高油酸花生發(fā)芽期低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組及差異表達(dá)基因分析

張高華，于樹(shù)濤，王鶴，王旭達(dá)

高油酸花生發(fā)芽期低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組及差異表達(dá)基因分析

張高華1，于樹(shù)濤2，王鶴1，王旭達(dá)1

1. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，大連 116023 2. 遼寧省沙地治理與利用研究所，阜新 123000

高油酸花生(L.)油具有優(yōu)異的營(yíng)養(yǎng)成分和熱氧化穩(wěn)定性，有利于人體健康和工業(yè)生產(chǎn)。但是高油酸花生在發(fā)芽期間對(duì)溫度比較敏感，限制了其在低溫地區(qū)的引種。為了進(jìn)一步了解高油酸花生在發(fā)芽期響應(yīng)低溫脅迫的分子機(jī)制，本研究選用田間試驗(yàn)中耐寒表現(xiàn)不同的4種高油酸花生品種，分析其在發(fā)芽期低溫脅迫下的全基因組水平調(diào)控。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序共獲得139 429條Unigene，其中兩組耐寒與不耐寒高油酸花生品種在低溫脅迫下共產(chǎn)生差異表達(dá)基因(differentially expressed gene, DEG) 3520個(gè)，且耐寒花生中上調(diào)表達(dá)的DEG數(shù)目大于下調(diào)表達(dá)的數(shù)目。GO分析表明，耐寒高油酸花生中有關(guān)細(xì)胞膜代謝與完整性以及細(xì)胞外周蛋白差異表達(dá)基因的數(shù)量較多；KEGG通路分析表明，植物病原相互作用和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抗寒中起著重要作用。進(jìn)一步篩選出4個(gè)低溫誘導(dǎo)蛋白基因——時(shí)鐘調(diào)控蛋白基因() 、AGO4蛋白基因()、組蛋白–賴氨酸N甲基類轉(zhuǎn)移酶ATX3基因()、FERONIA類受體蛋白激酶基因()和3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因——和，采用qRT-PCR檢測(cè)這些基因在低溫脅迫下的表達(dá)量。結(jié)果顯示，在低溫處理3 h后、和以及轉(zhuǎn)錄因子基因和的表達(dá)量明顯升高，在脅迫12 h后也有明顯升高，表明這些基因在花生萌發(fā)期響應(yīng)低溫脅迫。本研究為深入了解高油酸花生發(fā)芽期低溫脅迫轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制和篩選花生抗寒基因提供了數(shù)據(jù)資源。

花生；高油酸；轉(zhuǎn)錄組分析；耐寒

低溫傷害是影響作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要環(huán)境因素之一，引起植物細(xì)胞發(fā)生一系列生理生化改變，包括細(xì)胞膜脂相變、結(jié)構(gòu)變化和各種酶活性的改變，進(jìn)而導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化、胞壁黏連、細(xì)胞脫水，甚至蛋白質(zhì)變性，最終致使植物部分或整體死亡[1]。但是也有一些植物在低溫脅迫下可以通過(guò)自身生理和生化的調(diào)整，提高對(duì)冷凍溫度的耐受能力[2]。研究表明，植物對(duì)低溫的耐受性涉及到細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重建和基因表達(dá)的改變，通過(guò)觸發(fā)一系列抵御寒冷損傷的保護(hù)機(jī)制，如細(xì)胞內(nèi)可溶性物質(zhì)的增加、低溫保護(hù)劑和抗氧化劑的積累以及防凍蛋白的誘導(dǎo)來(lái)提高耐寒性[3~5]。近年來(lái)，人們對(duì)植物的低溫應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，通過(guò)基因組、轉(zhuǎn)錄組等生物信息學(xué)分析可以更加全面地認(rèn)識(shí)作物抗逆性的遺傳基礎(chǔ)，了解植物的基因表達(dá)調(diào)控模式和代謝途徑。

