植物三萜皂苷代謝中達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶的生物信息學(xué)分析

趙志新 王星星

摘要：搜集4種植物的10條達(dá)瑪烷合成酶及22種植物的30條β-香樹脂合成酶，利用生物信息學(xué)工具對(duì)這2種三萜皂苷代謝關(guān)鍵酶的理化性質(zhì)、蛋白特性及進(jìn)化親緣關(guān)系等進(jìn)行分析。理化性質(zhì)分析顯示，這2種酶的氨基酸序列在氨基酸數(shù)目、組成、分子量、理論pI和脂肪指數(shù)等方面均表現(xiàn)出較強(qiáng)的一致性;同時(shí)，這2種酶的糖基化位點(diǎn)具有高度的保守性，并且大豆（2）、綠玉樹、木欖這3條β-香樹脂合成酶序列有極大的可能性有糖基化位點(diǎn);信號(hào)肽預(yù)測分析表明，這2種酶沒有明確的信號(hào)肽;α-螺旋和無規(guī)則卷曲是多肽鏈中主要存在的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件;系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示序列間差異較小，并且聚類結(jié)果與序列的科屬特性相一致。不同植物的達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶蛋白特性差別不大，進(jìn)化距離也比較近，說明這2種酶具有較高的保守性和穩(wěn)定性。這有助于理解達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶的保守結(jié)構(gòu)域及進(jìn)化變異，為研究這2種酶的酶學(xué)特征及三萜皂苷代謝提供幫助。

關(guān)鍵詞：達(dá)瑪烷合成酶;β-香樹脂合成酶;生物信息學(xué)分析;三萜皂苷;理化性質(zhì);蛋白特性;進(jìn)化親緣關(guān)系;糖基化位點(diǎn);保守結(jié)構(gòu)域;酶學(xué)特征

中圖分類號(hào)： S188文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）18-0086-07

收稿日期：2019-01-15

基金項(xiàng)目：國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：201811396018X）。

通信作者：趙志新（1982—），男，河南滑縣人，博士，講師，從事藥用植物轉(zhuǎn)錄組代謝及基因組進(jìn)化研究。E-mail：zxzhao@slxy.edu.cn。

三萜皂苷類化合物在自然界中分布廣泛，菌類、蕨類、單子葉植物、雙子葉植物、動(dòng)物及眾多海洋生物均可產(chǎn)生，尤以雙子葉植物含量最佳。目前在人參、三七等藥用植物中的研究比較成熟，同時(shí)在桔梗中三萜皂苷的含量也比較高[1]。三萜皂苷是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，具有抗癌、抗病毒、降低膽固醇等藥理作用[2]，但三萜皂苷結(jié)構(gòu)和生物合成途徑復(fù)雜，在植物產(chǎn)量低，提取成本高，因此，對(duì)三萜皂苷生物合成途徑研究并通過合成生物學(xué)等方法生產(chǎn)三萜皂苷已成為研究熱點(diǎn)，合成生物學(xué)在三萜類藥效成分或其前體的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用方面具有廣闊前景[3-6]。

達(dá)瑪烷合成酶（dammarenediolsynthase，簡稱DS）和β-香樹脂合成酶（β-amyrin synthase，簡稱β-AS）同屬氧化鯊烯環(huán)化酶（oxidosqualene cyclase，簡稱OSC）家族，催化2，3-氧化鯊烯環(huán)化合成達(dá)瑪烷二醇和β-香樹素，它們分別是合成達(dá)瑪烷型和齊墩果烷型三萜皂苷的關(guān)鍵酶[1]。近年來，隨著植物次生代謝途徑（甾醇類化合物、丹參酮和紫杉醇等生物合成途徑）及其關(guān)鍵酶基因研究的深入，越來越多的關(guān)鍵酶基因被克隆，通過基因工程和合成生物學(xué)的方式對(duì)藥用植物進(jìn)行遺傳改良，提高藥用植物體內(nèi)甾醇類化合物、丹參酮、紫杉醇的產(chǎn)量，已成為最有發(fā)展?jié)摿Φ漠a(chǎn)業(yè)之一，達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶是此類物質(zhì)合成中2種關(guān)鍵的分支代謝控制酶[7]。

