混菌固態(tài)發(fā)酵花生粕的工藝優(yōu)化

姜曉陽(yáng),2,胡迎芬,*,鄭靖義,王劉昱,李夢(mèng)杰,孫榕梓,張 鋒

(1.青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東青島 266071;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東青島 266071)

我國(guó)是花生生產(chǎn)大國(guó),每年近一半以上的花生用于榨油,故每年能產(chǎn)生上百萬噸的花生粕[1-2]。花生粕含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、膳食纖維和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3-4],但是由于花生粕是在高溫高壓的條件下產(chǎn)生的,其中的蛋白質(zhì)和多糖易產(chǎn)生美拉德反應(yīng),其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與功能特性受到不同程度的影響[5-7],大大降低了其利用率。根據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局公布的數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)每年花生粕大多作為飼料,花生粕利用的附加值低,資源浪費(fèi)嚴(yán)重[8-9]。因此研究花生粕資源的高值化利用具有重要意義。

目前國(guó)內(nèi)外采用微生物發(fā)酵的方式來提高原料的利用率和質(zhì)量,人們對(duì)微生物發(fā)酵技術(shù)的關(guān)注度日益提高[10-11],微生物發(fā)酵不僅可以改變發(fā)酵物的風(fēng)味和質(zhì)地,并且可以增加生物活性物質(zhì)[12]。對(duì)于發(fā)酵方式而言,固態(tài)發(fā)酵的方式已從單菌發(fā)酵向混合菌發(fā)酵的方向發(fā)展[13]?；炀l(fā)酵過程中,不同微生物間具有互補(bǔ)性和協(xié)同性,使酶促反應(yīng)更加全面,并且能同時(shí)得到多種生物活性物質(zhì)[14]。納豆芽孢桿菌具有多種功能性活性物質(zhì),其中的納豆激酶具有降血栓,預(yù)防和治療心腦血管疾病和降血脂等功能[15-17];紅曲具有活血祛瘀、化濁降脂等功能,含有的γ-氨基丁酸具有明顯的降血壓的作用,并且是大腦的一種化學(xué)傳遞物質(zhì),可以調(diào)節(jié)大腦興奮與抑制等作用[18-20]。但是目前利用納豆芽孢桿菌和紅曲霉混菌發(fā)酵的研究鮮有報(bào)道。

本研究以花生粕為原料,利用納豆芽孢桿菌和紅曲霉進(jìn)行固態(tài)混菌發(fā)酵,以發(fā)酵物中納豆激酶(NK)的活力和γ-氨基丁酸的(GABA)含量為指標(biāo),探究發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料水比、菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)及接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響,以確定最佳的發(fā)酵工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌 分離于日本高野納豆,由青島大學(xué)食品工程實(shí)驗(yàn)室保存;紅曲霉 來自于青島大學(xué)食品工程實(shí)驗(yàn)室保存的菌種;花生粕 由青島嘉里植物油廠提供;干酪素、γ-氨基丁酸、氫氧化鈉、硫酸銅、次氯酸鈉、無水碳酸鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

721G可見分光光度計(jì) 上海精密儀器有限公司;YXQ-LS-50SII滅菌鍋 上海博迅實(shí)驗(yàn)有限公司;CR21GⅢ高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi有限公司;CHA-S恒溫振蕩器 常州國(guó)宇儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 納豆芽孢桿菌液體培養(yǎng)基:蛋白胨1.0%,牛肉膏0.5%,氯化鈉0.3%,葡萄糖1.0%,酵母膏0.5%;紅曲霉液體培養(yǎng)基:牛肉膏3.0%,蛋白胨0.8%,硝酸鈉0.8%,葡萄糖3.0%,硫酸鎂0.1%,丙三醇7.0%;固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:花生粕(濕重)10 g,蔗糖0.15 g,硫酸鎂0.021 g,磷酸氫二鉀0.1 g,氯化鈣0.027 g,水根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求添加,121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2.2 種子液的制備 納豆芽孢桿菌經(jīng)斜面活化后刮入1～2環(huán)接入液體培養(yǎng)基中,37 ℃、160 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng)18 h作為發(fā)酵種子液,備用;紅曲霉菌經(jīng)過斜面活化后,加入5 mL蒸餾水,用無菌刮子將孢子輕輕掛下,按2%的比例接入裝有50 mL培養(yǎng)基中于30 ℃,150 r/min搖床培養(yǎng)4～5 d,制成發(fā)酵種子液,備用。

