qPCR 檢 測miR-145 轉(zhuǎn) 染 效 率qPCR 結(jié) 果 表明，轉(zhuǎn)染組細胞中miR-145 相對表達量（13 964.33±1 265.30）較對照組（1.00±0.05）和無義序列組（1.03±0.15）明顯上升（P＜0.01）。

2.2 MTT 檢測細胞增殖抑制率曲線結(jié)果表明，隨著時間的不斷延長，轉(zhuǎn)染組的抑制率明顯升高，72 h 達最高峰值。與24、48、72 h 無義序列組比較，轉(zhuǎn)染組MCF-7抑制率明顯升高（P＜0.01），見圖1。轉(zhuǎn)染組24、48 h A值明顯高于對照組和無義序列組（P＜0.05）；對照組72 h A值高于24 h（P＜0.05），無義序列組、轉(zhuǎn)染組48、72 h A 值明顯高于組內(nèi)24 h（P＜0.05），對照組、轉(zhuǎn)染組、無義序列組72 h A 值均高于組內(nèi)48 h（P＜0.05），見表1。

2.3 細胞侵襲能力乳腺癌細胞MCF-7 轉(zhuǎn)染組穿膜細胞數(shù)［（56.20±2.17）個/視野］明顯低于對照組［（92.80±3.90）個/視野］和無義序列組［（91.80±4.97）個/視野］的穿膜細胞數(shù)（P＜0.01）。見圖2。

圖1 無義序列組和轉(zhuǎn)染組MCF-7 乳腺癌細胞不同時間點的抑制率Figure 1 Inhibition rates at different time points of nonsense sequence group and transfection group

表1 MTT 檢測各組MCF-7 乳腺癌細胞不同時間點的吸光度（xˉ±s,n=6）Table 1 MTT detection of absorbance at three different time points（xˉ±s,n=6）

圖2 3組細胞侵襲能力檢測結(jié)果（HE×200）Figure 2 Results of cell invasion ability test of three groups（HE×200）

2.4 qPCR檢測ADAM17、EGFR的mRNA轉(zhuǎn)染組ADAM17 mRNA的表達量明顯高于對照組（P＜0.01），但與無義序列組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.5 各組細胞中ADAM17、EGFR 的蛋白表達轉(zhuǎn)染組ADAM17、EGFR 的蛋白表達水平與對照組、無義序列組比較明顯降低（P＜0.01），見圖3，表2。

圖3 ADAM17和EGFR蛋白表達量Figure 3 ADAM17 and EGFR protein expression

表2 各組ADAM17、EGFR的蛋白表達值(xˉ±s,n=6）Table 2 Protein expression values of ADAM17 and EGFR(xˉ±s,n=6）

3 討 論

本課題組前期研究轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA 后，乳腺癌細胞的生長、侵襲及遷移能力明顯下降，這一實驗結(jié)果說明在乳腺癌的發(fā)生機制中ADAM17 可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［13-14］。本課題組還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA 的骨髓間充質(zhì)干細胞對裸鼠乳腺癌移植瘤的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用［15-16］。上述研究表明ADAM17是乳腺癌靶向治療的潛在靶點。

miRNA 是 一 種 小 的 非 蛋 白 質(zhì) 編 碼RNA［17-19］，miRNA 在細胞生長、自然死亡、機體代謝、個體發(fā)育、腫瘤各個方面起到重要作用，與生命活動密切相關(guān)。相關(guān)文獻報道m(xù)iR-145在多種腫瘤中呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，和抑癌基因作用相似，其在消化道惡性腫瘤、肺癌、卵巢癌等多種腫瘤中有著顯著的抑制作用［20-22］。包括乳腺癌在內(nèi)，有研究發(fā)現(xiàn)miR-145在乳腺惡性腫瘤中呈低表達，并且miR-145 與實體瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)［23］。有研究通過構(gòu)建病毒載體轉(zhuǎn)染miR-145模擬雙鏈寡核苷酸成功的降低了體內(nèi)及體外系統(tǒng)中乳腺癌細胞的生長、運動，證實miR-145在乳腺惡性腫瘤的發(fā)生機制中起到調(diào)控作用，另外，聯(lián)合使用抗腫瘤藥物5-FU時，乳腺癌細胞的生長受到更顯著的抑制作用［24］。

通過靶基因預測數(shù)據(jù)庫進行靶基因預測，發(fā)現(xiàn)miR-145 與ADAM17 存在相對穩(wěn)定的堿基互補序列，這說明ADAM17 可能受miR-145 的直接調(diào)控。另外，靶基因預測數(shù)據(jù)庫中并未發(fā)現(xiàn)miR-145 與EGFR 之間存在匹配堿基對，說明EGFR 不是miR-145的靶基因，不受miR-145的直接調(diào)控。李雪等［25］通過miR-145 mimics 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化生長因子β1 誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)miR-145 負性調(diào)控ADAM17 并且能夠抑制間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程。Jing 等［26］在鼻咽癌中通過熒光素酶報告基因檢測、qPCR 及蛋白印跡證實miR-145 與ADAM17 存在靶向關(guān)系，并且證明了miR-145可以靶向調(diào)控ADAM17來抑制鼻咽癌細胞的增殖及侵襲。本研究主要是探究高表達miR-145與ADAM17、EGFR的關(guān)聯(lián)，探討miR-145對MCF-7 乳腺癌細胞增殖、侵襲能力的影響。本研究通過將miR-145 模擬物導入MCF-7 細胞，調(diào)高MCF-7 細胞中miR-145 的水平，發(fā)現(xiàn)細胞的生長能力及侵襲能力明顯降低，這說明miR-145 能夠顯著抑制MCF-7 乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-145 mimics 后ADAM17mRNA 表達量上調(diào)，但ADAM17 蛋白的表達水平下降，表明盡管miR-145 mimics 對ADAM17mRNA 的轉(zhuǎn)錄有影響，但在翻譯水平對ADAM17 的蛋白表達有抑制作用。因為最終發(fā)揮功能作用的為蛋白，故miR-145對ADAM17 有抑制作用。因為EGFR 與miR-145 之間不存在互補堿基，所以本研究中miR-145 mimics對EGFR mRNA 無直接調(diào)控作用。但本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ADAM17可調(diào)控EGFR的表達，故miR-145是通過ADAM17抑制EGFR的蛋白表達水平［27］。

綜上所述，miR-145 能通過靶向抑制ADAM17-EGFR 通路，從而抑制MCF-7 乳腺癌細胞的增殖、侵襲能力，并進一步驗證了ADAM17 有可能成為乳腺癌靶向治療新靶點。