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    我國主產(chǎn)地溫石棉可吸入纖維致鼠肺損傷與抑癌基因p53、p16的表達

    2019-11-28 05:15:10曾婭莉鄒文蓉董發(fā)勤張青碧鄧建軍
    巖石礦物學雜志 2019年6期
    關(guān)鍵詞:石棉染毒粉塵

    曾婭莉,崔 琰,鄒文蓉,馬 驥,董發(fā)勤,張青碧,鄧建軍,楊 潔,高 ●

    (1. 四川綿陽四○四醫(yī)院, 四川 綿陽 621000; 2. 西南醫(yī)科大學, 四川 瀘州 646000; 3. 西南科技大學, 四川 綿陽 621000)

    吸入性粉塵可引起呼吸、心血管、血液系統(tǒng)甚至病毒傳播等疾病(Guanetal., 2016; Wangetal., 2016; Yeetal., 2016; Gaoetal., 2017),危害人體健康。我國是溫石棉生產(chǎn)和使用大國,人們在生產(chǎn)和使用過程中產(chǎn)生大量吸入性纖維粉塵,污染環(huán)境。國際上對溫石棉的安全性一直存在較大爭議,長期吸入這些粉塵是否致肺損傷或肺癌性未知。國外研究資料(Bernsteinetal., 2013; Gaoetal., 2015; Bauretal., 2015; Gilhametal., 2016)顯示,溫石棉具有致間皮瘤或者肺癌的風險。國內(nèi)關(guān)于可吸入性溫石棉纖維粉塵的安全性研究較少,杜利利等(2014)的流行病學調(diào)查顯示長期接觸溫石棉的礦工,其肺癌、石棉肺、肺心病、呼吸系統(tǒng)疾病的死亡率明顯提高。近年來本課題組一直從事溫石棉粉塵職業(yè)病和安全性的基礎(chǔ)性研究。曾婭莉等(2013)通過細胞培養(yǎng)技術(shù)、體外分析比較了四川新康及陜西陜南溫石棉的安全性,結(jié)果顯示兩種溫石棉對細胞生長具有較強抑制作用,顯著下調(diào)p16和p53蛋白,有誘導癌癥發(fā)展的風險。柏●等(2017)采用多次非暴露式氣管滴注的染毒法研究了四川新康溫石棉纖維粉塵對雄性Wistar大鼠肺組織的危害,檢測了各項生化指標,結(jié)果顯示四川新康溫石棉纖維粉塵可致大鼠肺損傷。王玉琳等(2018)研究發(fā)現(xiàn)溫石棉可通過ROS途徑激活線粒體凋亡通路,誘導A549細胞發(fā)生凋亡。黃鳳德等(2018)分析了四大礦區(qū)溫石棉的物相成分、譜學特征等,研究比較了四大礦區(qū)溫石棉對A549細胞的生長抑制和細胞周期的影響,實驗結(jié)果顯示四大礦區(qū)溫石棉的主要物相是斜纖蛇紋石,但不同產(chǎn)地的溫石棉結(jié)構(gòu)表面完善性、化學基團存在差異,4種溫石棉纖維粉塵均于G2/M期阻滯A549細胞。由于青海茫崖、甘肅阿克塞、陜西陜南和四川新康礦區(qū)是我國溫石棉主要產(chǎn)地,目前尚缺乏對4種主產(chǎn)地的溫石棉纖維粉塵在生物體內(nèi)對呼吸系統(tǒng)損傷和致癌風險的比較和評估。課題組在前期研究的基礎(chǔ)上,選取由我國四大礦區(qū)溫石棉制備成的可吸入纖維粉塵,研究比較了可吸入溫石棉粉塵對Wistar大鼠肺組織的有無損傷及損程度,同時檢測了大鼠的抑癌基因p53、p16,評估其有無致癌風險,從體內(nèi)和分子水平探討了我國四大礦區(qū)可吸入性溫石棉的生物安全性,欲為環(huán)境檢測和職業(yè)病防護提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗對象

    實驗對象為體重180~200 g的Wistar雄性大鼠,購買自華西醫(yī)科大學SP級實驗動物中心。四大礦區(qū)溫石棉分別采自青海省茫崖礦區(qū)、甘肅省阿克塞礦區(qū)、陜西省陜南礦區(qū)和四川省新康礦區(qū)。

    1.1.2 試劑和儀器

    試劑有HE試劑(武漢博士德生物工程有限公司)、Triol試劑提取盒(北京TIANGEN BIOTECH CO,LTD)、Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser和PCR試劑(大連Takara公司),引物由Takara公司設(shè)計。

