EPB41L5 mRNA在食管癌組織、細胞中的表達及對食管癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

陳霞，石益海，郭小燕，胡麗娟，朱嬋艷

(海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬公利醫(yī)院，上海200135)

食管癌早期癥狀隱匿，90%的患者確診時已是晚期，晚期患者普遍預(yù)后差，生存率較低[1，2]。近年來靶向分子藥物如曲妥珠單抗和ramucirumab等為食管癌的治療帶來了新的希望，但這些藥物僅適用于少部分患者[3]。因此，尋找新的藥物靶點、開發(fā)新的靶向藥物意義重大。紅細胞膜蛋白帶4.1類似物5(EPB41L5)參與果蠅、斑馬魚和小鼠胚胎的發(fā)育[4]。新近研究報道，EPB41L5參與舌鱗狀細胞癌、結(jié)直腸癌和胃癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5～7]。EPB41L5在食管癌中的表達變化及其生物學(xué)功能尚不清楚。2016年1月～2018年1月，本研究觀察了EPB41L5 mRNA在食管癌組織和細胞中的表達變化，及沉默EPB41L5 mRNA表達對食管癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響，并探討相關(guān)作用機制。

1 材料與方法

1.1 食管癌組織、細胞及主要實驗材料 收集2016年1月～2018年1月手術(shù)切除的食管癌組織及其相應(yīng)癌旁組織50例，組織來源患者術(shù)前未接受化療、放療和靶向治療等任何形式的治療。所有操作均符合醫(yī)院倫理委員會制定的相關(guān)規(guī)定，且本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。食管癌細胞Eca109、EC9706、TE1和正常人食管鱗狀上皮細胞Het-1A均購自美國ATCC細胞庫。RPMI-1640、DMEM-F12培養(yǎng)基及FBS均購自美國Gibco公司。TRIzol、PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。EPB41L5、GAPDH引物均由上海捷瑞生物有限公司設(shè)計合成。EPB41L5 siRNA購自廣州市銳博生物科技有限公司。6孔板和Transwell小室購自美國Corning公司。Boyden基質(zhì)膠購自美國BD公司。RIPA裂解液購自美國Solarbio公司。BCA檢測蛋白濃度試劑盒購自美國Thermo公司。兔多克隆抗體E-cadherin、N-cadherin、Vimentin均購自英國Abcam公司。

1.2 食管癌組織和細胞系中EPB41L5 mRNA檢測 采用qRT-PCR檢測食管癌組織和細胞系中的EPB41L5 mRNA。采用TRIzol試劑盒提取組織和細胞中的總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將其作為模板，按qRT-PCR試劑盒說明進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參。EPB41L5上游引物序列為5′-GTTTCTTCCGTAGAACACTAGGG-3′，下游引物序列為5′-CAGAAGGGACACCCGACAC-3′。GAPDH基因上游引物序列為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物序列為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。以2- ΔΔCt表示EPB41L5 mRNA的相對表達量。

1.3 食管癌細胞分組及EPB41L5基因沉默 將Eca109、TE1、Het-1細胞接種于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，EC9706細胞接種于含10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果選取EPB41L5 mRNA表達水平最高的食管癌細胞進行轉(zhuǎn)染操作。取生長期的細胞胰酶消化后以2×105/孔接種于6孔板中，分為si-NC組和si-EPB41L5組。細胞貼壁后按照說明書將si-NC(序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)和si-EPB41L5(序列為5′-GAGAUGGAACUGGCUAUUUUU-3′)轉(zhuǎn)染至細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后采用qRT-PCR法驗證si-EPB41L5沉默效果，si-EPB41L5組的EPB41L5 mRNA表達水平低于si-NC組(P<0.05)則可進行后續(xù)實驗。

1.4 細胞侵襲能力檢測 采用Boyden實驗檢測細胞侵襲能力。收集轉(zhuǎn)染48 h后的si-NC組和si-EPB41L5組細胞，無血清培養(yǎng)基洗3次后，將細胞濃度調(diào)整為1×106/mL。在小室內(nèi)鋪BD基質(zhì)膠，將100 μL細胞懸液接種于小室基質(zhì)膠上，細胞通過基質(zhì)膠穿過聚碳酸酯膜小孔。將500 μL完全培養(yǎng)基加入下室作為趨化因子，放置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，PBS將膜的上室細胞洗掉，甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色20 min。倒置顯微鏡下觀察拍照，并隨機計數(shù)5個視野的穿膜細胞數(shù)，表示細胞侵襲能力。