花生(L.)是世界上第四大油料作物，也是我國(guó)最重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物之一[6]。隨著花生育種研究的發(fā)展，高油酸花生受到越來(lái)越多的關(guān)注。高油酸花生中油酸含量高，不僅能降低人體有害膽固醇，減緩動(dòng)脈粥樣硬化，有效預(yù)防心血管疾病的發(fā)生[7]；同時(shí)，由于油酸的穩(wěn)定性高，可以延長(zhǎng)高油酸花生及其制品的貨架期[7,8]。因此，提高花生油酸含量已成為國(guó)內(nèi)外花生品質(zhì)改良育種的研究熱點(diǎn)之一。很多國(guó)家已經(jīng)開(kāi)展了高油酸花生育種，并利用高油酸材料F435培育出不同植物類型的新品種，并在生產(chǎn)上得到應(yīng)用[9]。我國(guó)越來(lái)越重視高油酸花生的育種研究，目前也取得了很多突破性進(jìn)展，研究成果顯著[10]。

遼寧省花生以品質(zhì)優(yōu)良、黃曲霉污染率低、出口量大而著稱，是省內(nèi)僅次于玉米和水稻的第三大糧油作物[11]。遼寧花生主要生產(chǎn)于干旱半干旱的遼西北地區(qū)，年度間氣溫波動(dòng)大。一直以來(lái)，受到地域環(huán)境和地理分布的影響，高油酸花生在遼寧地區(qū)的引種和研發(fā)受到很大的限制[12]。從當(dāng)?shù)鼗ㄉ贩N中篩選油酸含量高而且抗寒性好的花生品種，是高油酸花生在低溫地帶引種和育種成功較為有效快速的方法。遼寧省沙地治理與利用研究所選用40余種待選花生高油酸品種，在遼寧阜新花生試驗(yàn)田進(jìn)行田間抗寒能力和適應(yīng)性評(píng)價(jià)，篩選出幾種耐寒表現(xiàn)較好的高油酸花生品種[13]。為了解高油酸花生在分子水平上對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制，本研究選擇田間試驗(yàn)中4種耐寒性不同的高油酸花生品種，構(gòu)建了花生發(fā)芽期低溫脅迫后轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)，采用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)獲得轉(zhuǎn)錄組基因序列，并對(duì)不同的花生品種之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類和代謝通路分析，篩選并鑒定出幾種在低溫條件下起重要調(diào)節(jié)作用的基因，為利用基因工程技術(shù)改良花生抗逆能力提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

高油酸花生品種S51、S53、花育661 (HY661)和L126的種子由遼寧省沙地治理與利用研究所提供，均為3年以內(nèi)收獲的種子。

1.2 花生低溫冷浸發(fā)芽

選擇田間耐寒表現(xiàn)較好的遼寧花生高油酸品種S51和S53及相對(duì)不耐寒的高油酸花生品種HY661和L126，選取品相一致的花生種子各50粒，低溫2℃黑暗浸泡處理72 h，然后置于培養(yǎng)皿里，在無(wú)菌水浸泡的濾紙上萌芽，22℃黑暗培養(yǎng)，3 d后統(tǒng)計(jì)露白率和芽長(zhǎng)/種長(zhǎng)。取相同數(shù)目的花生種子作為對(duì)照組，常溫22℃浸泡黑暗處理72 h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，并進(jìn)行ANOVA測(cè)驗(yàn)和Tukey多重比較檢驗(yàn)。將低溫浸泡組和對(duì)照組放入25℃人工氣候箱中，16 h/8 h光周期持續(xù)培養(yǎng)14 d后觀察其生長(zhǎng)狀況。

1.3 花生低溫脅迫及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

選取耐寒的高油酸花生品種S51和S53，以不耐寒品種HY661和L126作為對(duì)照，進(jìn)行低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。發(fā)芽3 d的花生種子經(jīng)過(guò)0℃處理24 h后，經(jīng)液氮冷凍，采用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden，德國(guó))提取花生種子總RNA，經(jīng)NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(NanoDrop，德國(guó))進(jìn)行RNA純度與質(zhì)量檢驗(yàn)，由南京諾唯贊生物科技公司通過(guò)Illumina Hiseq2000平臺(tái)測(cè)序組裝。

1.4 抗寒基因生物信息學(xué)分析

對(duì)測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，使用BLAST軟件將Unigene序列在NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，預(yù)測(cè)Unigene氨基酸序列；利用HMMER軟件與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得Unigene的注釋信息。根據(jù)NR注釋信息，使用Blast2GO軟件得到Unigene的GO注釋信息，采用WEGO軟件對(duì)所有Unigene進(jìn)行GO功能分類統(tǒng)計(jì)。將Unigene和COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)Unigene功能并對(duì)其進(jìn)行功能分類統(tǒng)計(jì)。將S53與HY661、S51和L126分別進(jìn)行差異基因比較，統(tǒng)計(jì)差異表達(dá)量大于2倍的基因數(shù)目，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG Pathway富集分析。