    儀器有高速多功能粉碎機(RH-800,浙江榮浩工貿(mào)有限公司)、臥式行星球磨機(QM-3SP4J,南京大學儀器廠)、激光粒度分析儀(90 plus,美國Brookhaven公司)、紅外光譜儀(Spectrum One,美國PE公司)、RT-PCR擴增儀(Mastercycler X50h,德國Eppendorf公司)、DNA/RNA測定儀(ND-1000,美國Nano Drop)、凝膠電泳成像系統(tǒng)(GelDocXR,美國BIO-RAD公司)、凝膠電泳掃描儀(GE Image scanner III,美國GE Healthcare公司)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 可吸入溫石棉纖維粉塵的制備

    4種產(chǎn)地的可吸入溫石棉纖維由高速粉碎機初步粉碎至 60目,按照粒料液(無水乙醇)比1∶1,用球磨機濕磨,檢測纖維粒徑。當纖維粒徑約為5 μm時收集礦漿,120 ℃烘干,再次磨碎,400目過篩,高壓滅菌,加生理鹽水配置成8 mg/mL儲存液,備用。

    1.2.2 粉塵染毒W(wǎng)istar雄性大鼠造模

    將8~10 周齡健康未成年Wistar雄性大鼠54只,隨機分為3組即2 mg/mL染毒組、陰性和陽性對照組,每組18只,分籠喂養(yǎng),適應性喂養(yǎng)1 周。將4種溫石棉儲備液分別稀釋為2.0 mg/mL應用液,加入青霉素鈉8 000 U/mL,超聲處理30 min,采用非暴露式氣管滴注法染毒W(wǎng)istar雄性大鼠,每次滴注0.5 mL,間隔1個月滴注1次。陽性對照組將苯并芘溶于玉米油配成40 mg/mL染毒液,陰性對照組使用生理鹽水,每次滴注0.1 mL。滴注后大鼠自由飲水、進食,觀察其生長、發(fā)育及活動等一般情況。

    1.2.3 纖維粒徑、物相和化學成分特征

    采用90 plus激光粒度分析儀檢測各組溫石棉纖維粒徑,采用Spectrum One傅里葉變換紅外光譜儀分析研磨后的粉塵結(jié)構(gòu)和表面化學基團。

    1.2.4 肺組織臟器系數(shù)和病理檢測

    分別于染毒1、3及6 個月時稱重后處死Wistar大鼠,迅速分離肺組織并稱量,置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩istar大鼠的肺組織臟器系數(shù)=肺組織(g)/體重(g)。肉眼觀察處死Wistar大鼠的肺組織外觀,選取主支氣管周圍肺組織,生理鹽水反復沖洗。置10%福爾馬林溶液中固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,光學顯微鏡下觀察肺組織的病理變化。

    1.2.5 染毒W(wǎng)istar大鼠肺p53和p16基因檢測

    將處死Wistar大鼠的肺組織,按Triol試劑盒說明書提取總RNA,DNA/RNA測定儀檢測RNA的濃度和純度,調(diào)整RNA濃度一致,按照聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)試劑說明書進行PCR擴增。引物設(shè)計: p53引物,104pb,正向5’→3’: AGGAAATCCGTATGCTGAGTATCTG,反向5’→3’: GGATAGTGGTATAGTCGGAGCCG); p16引物, 97pb, 正向5’→3’CTAGAGCGGGGACATCACGA,反向5’→3’: AGCAGAAGTTATGCCTGTCGGT)。擴增條件:94℃變性2 min,94℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃20 s,循環(huán)35次,72℃終末延伸3 min。瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物,凝膠電泳成像系統(tǒng)對電泳條帶照相和灰度值的掃描,以β-actin為內(nèi)參對照。

    1.3 統(tǒng)計學處理

    2 結(jié)果

    2.1 纖維粉塵粒徑分布

    4種溫石棉纖維通過臥式行星球磨機濕磨20 h,收集樣本。采用90 plus激光粒度分析儀測定粒徑,結(jié)果見表1。從纖維粒度分布數(shù)據(jù)來看各纖維的平均粒徑均小于或接近5 μm,符合可吸入粉塵粒徑要求。

    表 1 濕磨法20 h的四大礦區(qū)溫石棉纖維粒度分布 μmTable 1 Particle size distribution of chrysotile fibers in four main mining areas with 20 h wet grinding