1.2.3 工藝流程 花生粕固體培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后,冷卻至室溫。在無菌條件下,將納豆芽孢桿菌種子液和紅曲霉種子液按一定比例混合噴灑于培養(yǎng)基中攪拌均勻,紗布封口,發(fā)酵后,加入一定量的水,4 ℃浸提2 h,4000 r/min離心15 min,取上清液備用。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 固定發(fā)酵條件:自然pH下,發(fā)酵溫度為34 ℃,發(fā)酵時(shí)間為70 h,料水比(W/V)1∶0.5 g/mL,菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)為1∶1,接種量為花生粕(濕重)的8%;依次改變發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料水比、菌種比例和接種量,考察各單因素對(duì)納豆激酶活力與γ-氨基丁酸含量的影響。各因素研究的水平設(shè)置分別為:發(fā)酵溫度:28、31、34、37、40 ℃;發(fā)酵時(shí)間:34、46、58、70、82、94 h;料水比:1∶0.2、1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6 g/mL;菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉):1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1;接種量:2%、4%、6%、8%、10%。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇溫度、時(shí)間、料水比、菌種比例和接種量等影響較為顯著的因素進(jìn)行正交試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

1.2.6 測(cè)定方法

1.2.6.1 納豆激酶活力(NK)的測(cè)定 采用Folin酚法[21-22]測(cè)定。酶活力單位的定義:溫度為40 ℃,環(huán)境pH7.5的條件下,1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的納豆激酶量為一個(gè)酶活力單位,以1 U/g表示。

納豆激酶活力計(jì)算公式:

其中:X為納豆激酶的活力;A樣為樣品液的光吸收值OD680 nm;A對(duì)為對(duì)照液的光吸收值OD680 nm;K為標(biāo)準(zhǔn)曲線上光吸收值為1時(shí)的酪氨酸含量,μg;V為酶促反應(yīng)的總體積,mL;T為酶促反應(yīng)的時(shí)間,min;N為粗酶液的稀釋倍數(shù)。

1.2.6.2γ-氨基丁酸(GABA)含量的測(cè)定 采用Berthelot比色法[23]進(jìn)行測(cè)定。γ-氨基丁酸含量的計(jì)算公式:

其中:Y為花生粕中GABA含量,mg/g;m為樣品液中GABA含量,mg/mL;r為樣品液的總體積,mL;q為稀釋倍數(shù);M為花生粕的質(zhì)量,g。

1.2.6.3 抗氧化活性的測(cè)定 羥自由基清除率[24]、DHHP[25]、鐵還原力[26]等按照文獻(xiàn)進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0和Excel制圖,SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線

納豆激酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1,回歸方程為y=0.0072x-0.0029,R2=0.9987。

圖1 納豆激酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Nattokinase activity standard curve

2.2 γ-氨基丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

γ-氨基丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2,回歸方程為y=1.7296x+0.012,R2=0.9979。

圖2 γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 γ-aminobutyric acid standard curve

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響 由圖3可以看出,在28～40 ℃,NK先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)發(fā)酵溫度為34 ℃時(shí)達(dá)到最高;GABA也呈先上升后下降的趨勢(shì),34 ℃達(dá)到最高,這可能是因?yàn)榫N的生長(zhǎng)對(duì)溫度要求較高,特別是混合菌種,在適宜溫度范圍內(nèi),納豆芽孢桿菌和紅曲霉才能快速生長(zhǎng)繁殖,產(chǎn)生大量的蛋白酶和γ-氨基丁酸。綜合發(fā)酵溫度對(duì)這2個(gè)指標(biāo)的影響,確定31～37 ℃作為正交試驗(yàn)發(fā)酵溫度范圍。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on fermentation efficacy

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響 由圖4可以看出,在34～94 h,NK先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為58 h時(shí)達(dá)到最高,在發(fā)酵初期,納豆芽孢桿菌大量生長(zhǎng)繁殖,分泌的酶量多,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),分泌量逐漸降低;GABA的發(fā)展趨勢(shì)與NK相似,這可能是隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),菌種進(jìn)入衰亡期,菌分泌的代謝產(chǎn)物逐漸減少。綜合發(fā)酵時(shí)間對(duì)這2個(gè)指標(biāo)的影響,確定46～70 h作為正交試驗(yàn)發(fā)酵時(shí)間范圍。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響Fig.4 Effect of fermentation time on fermentation efficacy

2.3.3 料水比對(duì)發(fā)酵效果的影響 由圖5可以看出,最適的料水比是1∶0.4 g/mL,在此條件下,NK活性和GABA含量均達(dá)到最大。固態(tài)發(fā)酵過程中水分是一個(gè)至關(guān)重要的因素,水分含量的高低影響著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解和培養(yǎng)基的透氣性,從而影響菌種的生長(zhǎng)。故選擇1∶0.3～1∶0.5 g/mL作為正交試驗(yàn)的水平范圍。

圖5 料水比對(duì)發(fā)酵效果的影響Fig.5 Effect of material-waterratio on fermentation efficacy

2.3.4 菌種比例對(duì)發(fā)酵效果的影響 由圖6可以看出,最適的菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)是1∶1。菌種混合比例對(duì)花生粕發(fā)酵產(chǎn)物的影響較為明顯。隨著納豆芽孢桿菌:紅曲霉比例的增加,NK和GABA均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),納豆芽孢桿菌∶紅曲霉為1∶1時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。原因可能是無論哪種菌種比例多,對(duì)相互的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,影響了生物活性物的分泌。故選擇菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)1∶2～2∶1作為正交試驗(yàn)的水平范圍。