1.5 抗寒基因篩選及功能分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，篩選7種低溫誘導(dǎo)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。采用發(fā)芽3 d的高油酸花生品種S51，低溫0℃黑暗處理24 h，分別在處理后0 h、3 h、12 h、24 h采集樣品，提取發(fā)芽種子的總RNA。用DNaseⅠ消化DNA并檢驗(yàn)RNA濃度及質(zhì)量。利用 Primer 5.0 軟件，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組獲得的基因序列信息，設(shè)計(jì)qRT-PCR擴(kuò)增引物(引物序列見(jiàn)附表1)，并進(jìn)行引物熔解曲線分析，擴(kuò)增效率達(dá)到95%以上。采用SYBRPremixExTaqTM(TaKaRa，日本)試劑盒在ABI 7500快速實(shí)時(shí)定量系統(tǒng)(ABI，美國(guó))上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃ 10 s，56℃ 25 s，72℃ 25 s，40個(gè)循環(huán)。以花生為內(nèi)參基因，采用2–ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)目的基因分別進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生發(fā)芽期耐寒性檢測(cè)

對(duì)43份高油酸花生材料進(jìn)行田間種植及初步耐寒性篩選，選擇各方面生長(zhǎng)狀況良好的耐寒品種18個(gè)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所進(jìn)行高油酸含量測(cè)試。結(jié)果顯示，這18個(gè)耐寒品種花生的油酸含量均高于75% (數(shù)據(jù)未發(fā)表)。選擇田間耐寒能力較好的花生品種S51、S53和耐寒性一般的HY661、L126進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室發(fā)芽耐寒能力檢測(cè)。經(jīng)低溫2℃浸泡處理72 h，22℃萌發(fā)3 d后統(tǒng)計(jì)花生的發(fā)芽率(圖1A)和平均芽長(zhǎng)/種長(zhǎng)(圖1B)。結(jié)果顯示，HY661和L126的萌發(fā)率明顯低于S51和S53，其平均芽長(zhǎng)/種長(zhǎng)也相應(yīng)低于S53和S51。進(jìn)一步在25℃常溫條件下持續(xù)培養(yǎng)14 d后，觀察花生的生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果顯示，經(jīng)低溫處理的花生生長(zhǎng)狀態(tài)都弱于對(duì)照組，但是S51和S53的生長(zhǎng)狀態(tài)要明顯好于HY661和L126 (圖2)。

2.2 花生轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.2.1 花生轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)

經(jīng)過(guò)田間低溫篩選和室內(nèi)發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，選取較耐寒的高油酸花生品種S51、S53，以不耐寒品種HY661和L126作為對(duì)照，用于低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。發(fā)芽3 d的花生種子經(jīng)過(guò)0℃處理24 h后，提取總RNA并進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，共獲得139 429條Unigene，總長(zhǎng)為175 715 359nt，平均長(zhǎng)度1260nt，N50為1968nt。將獲得的Unigene進(jìn)行功能注釋，注釋到NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO數(shù)據(jù)庫(kù)的Unigene數(shù)目分別為96 398、95 976、63 984、59 614、39 213和76 800條。通過(guò)預(yù)測(cè)編碼蛋白框(coding sequence, CDS)，比對(duì)到蛋白庫(kù)的CDS為96 306個(gè)，預(yù)測(cè)出的CDS為2285個(gè)。

2.2.2 Unigene的GO和COG功能分類

GO功能分類可以從宏觀上認(rèn)識(shí)該物種的基因功能分布特征。由于存在單個(gè)Unigene可以與多種基因功能條目相對(duì)應(yīng)的關(guān)系，本研究最終有76 800個(gè)Unigene與GO注釋條目建立了對(duì)應(yīng)關(guān)系。所有的Unigene分別注釋到3個(gè)功能大類，即基因的分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular com-ponent)和參與的生物過(guò)程(biological process) (圖３A)。在生物過(guò)程中涉及基因最多的是代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程；此外，涉及應(yīng)激反應(yīng)的基因數(shù)目為21 895條，其中響應(yīng)低溫刺激(GO:0009409)的基因數(shù)為764條。細(xì)胞組分中涉及功能最多的是細(xì)胞、細(xì)胞部分以及細(xì)胞器，高達(dá)5萬(wàn)條以上。分子功能中基因數(shù)目最多的是結(jié)合反應(yīng)和催化反應(yīng)功能的基因。