本研究通過查閱相關(guān)資料，搜集已公布的植物中達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶序列，通過生物信息學(xué)工具，對(duì)這2種酶進(jìn)行理化性質(zhì)分析、糖基化位點(diǎn)預(yù)測、信號(hào)肽預(yù)測、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測以及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建等方面綜合研究分析，以便更加深入地理解達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶的蛋白特性，并預(yù)測不同植物之間的親緣關(guān)系，為以后研究這2種酶的酶學(xué)特征及三萜皂苷代謝提供借鑒。

1?材料與方法

1.1?材料

通過查閱文獻(xiàn)，并登陸NCBI檢索已公布的植物中達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶序列（包括核苷酸序列及其相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列），共獲得4種植物的10條達(dá)瑪烷合成酶序列及22種植物的30條β-香樹脂合成酶序列（表1）。

1.2?方法

氨基酸序列的理化性質(zhì)的分析使用Expasy網(wǎng)站提供的的ProtParam在線工具（https：//web.expasy.org/protparam/）;通過NetNGlyc 1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）在線工具分別分析糖基化位點(diǎn); 使用SignalP 4.1在線工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）預(yù)測信號(hào)肽;通過SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu);最后使用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同植物達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶氨基酸序列的理化性質(zhì)分析

2.1.1?不同植物的達(dá)瑪烷合成酶氨基酸序列的理化性質(zhì)?由表2可知，各植物的達(dá)瑪烷合成酶基因全長上在2 280～2 540 bp 之間，且在大多在2 310 bp左右;氨基酸數(shù)目均為769個(gè)，表現(xiàn)出高度的保守性。谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）均為含量豐富的氨基酸，從而可知這3種氨基酸對(duì)于達(dá)瑪烷合成酶的組成和結(jié)構(gòu)具有重要作用。正電荷殘基[精氨酸（Arg）+賴氨酸（Lys）]大多為85個(gè)，只有越南人參為84個(gè)，負(fù)電荷殘基[天冬氨酸（Asp）+Glu]為91個(gè)或92個(gè)。pI值在6.40 左右，而不穩(wěn)定指數(shù)各不相同;脂肪指數(shù)均在80.00左右，且相差極小。這4種植物的10條達(dá)瑪烷合成酶序列在氨基酸數(shù)目、種類及比例、分子量、理論pI、正負(fù)電荷殘基和脂肪指數(shù)上都表現(xiàn)出高度的一致性。由此可知，達(dá)瑪烷合成酶氨基酸序列存在高度的保守性。

2.1.2?不同植物的β-香樹脂合成酶氨基酸序列的理化性質(zhì)

由表3可知，22種植物的30條β-香樹脂合成酶的基因序列全長除蒺藜苜蓿1（其基因序列未知）外，其他均在2 000～2 800 bp之間;氨基酸數(shù)目除熊膽草為672個(gè)，其他植物在690～780個(gè)之間，表現(xiàn)出較強(qiáng)的保守性。除豌豆含量最豐富的氨基酸為Glu、Leu、異亮氨酸（Ile）外，其他植物均是Leu、Glu和Gly，而吡咯賴氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）為β-香樹脂合成酶序列中都不存在的氨基酸。正電荷殘基在67～81個(gè)之間，負(fù)電荷殘基在76～94個(gè)之間，并且各序列中負(fù)電荷殘基均大于正電荷殘基數(shù)，pI值在5.89～6.41 之間，脂肪指數(shù)為80左右，而不穩(wěn)定指數(shù)各不相同。這22種植物的β-香樹脂合成酶氨基酸序列在氨基酸數(shù)目、種類及比例、分子量、理論pI、正電荷殘基、負(fù)電荷殘基和脂肪指數(shù)上都表現(xiàn)出較強(qiáng)的一致性。由此可知，β-香樹脂合成酶氨基酸序列在理化性質(zhì)方面具有較強(qiáng)的保守性。

2.2?不同植物達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶糖基化位點(diǎn)分析

2.2.1?不同植物達(dá)瑪烷合成酶糖基化位點(diǎn)分析

由表4可知，這10條達(dá)瑪烷合成酶序列的最可能糖基化位點(diǎn)無一例外均是551 NPSE處，同時(shí)可能性均在0.673 2或0.673 3，N-糖基化結(jié)果也都是在551 NPSE處為++。說明達(dá)瑪烷合成酶糖基化位點(diǎn)在這10條序列中具有高度的保守性和統(tǒng)一性。