    注:d10對應的粒徑數(shù)據(jù)表示小于此粒徑的顆粒體積分數(shù)占全部顆粒的10%,d25、d50、d75以此類推。

    2.2 研磨前后粉塵的結(jié)構(gòu)和官能基團分析

    Salamatipour等(2016)研究顯示,研磨石棉的方法不同可顯著影響粉塵表面含鐵量,鐵可誘導細胞產(chǎn)生的活性氧,從而形成細胞毒性差異,并建議在研究石棉纖維的細胞毒性時應詳細描述粉塵制備方式。本研究中采用濕磨法,為了使研磨后的各樣品粒徑小于10 μm,又防止過度研磨破壞纖維表面結(jié)構(gòu)從而干擾實驗結(jié)果,通過紅外光譜分析了研磨后各纖維粉塵組化學基團,以分析研磨后的粉塵是否有理化性質(zhì)改變。

    Enrico等(2009)研究發(fā)現(xiàn),溫石棉的結(jié)晶度和OH-含量與其在動物體內(nèi)的溶解性、降解及細胞毒性相關(guān)。由圖1可見,經(jīng)過研磨后的4種溫石棉樣品的FT-IR圖譜的吸收峰的峰位峰形基本不變。 比較4種圖譜, 發(fā)現(xiàn)茫崖、陜南溫石棉在(1 622、1 618 cm-1)附近的吸收譜帶向高波數(shù)偏移,新康溫石棉在(1 630、1 455 cm-1)附近的吸收譜帶發(fā)生了偏移。這是由于紅外光譜對陽離子質(zhì)量和電價比較敏感,OH-伸縮振動頻率受到與OH-配位的八面體陽離子的影響產(chǎn)生分裂并向低波數(shù)方向位移。阿克塞和陜南溫石棉在1 060 cm-1附近的Si—O伸縮振動峰吸收帶分裂比茫崖和新康石棉明顯,表明這兩種溫石棉的表面結(jié)構(gòu)較茫崖和新康溫石棉的完善。通過上述分析,可初步確定4種溫石棉樣品為纖蛇紋石,研磨后的溫石棉粉塵結(jié)晶度和化學基團未發(fā)生明顯變化。

    2.3 肺組織外觀

    4種溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠1~6個月,肺組織病變基本相似,肺損傷程度與染毒時間呈正比,4種產(chǎn)地的溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠肺組織病變程度不同。與對照組相比,染毒1個月,Wistar大鼠肺組織體積變大,氣管周圍充血明顯,表面可見少量白色瘤狀突起,凹凸不平。染毒3個月,Wistar大鼠肺外觀充血明顯,體積比染毒1個月時縮小,肺組織塌陷,皺縮,肺表面的白色瘤狀增多。染毒6個月,Wistar大鼠肺體積進一步縮小,組織實變,彈性變差,充血明顯,肺組織表面凹凸不平加重,4種溫石棉染毒后肺組織均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見瘤變。圖2顯示的是茫崖溫石棉染毒W(wǎng)istar大鼠組肺外觀,其余各染毒組肺組織外觀相似。

    2.4 肺組織臟器系數(shù)

    與陰性對照組比較,染毒1 個月,4組溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠肺系數(shù)變化無顯著差異。染毒3個月,新康、茫崖和陜南溫石棉纖維粉塵染毒的Wistar大鼠體重明顯減輕,肺重量顯著增加,肺系數(shù)變大,變化具有顯著意義(P<0.05)。染毒6個月,4組溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠肺系數(shù)增大,變化具有顯著意義(P<0.05),如表2所示。染毒6個月,4組可吸入溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠肺組織臟器系數(shù)由大到小的順序均為: 新康>茫崖>阿克塞>陜南。

    圖 1 我國四大礦區(qū)溫石棉研磨后的FT-IR圖Fig.1 FT-IR diagrams of chrysotile grinding 20 h in four main mining areas of China

    圖 2 茫崖溫石棉染毒1、3、6個月Wistar大鼠肺組織外觀圖Fig.2 1, 3 and 6 months lung histomorphology of Wistar rats exposed to 2.0 mg/mL chrysotile asbestos in Mangya

    表 2 我國四大礦區(qū)溫石棉染毒1、3、6個月Wistar大鼠肺組織肺系數(shù)Table 2 Lung organ visceral coefficient of Wistar rats exposed to chrysotile asbestos fiber dust at the time in 1, 3, 6 months in four major mining areas of China

    a表示與對照組比較有顯著差異(P<0.05)。

    2.5 肺組織病理切片(HE染色)