圖1 4個(gè)品種花生經(jīng)2℃冷浸處理72 h后發(fā)芽狀態(tài)檢測(cè)

A：發(fā)芽率；B；平均芽長(zhǎng)/種長(zhǎng)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差；小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(≤0.05)。

圖2 4個(gè)品種花生經(jīng)低溫處理72 h后生長(zhǎng)14 d時(shí)表型觀察

圖3 花生種子發(fā)芽期轉(zhuǎn)錄組Unigene GO和COG功能分類

A：GO功能分類；B：COG功能分類。

為了解花生發(fā)芽期轉(zhuǎn)錄基因產(chǎn)物的功能分布特征，本研究將測(cè)序獲得的全部Unigene與COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)的蛋白功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和統(tǒng)計(jì)歸類。數(shù)據(jù)分析顯示，共有39 213條Unigene與COG數(shù)據(jù)庫(kù)中的功能分類項(xiàng)目匹配。根據(jù)功能分類，初步將花生種子轉(zhuǎn)錄組中的基因歸為25類，其中數(shù)目最多的是一般功能預(yù)測(cè)(R)的基因，有13 354條之多，其次是涉及轉(zhuǎn)錄(K)和復(fù)制、重組、修復(fù)(L)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(T)的基因，分別達(dá)到5000條以上。另外還有3147條未知功能(S)類別的基因(圖３B)。

2.2.3 高油酸花生發(fā)芽期低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因分析

本研究對(duì)不同品種高油酸花生低溫處理后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行差異表達(dá)分析，找出在不同樣本間差異表達(dá)基因(DGE)。結(jié)果顯示，共有21 665個(gè)基因存在顯著性差異。分別將品種S53與HY661、S51與L126進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩組耐寒性不同花生品種之間的DGE分別是12 744和8920個(gè)，共同的DGE為3520個(gè)(圖４A)。而兩個(gè)耐寒品種相對(duì)于不耐寒品種，上調(diào)表達(dá)的DGE數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于下調(diào)表達(dá)的DGE數(shù)目(圖４B)。

對(duì)兩組耐寒和不耐寒高油酸花生之間差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類比對(duì)，品種S51與L126之間的比對(duì)結(jié)果顯示，生物過(guò)程和細(xì)胞成分中差異基因數(shù)目較多，其中細(xì)胞成分中數(shù)量較多的是細(xì)胞膜和細(xì)胞外周功能，而在生物過(guò)程中差異基因數(shù)目較多的是單器官發(fā)育過(guò)程、發(fā)育過(guò)程、碳水化合物代謝過(guò)程和解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育，但是分子功能中差異基因數(shù)目并不多(圖５A(chǔ))。進(jìn)一步通過(guò)KEGG通路分析顯示，S51與L126差異基因中數(shù)量較多集中在植物病菌互作、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和糖類代謝、剪切體和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)功能(圖5B)。品種S53與HY661的GO功能分類和KEGG通路分析結(jié)果與品種S51與L126類似，說(shuō)明這兩組耐寒和不耐寒高油酸花生之間具有相似的基因表達(dá)模式。

