噬菌體在多重耐藥菌創(chuàng)傷性感染治療中的作用

褚國煜，李曉宇,2,4，王麗麗,2,4，李淑英，徐永平,,*

(1 大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116024；2 教育部動物性食品安全保障技術(shù)工程研究中心，大連 116600；3 大連賽姆生物工程技術(shù)公司, 大連 116620;4 遼寧省大連賽姆噬菌體應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，大連 116600)

1 引言

自1928年弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來[1]，抗生素給人類帶來了巨大益處，但細(xì)菌的耐藥性也不容忽視。細(xì)菌的耐藥性是其固有的屬性，抗生素的使用會加速細(xì)菌耐藥性基因的傳播[2,3]，細(xì)菌的耐藥性由單一耐藥性發(fā)展至多重耐藥性。2017年2月底，世界衛(wèi)生組織(WHO)公布了一份列有12種“超級細(xì)菌”的名單，并根據(jù)這些病原菌耐藥性的強弱分為三個等級：極為重要、十分重要、中等重要。研發(fā)新型藥物用以對抗超級細(xì)菌刻不容緩。

噬菌體自上世紀(jì)發(fā)現(xiàn)開始，就被前蘇聯(lián)和東歐國家的學(xué)者們應(yīng)用于細(xì)菌感染的臨床治療[4]，但由于抗生素的使用而漸漸被人們遺忘?！昂罂股貢r代”即將到來，為尋求有效的藥物對抗超級細(xì)菌，噬菌體治療重新出現(xiàn)在人們的視線中。本文就利用噬菌體治療耐藥細(xì)菌細(xì)菌的機制進(jìn)行闡述。

2 抗生素的濫用

抗生素的發(fā)現(xiàn)和大規(guī)模生產(chǎn)與使用是人類醫(yī)學(xué)史上的巨大進(jìn)步，挽救了數(shù)以億計的生命。除用于臨床治療外，自上世紀(jì)50年代，美國食品與藥品管理局(FDA)首次批準(zhǔn)將抗生素添加在飼料中，隨后抗生素被大規(guī)模應(yīng)用與動物養(yǎng)殖業(yè)，在預(yù)防和治療動物的傳染性疾病、促進(jìn)動物動物生長以及提高飼料轉(zhuǎn)化率等發(fā)揮了重要的作用[5]。抗生素的大規(guī)模的使用讓人們享受到抗生素帶來的益處的同時，學(xué)者們也意識到了隨之而來的細(xì)菌耐藥性問題。我們即將進(jìn)入“后抗生素時代”，即越來越多的細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重威脅了人類的生存和健康，全球?qū)⒚媾R藥品無效，好像回到了以前沒有抗生素的時代。

3 多重耐藥細(xì)菌

3.1細(xì)菌的耐藥性的機理

細(xì)菌的耐藥性一般分兩類：一類是其固有的耐藥性，不依賴于抗菌藥物；它是細(xì)菌穩(wěn)定的遺傳特性，受自身染色體DNA控制；另一類是獲得性耐藥性，是指在選擇壓力存在的情況下經(jīng)過基因突變或細(xì)菌在生長過程中由于移動耐藥因子的轉(zhuǎn)移而獲得的一種表型。其中移動耐藥因子包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、噬菌體等。獲得性耐藥性主要包括移動因子和抗菌藥壓力作用下引起基因突變所導(dǎo)致的耐藥性[6]，其作用機制如下圖1[7]。

3.2 多重耐藥細(xì)菌的感染現(xiàn)狀

2017年2月，WHO公布了12種“超級細(xì)菌”的名單，將12種細(xì)菌根據(jù)耐藥性的強弱細(xì)菌傳播難易程度和需新型抗生素的迫切性等將它們分為極為重要、十分重要和中等重要三級。（1）3類極為重要：對碳青霉烯類抗生素耐藥的細(xì)菌：鮑曼不動桿菌，銅綠假單胞菌，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)腸桿菌科。（2）6類十分重要：萬古霉素耐藥屎腸球菌，甲氧西林耐藥、萬古霉素中介和耐藥金黃色葡萄球菌，克拉霉素耐藥幽門螺旋桿菌，氟喹諾酮類藥物耐藥彎曲菌屬，氟喹諾酮類藥物耐藥沙門菌，頭孢菌素耐藥、氟喹諾酮類藥物耐藥淋病奈瑟菌。（3）3類中等重要：青霉素不敏感肺炎鏈球菌，氨芐西林耐藥流感嗜血桿菌，氟喹諾酮類藥物耐藥志賀菌屬。另一方面，美國感染病學(xué)會的抗生素效益評估小組經(jīng)調(diào)查后認(rèn)為屎腸球菌(Entcrococcus faccium)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aurcus)，肺炎克需伯菌(Klcbsiclla pncumoniac)，鮑曼不動桿菌(Acinctobactcr baumannii)，銅綠假單胞菌(Pscudomonas acruginosa)及腸桿菌屬(Entcrobactcr spccics)等6類細(xì)菌耐藥情況極度嚴(yán)峻，取其各自拉丁文名稱首字母而簡稱ESKAPE。