1.5 細胞遷移能力檢測 采用Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力。收集轉(zhuǎn)染48 h后的si-NC組和si-EPB41L5組細胞，無血清培養(yǎng)基洗3次后，將細胞濃度調(diào)整為1×106/mL。將100 μL細胞懸液接種于小室聚碳酸酯膜上，細胞直接穿過聚碳酸酯膜小孔。將500 μL完全培養(yǎng)基加入下室作為趨化因子，放置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，PBS將膜的上室細胞洗掉，甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色20 min。倒置顯微鏡下觀察拍照，并隨機計數(shù)5個視野的穿膜細胞數(shù)，表示細胞遷移能力。

1.6 細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白檢測 采用Western blotting法檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin。收集轉(zhuǎn)染48 h后的si-NC組和si-EPB41L5組細胞，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，勻漿機冰上裂解10 min。4 ℃、13 000 r/min離心30 min棄掉細胞碎片。BCA試劑盒檢測蛋白濃度。煮沸后SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕性轉(zhuǎn)膜，8%牛奶室溫封閉3 h。分別加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，TBST洗3次、每次5 min，加入二抗室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯示條帶。Image J軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白灰度值與GAPDH蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織和細胞中EPB41L5 mRNA表達變化 食管癌組織、癌旁組織中EPB41L5 mRNA的相對表達量分別為1.67±0.85、1.03±0.53，食管癌組織中EPB41L5 mRNA的相對表達量高于癌旁組織(P<0.05)。食管癌細胞Eca109、EC9706、TE4及正常人食管鱗狀上皮細胞Het-1A中EPB41L5 mRNA的相對表達量分別為8.68±0.80、5.95±0.23、3.70±0.49、1.00±0.02。Eca109、EC9706、TE4細胞中EPB41L5 mRNA的相對表達量高于Het-1A細胞(P均<0.05)。選取EPB41L5 mRNA表達水平最高的Eca109細胞用于后續(xù)實驗。

2.2 si-NC組、si-EPB41L5組細胞侵襲能力比較 Boyden實驗結(jié)果顯示，si-NC組、si-EPB41L5組穿膜細胞數(shù)分別為(63.02±14.36)、(18.37±5.08)個，si-EPB41L5組細胞侵襲能力低于si-NC組(P<0.05)。見圖1。

圖1 si-NC組、si-EPB41L5組Boyden實驗細胞穿膜情況

2.3 si-NC組、si-EPB41L5組細胞遷移能力比較 Transwell小室實驗結(jié)果顯示，si-NC組、si-EPB41L5組細胞穿膜數(shù)分別為(75.54±10.28)、(33.21±7.68)個，si-EPB41L5組細胞遷移能力低于si-NC組(P<0.05)。見圖2。

圖2 si-NC組、si-EPB41L5組Transwell小室實驗細胞穿膜情況

2.4 si-NC組、si-EPB41L5組細胞中EMT相關(guān)蛋白表達比較 si-EPB41L5組細胞中上皮細胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白相對表達量高于si-NC組，間質(zhì)細胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin蛋白相對表達量低于si-NC組(P均<0.05)。見表1。

表1 si-NC組、si-EPB41L5組細胞中EMT相關(guān)蛋白相對表達量比較

注：與si-NC組相比，*P<0.05。

3 討論

食管癌發(fā)病原因尚不完全清楚，據(jù)報道飲食習(xí)慣、環(huán)境因素、壓力和基因突變等均可能導(dǎo)致食管癌的發(fā)生[8]。雖然目前食管癌的治療取得了一定進展，但是由于食管癌具有高轉(zhuǎn)移風(fēng)險，尤其是區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，患者術(shù)后容易復(fù)發(fā)和化療耐藥，導(dǎo)致患者長期生存率較低[1，2]。研究食管癌轉(zhuǎn)移的分子機制可能為發(fā)掘治療靶點提供新的方向。