2.2.5 花生低溫誘導(dǎo)基因的表達(dá)分析

表觀遺傳調(diào)控、糖酵解、細(xì)胞壁重構(gòu)、蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子、脫落酸(abscisic acid, ABA)信號(hào)途徑等對(duì)種子萌發(fā)至關(guān)重要[14,15]。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中的差異表達(dá)基因的分析及功能分類結(jié)果，本研究篩選出在上述調(diào)控途徑中表達(dá)量上調(diào)的關(guān)鍵基因，其中Unigene44032_All是苜蓿()時(shí)鐘調(diào)控蛋白TIME FOR COFFEE (TIC)的同源基因，在ABA信號(hào)途徑中發(fā)揮作用[16]。Unigene22874_All和Unigene5925_All分別是大豆()組蛋白賴氨酸N甲基轉(zhuǎn)移酶ATX3和AGO4蛋白的同源基因，參與表觀遺傳調(diào)控[17,18]。CL243.Contig3_All是FERONIA類受體蛋白激酶(FER)基因，與細(xì)胞性狀、伸長(zhǎng)及環(huán)境脅迫有關(guān)[19]。此外還篩選出３種轉(zhuǎn)錄因子基因：(CL13529.Contig29_All)、(CL13161.Contig1_All)和(CL13161. Contig1_All)。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究對(duì)發(fā)芽3 d的高油酸花生品種S51，經(jīng)低溫0℃黑暗處理，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)這些基因在0 h、3 h、12 h、24 h時(shí)的表達(dá)量。結(jié)果顯示，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，、和的表達(dá)量在脅迫3 h后明顯升高，并且和在脅迫12 h后的表達(dá)水平達(dá)到10倍以上，而在脅迫12 h后才有明顯升高。轉(zhuǎn)錄因子基因、、在受到低溫誘導(dǎo)3 h后表達(dá)量都顯著升高，但在12h后表達(dá)量有所降低(圖6)，表明這些基因在花生發(fā)芽期低溫脅迫時(shí)均明顯上調(diào)，響應(yīng)并參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。

圖4 4個(gè)花生品種經(jīng)低溫處理后差異表達(dá)基因數(shù)目

A：DGE維恩圖；B：DGE數(shù)目統(tǒng)計(jì)。

圖5 花生品種S51和L126差異表達(dá)基因的GO功能分類及KEGG通路分析

A：差異表達(dá)基因的GO功能分類；B：顯著富集的差異基因的KEGG通路分類。

圖6 S51花生低溫誘導(dǎo)基因表達(dá)量分析

基因表達(dá)量為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，采用ANOVA測(cè)驗(yàn)，進(jìn)行LSD/SNK檢驗(yàn)。*<0.05，表示差異顯著；**<0.01，表示差異極顯著。

3 討論

本研究對(duì)耐寒性不同的高油酸花生品種在低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行了比較分析，初步了解在發(fā)芽期低溫誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)機(jī)制。分析結(jié)果顯示，兩組耐寒性不同花生品種之間的DGE分別是12 744和8920個(gè)，共同DGE為3520個(gè)。而相對(duì)于不耐寒品種，兩個(gè)耐寒品種上調(diào)表達(dá)的DGE數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于下調(diào)表達(dá)的數(shù)目(圖4)。該研究結(jié)果表明在耐寒和低溫敏感花生品種之間存在大量的差異表達(dá)基因，共同的差異表達(dá)基因也顯示了在耐寒花生品種間具有很多相同的基因調(diào)節(jié)特征和途徑，并且大多是通過(guò)正調(diào)節(jié)的方式來(lái)響應(yīng)低溫脅迫。GO功能分類分析顯示，差異基因數(shù)量較多的集中在器官發(fā)育、碳水化合物合成、細(xì)胞外周和細(xì)胞膜方面(圖5A)，這表明在花生萌發(fā)期，其器官形態(tài)發(fā)育及能量合成代謝極為活躍，而低溫脅迫容易造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞外周組織受損傷，所以誘導(dǎo)大量調(diào)控基因激活耐寒花生中的細(xì)胞膜修復(fù)機(jī)制，重建細(xì)胞膜內(nèi)外結(jié)構(gòu)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可能是耐寒高油酸花生具有更好的適應(yīng)性和保護(hù)性的主要原因之一。KEGG通路分析顯示，耐寒花生與不耐寒花生的差異基因的數(shù)量較多集中在植物病原體互作、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中(圖5B)，說(shuō)明在受到低溫脅迫時(shí)，植物對(duì)逆境的響應(yīng)與病害入侵的途徑有共同的模式。另外，很多植物在受到逆境脅迫時(shí)會(huì)積累ABA等植物激素來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)[2,3]，因此差異基因在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的富集證明植物激素在低溫脅迫下起重要調(diào)控作用，激活和誘導(dǎo)相關(guān)代謝途徑中的基因表達(dá)，提高花生對(duì)低溫的適應(yīng)性。