2.2.2?不同植物β-香樹脂合成酶糖基化位點(diǎn)的預(yù)測分析

表5顯示，β-香樹脂合成酶糖基化位點(diǎn)相較于達(dá)瑪烷合成酶

具有明顯的差異性和多樣性，糖基化位點(diǎn)數(shù)量從1～3個(gè)不等;可以看出可能性最大處基本上都在550附近。并且大豆（2）的可能性高達(dá)0.914 7，預(yù)測結(jié)果中大豆（2）、綠玉樹和木欖均有“+++”，顯示這3條序列有極大的可能性有糖基化位點(diǎn)。

2.3不同植物達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析

2.3.1?不同植物達(dá)瑪烷合成酶信號(hào)肽分析

使用Signal P 4.1 Server在線工具，首先對(duì)越南人參達(dá)瑪烷合成酶信號(hào)肽進(jìn)行分析（圖1）。結(jié)果表明，越南人參瑪烷合成酶中不存在信號(hào)肽，而且信號(hào)肽值（S值）和結(jié)合剪切位點(diǎn)值（Y值）均都是非常低的，所以可以推斷越南人參DS蛋白經(jīng)過核糖體合成后，所得到的蛋白質(zhì)為非分泌蛋白。同時(shí)對(duì)其他9條序列瑪烷合成酶分析，得到與越南人參近似的結(jié)果，即均不含有信號(hào)肽，都可能為非分泌蛋白。

2.3.2?不同植物β-香樹脂合成酶信號(hào)肽分析

使用Signal P 4.1 Server在線工具， 首先對(duì)珠子參β-香樹脂合成酶信號(hào)肽進(jìn)行分析（圖2）。結(jié)果表明，珠子參β-香樹脂合成酶也不存在信號(hào)肽，而且S值和Y值都是非常低的，所以可以推斷珠子參的β-香樹脂合成酶同達(dá)瑪烷合成酶一樣，為非分泌蛋白。同時(shí)，對(duì)其他29條序列進(jìn)行分析，也得到與珠子參近似的結(jié)果，即均不含有信號(hào)肽，都可能為非分泌蛋白。

2.4?不同植物達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.4.1?不同植物達(dá)瑪烷合成酶二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

由表6可知，4種植物的10條達(dá)瑪烷合成酶序列中二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋呈現(xiàn)的概率最高，為43%左右;其次為無規(guī)卷曲，出現(xiàn)的概率在36%左右;延伸鏈的概率在13%左右;而β-轉(zhuǎn)角出現(xiàn)的概率最低，是7%左右。除此之外，無其他結(jié)構(gòu)存在，且各鏈中各二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的比例都十分接近。說明達(dá)瑪烷合成酶二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主，且不同植物中二級(jí)結(jié)構(gòu)十分相似，表明瑪烷合成酶在二級(jí)結(jié)構(gòu)層面具有很高的保守性。

2.4.2?不同植物β-香樹脂合成酶二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

由表7可知，類似于達(dá)瑪烷合成酶的結(jié)果，22種植物的30條β-香樹脂合成酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋呈現(xiàn)的概率最高，在45%左右，其次是無規(guī)卷曲，為35%左右，延伸鏈呈現(xiàn)的概率為13%上下，而β-轉(zhuǎn)角比例最低，為7%左右。除此之外，均無其他二級(jí)結(jié)構(gòu)存在;同樣，各鏈中各結(jié)構(gòu)的比例均十分接近。從而推測這些β-香樹脂合成酶來源于同源蛋白，其功能發(fā)揮與其特定的二級(jí)結(jié)可能有關(guān)，同時(shí)說明β-香樹脂合成酶在二級(jí)結(jié)構(gòu)層面也具有很高的保守性。

2.5?不同植物達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

綜合前面分析結(jié)果，初步判斷這4種植物的10條達(dá)瑪烷合成酶和22種植物的30條β-香樹脂合成酶具有很高的保守性及同源性。為進(jìn)一步分析這2種不同酶的親緣進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 6.0軟件，使用Neighbor-joining算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.5.1?不同植物達(dá)瑪烷合成酶系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

由圖3可知，以Neighbor-joining算法構(gòu)建的達(dá)瑪烷合成酶系統(tǒng)進(jìn)化樹可聚成三大支。首先越南人參單聚為一大支，它與其他序列距離最遠(yuǎn);其次人參（1、2和3）和西洋參（1、2和3）距離較近，可以聚為一支;最后三七（1、2和3）聚為一支，它與其他序列最遠(yuǎn)。在進(jìn)化樹中可以明顯看出，同一物種不同序列首先聚為一支（西洋參2除外），這也與傳統(tǒng)的植物分類結(jié)果相符。