    4組溫石棉染毒W(wǎng)istar大鼠肺組織均發(fā)生顯著的病理改變,出現(xiàn)不同程度的充血、水腫、炎性細胞和巨噬細胞浸潤,肺間隔增寬,平滑肌破壞,肺泡大小不均和數(shù)量減少。隨著粉塵作用時間延長,各染毒組Wistar大鼠肺病變逐漸加重,出現(xiàn)嚴重肺實變、纖維化,肺泡細胞大量破裂,肺組織塌陷。不同產(chǎn)地溫石棉致病變的方式不同,阿克塞溫石棉組的Wistar大鼠肺以出血和炎癥細胞浸潤為主,茫崖溫石棉組的Wistar大鼠肺以炎癥細胞浸潤為主,肺泡輕度改變;陜南和新康溫石棉組染毒的Wistar大鼠肺以肺間隔增寬、支氣管周圍炎性細胞浸潤病變?yōu)橹?圖3)。

    2.6 肺組織p53、p16基因檢測

    與陰性對照組相比,染毒1個月時各組p53基因表達無顯著性降低;染毒3個月時,除四川新康外各染毒組p53基因均降低,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);染毒6個月時各組p53基因進一步降低表達降低,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。p53基因降低趨勢由大到小為:阿克塞>陜南>茫崖>新康(圖4)。

    與陰性對照組相比,染毒1個月時除阿克塞溫石棉組外,其余各組p16基因表達均顯著性降低,染毒3~6個月各組p16基因表達進一步降低,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。p16基因表達降低趨勢由大到小為:新康>茫崖>阿克塞>陜南(圖5)。

    圖 3 四大溫石棉礦區(qū)可吸入纖維粉塵染毒W(wǎng)istar 大鼠的肺組織HE切片圖Fig.3 HE section of lung tissue of Wistar rats exposed to inhalable fiber dust at the time in 1, 3, 6 months in four main chrysotile asbestos mining areas

    3 討論

    3.1 溫石棉可改變肺組織外觀及肺臟系數(shù)

    由不同染毒時間Wistar肺組織外觀可見,我國四大產(chǎn)地可吸入溫石棉纖維粉塵均不同程度損害肺組織,使肺組織產(chǎn)生炎性或纖維化改變,但未見瘤樣組織。臟器系數(shù)是毒理實驗中常用指標,動物染毒后,受損臟器重量可發(fā)生改變,臟器系數(shù)也隨之改變。臟器系數(shù)增大,表示臟器充血、水腫或增生肥大等病變;臟器系數(shù)減小,表示臟器萎縮及其他退行性改變。與對照組比較,溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠1個月,肺臟系數(shù)無顯著性變化,染毒3~6個月,Wistar大鼠體重逐漸降低,肺組織重量逐漸增加,肺臟系數(shù)隨之增大,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。肺臟器系數(shù)和肺組織外觀結(jié)果顯示我國四大產(chǎn)地的溫石棉可吸入纖維粉塵可損害肺組織,使肺組織充血、水腫或肥大增生,隨之實變,損傷程度和病變方式隨產(chǎn)地不同。Kim等(2015)研究發(fā)現(xiàn)暴露于高濃度石棉環(huán)境中礦工體內(nèi)的肺石棉斑和肺纖維化顯著高于正常人,CT結(jié)果顯示胸膜石棉斑塊數(shù)量和大小不同。Lemaire等(1986)研究發(fā)現(xiàn)石棉肺病變特點是巨噬細胞積累,成纖維細胞增殖和膠原沉積。這些研究顯示溫石棉的可吸入纖維粉塵可致肺組織損傷,長期吸入可使肺組織纖維化,與本研究結(jié)果一致。

    圖 4 我國四大礦區(qū)溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠肺組織的p53基因表達Fig. 4 p53 gene expression in lung tissue of Wistar rats exposed to chrysotile asbestos fiber dust at the time in 1, 3, 6 months in four major mining areas of China

    圖 5 我國四大礦區(qū)溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠肺組織的p16基因表達Fig. 5 p16 gene expression in lung tissue of Wistar rats exposed to chrysotile asbestos fiber dust at the time in 1, 3, 6 months in four major mining areas of China