研究表明在種子萌發(fā)初期，細(xì)胞壁重構(gòu)以及植物激素信號(hào)途徑等方面的早期激活對(duì)種子萌發(fā)至關(guān)重要。本研究挑選了相關(guān)基因進(jìn)行了表達(dá)模式分析，其中編碼的時(shí)鐘調(diào)控蛋白是植物體內(nèi)平衡的核心元素，它整合和協(xié)調(diào)發(fā)育、代謝和環(huán)境信號(hào)。在擬南芥()中，突變體轉(zhuǎn)錄組分析顯示和ABA響應(yīng)基因之間存在極大的關(guān)聯(lián)性。在ABA處理下，突變體的種子萌發(fā)率下降20%，表明表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致ABA信號(hào)調(diào)節(jié)基因增強(qiáng)[16]。在本研究中，耐寒花生S53/S51種子低溫萌發(fā)率高于不耐寒花生品種HY661和L126，同時(shí)對(duì)低溫誘導(dǎo)基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示S51的表達(dá)顯著升高，推測(cè)表達(dá)升高抑制了ABA信號(hào)途徑，從而提高了萌發(fā)率。另一個(gè)轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯升高的是FERONIA類受體蛋白激酶基因()，其編碼蛋白是植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要載體，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、胚珠受精、細(xì)胞壁完整性和病原體反應(yīng)。最新的研究顯示，擬南芥質(zhì)膜的FER類蛋白對(duì)于高鹽脅迫后恢復(fù)根系生長(zhǎng)非常必要。FER具有細(xì)胞壁感受功能，在FER突變體中，根細(xì)胞在生長(zhǎng)恢復(fù)過(guò)程中會(huì)突然爆裂，表明FER在受到滲透脅迫后能夠維持細(xì)胞壁的完整性[19]。在本研究中，耐寒花生S51和S53種子中基因在低溫脅迫下表達(dá)量升高，猜測(cè)其對(duì)細(xì)胞的完整性有保護(hù)作用。

最近的研究表明，表觀遺傳調(diào)控在種子休眠和萌發(fā)進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)耐寒花生種子中和同源基因在低溫處理下表達(dá)水平顯著升高，這兩個(gè)基因分別與DNA甲基化[18]和組蛋白修飾[17]相關(guān)。Singh等[20~22]通過(guò)分析在大麥()和小麥()中的表達(dá)模式以及對(duì)5S rDNA的甲基化作用，表明對(duì)種子休眠起負(fù)調(diào)控作用。本研究耐寒花生種子中在萌發(fā)過(guò)程中表達(dá)量升高，可能打破了種子的休眠過(guò)程，促進(jìn)了種子的萌發(fā)。擬南芥Trithorax (ATX)蛋白家族負(fù)責(zé)組蛋白賴氨酸的雙/三甲基化。已有的研究表明，和突變體種子在ABA處理下的萌發(fā)率顯著降低，表明ATX4和ATX5參與了ABA信號(hào)通路的調(diào)控[23]。此外，的表達(dá)量在種子休眠到萌發(fā)過(guò)程中逐漸升高，使種子萌發(fā)相關(guān)基因的三甲基化水平升高，相應(yīng)地提高了它們的表達(dá)水平[17]。另有研究表明，三突變體會(huì)引起嚴(yán)重的植物生長(zhǎng)缺陷，因此認(rèn)為ATX3、ATX4和ATX5基因亞家族很有可能共同通過(guò)調(diào)控ABA信號(hào)調(diào)節(jié)基因的雙/三甲基化來(lái)參與種子的萌發(fā)過(guò)程[24]。在本研究中，耐寒花生種子中同源基因在低溫處理下表達(dá)量升高，很可能負(fù)調(diào)控了ABA信號(hào)途徑，從而提高了種子在低溫條件下的萌發(fā)率。