EPB41L家族的N末端有保守的FERM結(jié)構(gòu)域蛋白，其C末端有肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域[9]，與細胞運動相關(guān)，家族中的NB41L具有獨特的非同源C末端并且缺乏肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。EPB41L5屬于NB41L家族，是足細胞特異性組分，EPB41L5的遺傳缺失可導(dǎo)致嚴(yán)重的蛋白尿、足細胞分離和局灶性節(jié)段性腎小球硬化[10，11]。此外，EPB41L5參與機體的發(fā)育，與Crumbs復(fù)合物相互作用，參與調(diào)節(jié)上皮細胞的極性[12]。同時，EPB41L5直接控制肌動蛋白的收縮性和黏著斑，調(diào)控細胞的擴散和遷移[13]。EPB41L5的異常表達在惡性腫瘤中的作用也逐漸被證實。Otsuka等[5]報道EPB41L5表達水平與舌鱗狀細胞癌(TSCC)患者的無病生存率和總體存活率相關(guān)，過表達EPB41L5的細胞侵襲能力增強。EPB41L5在結(jié)直腸癌組織中高表達，并與腫瘤類型、Dukes分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等臨床病理參數(shù)有關(guān)，可促進結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移[6]。Jeong等[7]報道EPB41L5在胃癌中高表達，且與患者預(yù)后不良有關(guān)。在體外，EPB41L5通過Smad依賴性轉(zhuǎn)化生長因子β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進胃癌細胞遷移和侵襲；在體內(nèi)，EPB41L5過表達可促進裸鼠胃癌細胞肺轉(zhuǎn)移，抗EPB41L5單克隆抗體治療可阻斷EPB41L5與轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白p120-catenin(p120)結(jié)合，并可完全逆轉(zhuǎn)體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移，提示EPB41L5是胃癌潛在的治療靶點。

本研究首先觀察了EPB41L5 mRNA在食管癌組織和細胞中的表達變化，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，食管癌組織中EPB41L5 mRNA表達上調(diào)，與舌癌、結(jié)直腸癌、胃癌相關(guān)研究結(jié)果一致[5～7]；qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，食管癌細胞Eca109、EC9706、TE4中EPB41L5 mRNA的表達顯著高于正常人食管鱗狀上皮細胞Het-1A，與食管癌組織中EPB41L5的表達變化趨勢一致，這提示EPB41L5可能是一種癌基因，與食管癌的發(fā)病有關(guān)。沉默EPB41L5 mRNA表達后，食管癌細胞的侵襲能力、遷移能力減弱，提示EPB41L5對食管癌細胞的侵襲和遷移有一定影響。

EPB41L5是一種間充質(zhì)特異性蛋白，通常在EMT過程中被誘導(dǎo)。EPB41L5與p120結(jié)合，以隔離p120與E-cadherin的結(jié)合，從而導(dǎo)致E-cadherin內(nèi)化;同時EPB41L5與黏著斑蛋白結(jié)合，促進黏著斑動力學(xué)，增強細胞的運動能力[14]。研究顯示，在乳腺癌細胞中，ZEB1誘導(dǎo)EPB41L5的表達，驅(qū)動ARF6基因，促進細胞侵襲轉(zhuǎn)移，ZEB1-EPB41L5軸是腫瘤EMT的核心[15]。EMT是細胞上皮表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型的過程，細胞極性和細胞間緊密連接遭到破壞，細胞運動增強，細胞遷移、侵襲能力增強，E-cadherin表達下調(diào)，N-cadherin和Vimentin等蛋白表達上調(diào)[16，17]。本研究觀察了抑制EPB41L5表達后食管癌細胞EMT相關(guān)蛋白表達變化，結(jié)果顯示，si-EPB41L5組E-cadherin蛋白相對表達量高于si-NC組，N-cadherin、Vimentin蛋白相對表達量低于si-NC組，提示EPB41L5對食管癌細胞侵襲、遷移能力的影響機制與調(diào)控EMT過程有關(guān)。

綜上所述，EPB41L5 mRNA在食管癌組織和細胞系中均高表達。沉默EPB41L5 mRNA表達可抑制食管癌細胞的侵襲、遷移能力，作用機制可能與抑制EMT有關(guān)。在后續(xù)的研究中，我們將對EPB41L5的表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系進行分層分析，同時分析EPB41L5表達與患者預(yù)后的關(guān)系。