    3.2 溫石棉可致肺組織病理改變

    HE染色結(jié)果顯示,4種溫石棉可吸入纖維粉塵可不同程度和方式損傷肺組織結(jié)構(gòu),長期染毒均可使肺組織纖維化(圖2、圖3)。FT-IR分析結(jié)果顯示,溫石棉主要成分、化學基團與表面結(jié)構(gòu)的完善性與產(chǎn)地之間存在差異(圖1),這可能與4種產(chǎn)地溫石棉對生物安全性不同相關(guān)。溫石棉主要結(jié)構(gòu)為由硅氧(SiO2)四面體和Mg(OH)2八面體組成的具雙層型結(jié)構(gòu)的三八面體硅酸鹽礦物,不同產(chǎn)地溫石棉的SiO2和雜質(zhì)含量不同。Piao等(2001)研究顯示暴露于SiO2顆??芍麓笫蠓谓M織損傷,早期主要表現(xiàn)為炎癥,后期為肺間質(zhì)纖維化。4種不同產(chǎn)地溫石棉可吸入纖維粉塵對Wistar大鼠肺組織損傷程度與方式可能與SiO2和雜質(zhì)含量相關(guān)。

    關(guān)于溫石棉的細胞毒性和機制國內(nèi)有少量研究。查雨欣等(2017)研究發(fā)現(xiàn),新康和茫崖溫石棉可致大鼠體內(nèi)產(chǎn)生過量ROS,導致脂質(zhì)過氧化作用,抗氧化酶SOD耗竭或失代償,清除自由基的能力下降,造成大鼠肺氧化應激損傷,不同地域溫石棉氧化損傷作用存在差異。黃鳳德等(2018)研究顯示我國4大主產(chǎn)地的溫石棉均不同程度地抑制A549細胞增殖,誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期,推測溫石棉誘導細胞與凋亡大小與不同產(chǎn)地的化合物雜質(zhì)含量不同相關(guān)。曾婭莉等(2012)研究顯示溫石棉纖維對V79細胞具有細胞毒性,其毒性大小與溫石棉在有機酸中的溶蝕性相關(guān)。何靜等(2014)研究發(fā)現(xiàn)不同礦床的溫石棉,因生成條件不盡相同,表現(xiàn)活性基團不同,則對細胞的毒性不同,這些研究與本實驗結(jié)果相似,具體原因還需進一步研究。

    3.3 溫石棉降低肺p53、p16基因表達

    p53基因具有抑制細胞分裂、修復損傷的DNA以及誘導細胞凋亡等功能。p53基因時刻監(jiān)控著細胞染色體DNA的完整性,參與DNA的復制與修復,如果修復失敗,p53蛋白即啟動凋亡,誘導細胞自殺,從而防止細胞惡變。p16基因是參與細胞周期調(diào)控的基本基因,可調(diào)節(jié)細胞的增殖及分裂。目前研究資料認為p16是比p53更為重要的一種新型抗癌基因,有人把它比作細胞周期中的剎車裝置,一旦失靈則會導致細胞惡性增殖,導致惡性腫瘤發(fā)生。p53、p16基因是細胞周期重要的調(diào)控因子和抑癌基因,它可修復受損的DNA,避免細胞癌變,與肺癌的發(fā)病密切相關(guān)(Demirhanetal., 2010; Stankovicetal., 2014; Yangetal., 2017)。它們的降低,意味著個體容易發(fā)生癌變,檢測p53和p16基因?qū)δ[瘤的診斷具有十分重要的意義。

    本實驗檢測到我國四大產(chǎn)地的溫石棉可吸入纖維染毒W(wǎng)istar大鼠后均降低抑癌基因p16和p53表達,但不同產(chǎn)地的溫石棉纖維粉塵對p53與p16降低的程度不同。 Mishra 等(1997)研究顯示老鼠暴露于溫石棉纖維的氣溶膠24 h,免疫組化法檢測到p53蛋白升高,8 d開始下降,14 d后低于正常水平。曾婭莉等(2013)研究顯示我國四大產(chǎn)地的溫石棉均不同程度抑制V79細胞生長,下調(diào)p16和p53,有誘導癌癥發(fā)展的風險。葉微等(2015)研究顯示4種溫石棉的單細胞凝膠電泳實驗和V79細胞微核實驗可致細胞染色體和DNA的不穩(wěn)定性,這些研究與本實驗結(jié)果類似。至于溫石棉致腫瘤的風險評估,還需進一步證實。

    4 結(jié)論

    (1) 我國四大溫石棉礦區(qū)可吸入纖維粉塵不同程度損傷Wistar大鼠肺組織,可致肺出血、水腫、炎癥細胞浸潤的急性損傷,長期暴露可致肺組織纖維化。

    (2) 我國四大溫石棉礦區(qū)可吸入纖維粉塵可不同程度下調(diào)Wistar大鼠肺組織p53、p16抑癌基因,具有致肺癌的風險。

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