在低溫條件下，植物進(jìn)化出一系列精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)響應(yīng)低溫脅迫，提高植物對(duì)低溫的適應(yīng)性，轉(zhuǎn)錄因子就是其中重要的環(huán)節(jié)。目前研究最全面的低溫響應(yīng)途徑是由CBF/DREB(C-repeat-binding factors/dehydration response element)轉(zhuǎn)錄因子家族調(diào)控[4]。這些轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到CRT/DRE反應(yīng)元件上，在低溫馴化過(guò)程中對(duì)下游低溫調(diào)節(jié)基因(old regulated, COR)的表達(dá)進(jìn)行正調(diào)控[25]。同時(shí)，CBF/DREB又可以被CBF誘導(dǎo)基因(inducer of CBF expression, ICE)通過(guò)特異性識(shí)別MYC順式元件激活，形成低溫誘導(dǎo)調(diào)節(jié)途徑ICE-CBF-COR[26~28]。近年來(lái)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫方面的作用也越來(lái)越引起重視，其中ICE屬于MYC類bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族[29]，它可以特異性地提高CBF3的表達(dá)[30]。另有研究顯示，擬南芥中的和、煙草()以及小麥在低溫、干旱、滲透脅迫中表達(dá)量升高，顯示類轉(zhuǎn)錄因子基因在逆境脅迫下起調(diào)控作用[30]。本研究在耐寒性較好的花生品種中篩選出幾種轉(zhuǎn)錄因子基因，在S51花生品種中表達(dá)量相對(duì)較高。低溫脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，S51在低溫誘導(dǎo)3 h后基因表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明這些基因在花生萌發(fā)早期與低溫脅迫轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)。相對(duì)于冷敏感花生，耐寒花生品種在受到低溫脅迫時(shí)，各種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活躍，積極激活下游的低溫誘導(dǎo)基因表達(dá)，對(duì)低溫傷害起一定的保護(hù)和修復(fù)作用。

本研究對(duì)高油酸花生在發(fā)芽期轉(zhuǎn)錄水平上的耐寒機(jī)制進(jìn)行了初步探索。隨著野生種和栽培種花生全基因組測(cè)序信息的全面釋放，將有大量的基因和調(diào)控因子被克隆，探明這些基因的功能和調(diào)控途徑是提高作物對(duì)低溫脅迫耐受性的關(guān)鍵。今后將通過(guò)進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析、基因表達(dá)調(diào)控及功能驗(yàn)證來(lái)了解花生在轉(zhuǎn)錄水平上的低溫應(yīng)答機(jī)制，為高油酸花生在低溫地區(qū)的引進(jìn)或改良提供更多的參考。

附錄：

附表1見(jiàn)文章電子版(www.Chinagene.cn)。

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Transcriptome profiling of high oleic peanut under low temperatureduring germination

GaohuaZhang1, Shutao Yu2, He Wang1, Xuda Wang1

High oleic (HO) peanut (L.) oils benefit human health and industrial production due to its superior nutritional composition and thermo-oxidative stability. However, HO peanut is sensitive to cold stress especially during germination, which limits its distribution in low temperature areas. To understand the molecular mechanism of cold responses in HO peanuts at germination stage, four HO peanut varieties with different cold tolerance were selected in field experiments to analyze their genome-wide gene regulation under low temperatures. High-throughput sequencing and transcriptome analysis revealed a total of 139 429 unigenes. Among these, 3520 common differentially expressed genes (DEG) were detected between two groups of cold-tolerant and cold-sensitive peanuts, and the number of up-regulated genes was greater than that of down-regulated genes in the cold-tolerant peanuts. Gene ontology analysis indicates that the number of DEGs involved in cell membrane metabolism and integrity as well as proteins located in the cell periphery were significantly higher in the cold-tolerant peanuts. KEGG pathway analysis suggests that plant-pathogen interaction and plant hormone signal transduction pathway play important roles in cold tolerance. Four cold-induced genes,(),(),(),(), and three transcription factor genes,(),()and()were selected to verify the expression profile via real-time quantitative PCR detection. The expression of,,,,andsignificantly increased within 3 hours after low temperature stress, while the expression ofsignificantlyincreased after 12 hours, suggesting that these genes responded to low temperature stress during peanut germination. This work not only sheds light on the transcriptional regulation of HO peanut under low-temperature stress during germination but also provides data resources for screening candidate genes in improving peanuts stress resistance.

peanut; high oleic acid; transcriptome analysis;cold tolerance

2019-04-04;

2019-09-05

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：20180551263)資助[Supported by the Natural Science Foundation of Liaoning Province (No. 20180551263)]

張高華，博士，研究方向：植物抗逆基因工程。E-mail: zhgaohua@hotmail.com

王旭達(dá)，碩士，研究方向：生物技術(shù)。E-mail: wangxuda860@sina.com

10.16288/j.yczz.19-097

2019/10/10 15:41:19

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20191010.1100.001.html

(責(zé)任編委: 張根發(fā))