2.5.2?不同植物β-香樹脂合成酶系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

由圖4可知，以Neighbor-joining算法構(gòu)建的β-香樹脂合成酶系統(tǒng)進(jìn)化樹可聚成三大支。首先長春花、積雪草和人參（3）可聚為一類;其次以竹節(jié)參、珠子參、西洋參（1和2）、柴胡、人參（1和2）、龍牙楤木、番茄、麻花秦艽、東北白樺、綠玉樹、木欖、熊膽草和青蒿可為一支;最后蒺藜苜蓿 （1、2和3）、豌豆（1和2）、大豆（1和2）、光果甘草（1和2）、烏拉爾甘草和細(xì)葉遠(yuǎn)志可聚為一支。該結(jié)果基本與傳統(tǒng)的植物分類結(jié)果相一致，顯示β-香樹脂合成酶系統(tǒng)進(jìn)化樹與植物本身進(jìn)化關(guān)系相一致。

3?討論與結(jié)論

本研究搜集4種植物的10條達(dá)瑪烷合成酶序列，以及22種植物的30條β-香樹脂合成酶序列，利用生物信息學(xué)工具對(duì)這2種代謝關(guān)鍵酶的理化性質(zhì)、蛋白特性及進(jìn)化親緣關(guān)系等進(jìn)行了較為全面的分析。理化性質(zhì)分析顯示， 這2種酶的氨基酸序列在氨基酸數(shù)目、種類及比例、分子量、理論pI、正電荷殘基數(shù)、負(fù)電荷殘基數(shù)和脂肪指數(shù)上都表現(xiàn)出較強(qiáng)的一致性，由此可以推測，達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶的氨基酸序列在理化性質(zhì)方面具有較強(qiáng)的保守性，這與達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶為三萜皂苷代謝的關(guān)鍵酶的特性相符合[1]。同時(shí)研究表明，10條達(dá)瑪烷合成酶和30條β-香樹脂合成酶的糖基化位點(diǎn)具有高度的保守性和統(tǒng)一性，這與理化性質(zhì)的分析結(jié)果相一致;并且大豆（2）、綠玉樹和木欖這3條β-香樹脂合成酶序列有極大的可能性有糖基化位點(diǎn)。

蛋白信號(hào)肽預(yù)測分析表明，達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶沒有明確的信號(hào)肽，推測這2種酶不屬于分泌蛋白，而是直接在合成部位行使催化功能，不須要分泌轉(zhuǎn)運(yùn)到外部，并且研究已證明西洋參中β-香樹脂合成酶屬于非分泌型蛋白及非跨膜蛋白[8]，這與本研究結(jié)果相一致。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是多肽鏈中主要存在結(jié)構(gòu)元件，并且分散在整個(gè)多肽鏈中，表明這2種酶具有明顯的一致性，從而推測這2種酶功能的發(fā)揮與其特定的二級(jí)結(jié)可能有關(guān)。雖然這10條達(dá)瑪烷合成酶和30條β-香樹脂合成酶來源于不同的植物科屬，但由于氨基酸理化特性及二級(jí)結(jié)構(gòu)等方面總體比較相似，因此進(jìn)化樹也表現(xiàn)出差異較小的特點(diǎn)，并且聚類分支也與該序列的科屬特性相一致;同時(shí)研究也表明，人參達(dá)瑪烷合成酶與西洋參、三七、積雪草、長春花、大豆和烏拉爾甘草等進(jìn)化分析的結(jié)果與植物種屬之間的自然進(jìn)化關(guān)系相一致[9]。

綜合以上結(jié)果分析表明，達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶在理化性質(zhì)、糖基化位點(diǎn)、信號(hào)肽和二級(jí)結(jié)構(gòu)等方面均表現(xiàn)出極高的一致性，表明這2種酶具有很高的同源性，并且它們基因的保守性也較高，同時(shí)進(jìn)化分析與傳統(tǒng)的種屬分類結(jié)果相一致。本研究通過對(duì)不同來源的達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這2種酶均具有較高的保守性特征，為將來利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)這2種酶提供參考。同時(shí)，對(duì)達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶蛋白特性及親緣關(guān)系的解析，能夠更清楚地揭示酶的保守結(jié)構(gòu)域及進(jìn)化變異，為進(jìn)行基因工程改造和分子進(jìn)化研究提供借鑒，本研究也可為分析達(dá)瑪烷合成酶和β-香樹脂合成酶酶學(xué)特征及三萜皂苷代謝提供幫助。

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