2015年WHO提供的數(shù)據(jù)顯示，全球每年約有70萬人死于“超級細(xì)菌”等耐藥菌感染，到2050年，這一數(shù)字有可能突破千萬，超過目前死于癌癥的人數(shù)。近年來，一方面，沒有新型的抗生素進(jìn)入市場也沒有有效的抗生素替代品的廣泛使用，另一方面由于抗生素的濫用，藥物的殘留物以及耐藥性微生物本身存在于水、土壤和空氣中大大加速了細(xì)菌的耐藥性產(chǎn)生。世界動物衛(wèi)生組織(國際獸疫局)總干事Monique Eloit博士等發(fā)起呼吁：面對“超級細(xì)菌”需要立即行動。1996年，傳染性疾病的權(quán)威及諾貝爾獎獲得者Lederberg博士在PNAS的評論中指出：因耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)，抗生素治療不再像以前那樣有效，應(yīng)該重視噬菌體作為抗菌治療生物制劑的研究[8]。

4 噬菌體治療“超級細(xì)菌”感染

4.1 噬菌體治療機理

圖1 多重耐藥菌的機制模型

噬菌體是一類能夠感染細(xì)菌、真菌、放線菌等的微生物的總稱。根據(jù)噬菌體對其宿主菌的作用方式的不同，可將噬菌體分為兩類：溫和噬菌體和烈性噬菌體。溫和型噬菌體侵染細(xì)菌后，會將自身的遺傳物質(zhì)與宿主細(xì)胞的核染色體整合到一起，隨著宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)的復(fù)制而復(fù)制，噬菌體自身不會大量增殖，宿主細(xì)胞也不會被裂解。而烈性噬菌體在侵染其特異性的敏感菌株之后，會在宿主菌細(xì)胞內(nèi)迅速并大量繁殖，從而裂解宿主細(xì)胞并從中釋放、再侵染其他細(xì)胞。烈性噬菌體裂解宿主細(xì)胞一般分為五個步驟：吸附、穿入、增殖、裝配、釋放。根據(jù)烈性噬菌體的這一特性，學(xué)者們將其運用于治療一些難以被抗生素治愈的細(xì)菌。

4.2 噬菌體治療銅綠假單胞菌

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aerugonosa)，在醫(yī)學(xué)上被稱為綠膿桿菌，是院內(nèi)感染的重要病原菌。中國衛(wèi)生部國家細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)(MOHNARIN)2017年12月發(fā)布的《2016年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報告》(以下簡稱《監(jiān)測報告》)中，對上報數(shù)據(jù)的1397所各級醫(yī)院進(jìn)行統(tǒng)計，銅綠假單胞菌有246242株，約占革蘭陰性菌的12.7%，在革蘭陰性菌耐藥性中排名第三。在報告中指出的銅綠假單胞菌是對碳青霉烯類藥物耐藥是指對亞胺培南或美羅培南任一藥物耐藥。銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率全國平均為22.3%，與2015年基本持平；不同地區(qū)銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物耐藥率為9.8%～31.6%，其中遼寧省最高，為31.6%，湖南省最低，為9.8%[9]。

Watanabe等[10]，以小鼠為實驗對象，應(yīng)用分離到的噬菌體KPP10治療由銅綠假單胞菌引起的小鼠腸源性敗血病，有效率達(dá)66.7%。在此實驗的基礎(chǔ)上，McVay的小組[11]進(jìn)行了針對性更強的實驗。他們把分離到的3株銅綠假單胞菌噬菌體混合在一起，通過肌肉、皮下或腹腔注射的方式，來治療由于燒傷而感染銅綠假單胞菌的小鼠，結(jié)果顯示：這3種給藥方式都能有效地提高小鼠的成活率(由6%上升到22%～87%)，其中腹腔注射效果最好(高達(dá)87%)，這在一定程度上推動了噬菌體的臨床應(yīng)用。Krylov等[12]評估了噬菌體療法在根除耐藥銅綠假單胞菌引起的兒童囊性纖維化(CF)的潛在應(yīng)用，利用單一致病菌和噬菌體混合制劑。允許簡單且快速地增強雞尾酒的裂解譜，允許開發(fā)適合的能夠規(guī)避與噬菌體抗性細(xì)菌突變體相關(guān)的策略。Furusawa等[13]評估了噬菌體分離株的宿主范圍和它們裂解抗生素抗性銅綠假單胞菌的能力，目前的噬菌體可以裂解許多銅綠假單胞菌菌株(28/39)，包括對氟喹諾酮類具有高抗性的菌株(4/6)?？傊?，抗生素耐藥細(xì)菌的噬菌體的應(yīng)用是非常有效的。為了避免普遍的抗生素耐藥細(xì)菌，需要進(jìn)一步開發(fā)用于疾病治療的噬菌體。Xu等[14]以醫(yī)院臨床上分離到的銅綠假單胞菌為宿主菌，從環(huán)境污水中分離純化銅綠假單胞菌噬菌體D204，當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.1和1時，對宿主菌生長有抑制作用，在180min后可完全抑制宿主菌生長。銅綠假單胞菌噬菌體D204具有較強的裂解宿主的能力，其對酸堿和熱比較穩(wěn)定，裂解宿主時潛伏期較短，可以作為銅綠假單胞菌的儲備噬菌體。Didamony等[15]在埃及的污水樣品中分離出兩個命名為φPSZ1和φPSZ2的噬菌體，感染多重耐藥銅綠假單胞菌。兩種噬菌體都能夠感染13種不同的銅綠假單胞菌菌株，并且對其它測試的細(xì)菌沒有影響。這些結(jié)果表明兩種噬菌體具有用于控制銅綠假單胞菌的高潛力的噬菌體應(yīng)用。