圖6 菌種比例對(duì)發(fā)酵效果的影響Fig.6 Effect of strain ratio on fermentation efficacy

2.3.5 接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響 由圖7顯示可知,接種量在2%～10%的范圍內(nèi),NK和GABA基本上都是先上升后下降的趨勢(shì),6%的接種量最高。隨著接種量的增加,兩種菌分泌的活性物較多,能較好的利用底物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),故所產(chǎn)生的發(fā)酵物慢慢增加,在達(dá)到6%之后,出現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),可能是由于菌量的增加,消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較多,導(dǎo)致菌的生長(zhǎng)受到了影響。綜合該因素對(duì)納豆激酶活力和γ-氨基丁酸含量的影響,選擇4%～8%作為正交試驗(yàn)水平范圍。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and results

圖7 接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響Fig.7 Effect of inoculum size on fermentation efficacy

2.4 正交試驗(yàn)的結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)L18(35)的正交試驗(yàn),優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝參數(shù)組合。正交試驗(yàn)的結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出,正交試驗(yàn)各因素對(duì)花生粕發(fā)酵物中納豆激酶活力影響程度大小順序依次為:溫度>料水比>接種量>時(shí)間>菌種比例,得到的最佳工藝參數(shù):A1B1C2D3E2,即溫度31 ℃,時(shí)間46 h,料水比1∶0.4 g/mL,菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)2∶1,接種量6%。對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響程度大小順序依次為:溫度>時(shí)間>菌種比例>接種量>料水比,得到的最佳工藝參數(shù)是:A2B1C2D1E1,即溫度34 ℃,時(shí)間46 h,料水比1∶0.4 g/mL,菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)1∶2,接種量4%。

由表2可知,以發(fā)酵花生粕中納豆激酶活力和γ-氨基丁酸含量為指標(biāo),進(jìn)行正交試驗(yàn)得到的最佳工藝參數(shù)有所不同,各個(gè)指標(biāo)的各個(gè)因素具有不同的影響程度。綜合考慮單因素實(shí)驗(yàn)、正交試驗(yàn)結(jié)果及經(jīng)濟(jì)性等方面,主要以納豆激酶活性為主要參考指標(biāo)。通過分析,時(shí)間為46 h和料水比為1∶0.4 g/mL對(duì)于兩個(gè)指標(biāo)都是最佳的水平,其他的指標(biāo)以納豆激酶活性為主要參考,溫度31 ℃,菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)2∶1,接種量6%作為指標(biāo)的最佳水平,即A1B1C2D3E2。由于篩選出的最佳組合不在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中,需要做實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

將A1B1C2D3E2進(jìn)行三次平行驗(yàn)證,得到發(fā)酵液中NK的活力為(844.56±13.80)U/g,GABA含量為(105.25±0.25) mg/g,此結(jié)果優(yōu)于其他試驗(yàn)的結(jié)果,原因?yàn)閷?duì)于NK的活力而言A1B1C2D3E2組合中發(fā)酵時(shí)間短,菌種比例中納豆芽孢桿菌所占的比例較多,多種因素綜合起來有利于NK的活力;另外通過正交試驗(yàn)分析溫度在31和34 ℃下GABA含量均高,而A1B1C2D3E2和A2B1C2D3E1中時(shí)間、料水比和菌種比例均相同,所以測(cè)得GABA的含量相差不大。因此A1B1C2D3E2為最佳的工藝條件,即溫度31 ℃,時(shí)間46 h,料水比1∶0.4 g/mL,菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)2∶1,接種量6%。在此條件下對(duì)羥自由基清除率為68.46%±0.16%,對(duì)DPPH·清除率為76.98%±0.95%,鐵還原力的OD值為0.481。

3 結(jié)論

以發(fā)酵花生粕中的納豆激酶活力和γ-氨基丁酸的含量為指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn),優(yōu)化納豆芽孢桿菌和紅曲霉混合菌固體發(fā)酵花生粕的工藝參數(shù)為:溫度31 ℃,時(shí)間46 h,料水比1∶0.4 g/mL,菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)2∶1,接種量6%,測(cè)得NK的活力為(844.56±13.80) U/g,GABA含量為(105.25±0.25) mg/g,對(duì)羥自由基清除率為68.46%±0.16%,對(duì)DPPH·清除率為76.98%±0.95%,鐵還原力的OD值為0.481。

利用納豆芽孢桿菌和紅曲霉混菌發(fā)酵花生粕,不僅能獲得納豆激酶,還可以得到γ-氨基丁酸、抗氧化肽等功能性的生物活性物,提高花生粕的附加值,為花生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了新的思路。