4.3 噬菌體治療鮑曼不動桿菌

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii AB)是一種革蘭陰性致病菌細(xì)菌，中國衛(wèi)生部國家細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)(MOHNARIN)2017年12月發(fā)布的《監(jiān)測報告》中，鮑曼不動桿菌共208689株，占革蘭陰性菌的10.8%，排名第四。與銅綠假單胞菌相似，鮑曼不動桿菌也是對碳青霉烯類藥物特別是亞胺培南或美羅培南任一藥物耐藥。鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率全國平均為60.0%，較2015年上升了1%；不同地區(qū)鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物耐藥率范圍是24.8%～81.2%，其中河南省最高，為81.2%，天津市最低，為24.8%[9]。

傳統(tǒng)噬菌體治療的給藥方式主要為口服和皮下注射兩種，而以注射的給藥方式還處于動物實驗階段。2017年，美國歷史上首例通過靜脈注射“雞尾酒”噬菌體治療多重耐藥鮑曼不動桿菌感染患者，在經(jīng)過200多天的治療痊愈出院。由于采取多種抗生素乃至粘菌素等藥物對患者體內(nèi)感染的細(xì)菌都未見效果，F(xiàn)DA特批噬菌體作為緊急研究新藥(emergency investigational new drug eIND)以用于治療該患者。Robert等[16]篩選出九種對患者體內(nèi)感染的鮑曼不動桿菌具有活性的噬菌體，美國生物防御研究局(Biological Defense Research Directorate BDRD)以及海軍醫(yī)學(xué)研究中心(Naval Medical Research Center NMRC)兩個研究中心從環(huán)境中篩選出200余種的噬菌體為原料，并從中篩選出98種對患者體內(nèi)噬菌體有吞噬效果的噬菌體，后將這98種噬菌體進(jìn)行再次的分離鑒定，幾種噬菌體混合使用效果明顯優(yōu)于單獨使用，因此制備為多種不同的“雞尾酒”噬菌體試劑，分別命名為I、II、III、IV。前3個月的臨床過程中不可避免地出現(xiàn)下坡癥狀，在開始靜脈內(nèi)噬菌體治療的48h內(nèi)觀察到了明顯的變化。在通過靜脈內(nèi)注射施用5×109PFU噬菌體之前和之后5min收集的血漿樣品表明全身循環(huán)中的噬菌體滴度從0PFU/ mL迅速增加至1.8×104PFU/mL。 噬菌體效價下降30min為4.4×103PFU/mL，60min下降3.3×102PFU/mL，注射后120min下降20 PFU/mL。采取注射的初期，體內(nèi)的產(chǎn)生了噬菌體抗性，而在注射后期通過對患者體內(nèi)生理指標(biāo)的檢測，發(fā)現(xiàn)噬菌體能夠改善鮑曼不動桿菌對米諾環(huán)素等抗生素的敏感性，也有文章證實噬菌體與抗生素之間存在某種協(xié)同作用，于是聯(lián)合施用噬菌體與抗生素，在膽囊腔和第三腹腔進(jìn)行注射，通過長期的治療，病人得到痊愈并開始了正常的生活。

5 展望與發(fā)展

在抗生素泛濫的時代人們無可避免的要面對細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素耐藥性問題，廣泛的使用抗生素?zé)o疑加劇了多重耐藥菌，乃至超級細(xì)菌的產(chǎn)生。面對這些問題，尋求新的有效藥物已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急，噬菌體是一種綠色、高效的治療方法，因其來源廣泛、宿主專一性高等為人們治療“超級細(xì)菌”提供了新思路。細(xì)菌耐藥性的發(fā)展速度遠(yuǎn)比人們開發(fā)新型抗生素的速度要快得多，單純的使用抗生素治療并不是長遠(yuǎn)之計，噬菌體治療為人類以及動植物的細(xì)菌創(chuàng)傷性感染開啟了新的紀(jì)元。