山西黃芪根際土壤中叢枝菌根真菌的初步分離與鑒定

劉計權(quán)，賀潤麗，平莉莉，吳金鴻，李慶生

（山西中醫(yī)藥大學，山西晉中030619）

黃芪為豆科藥用植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.或蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根［1］。黃芪是一味中醫(yī)臨床極為常用和用量非常大的中藥材，也是中成藥制藥工業(yè)使用量非常大的原料藥。山西是黃芪的道地產(chǎn)地，2009年渾源縣建立國家級黃芪GAP基地，并在國際和國內(nèi)頂級域名權(quán)威機構(gòu)注冊了“恒山正北芪”網(wǎng)絡(luò)域名。2009年2月，國家中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)（山西）基地建設(shè)規(guī)劃實施方案中將黃芪列為山西省重點發(fā)展的9大中藥材種植品種之一。2016年6月，“國家中藥標準化項目”正式在山西啟動，會上確定黃芪為山西省承擔的“國家中藥標準化項目”中的9大中藥品種之一。為滿足市場需求，擴大黃芪種植面積，在黃芪栽培中引入新方法、新技術(shù)來提升產(chǎn)量和質(zhì)量是一個需要深入研究的課題。

研究表明，叢枝菌根真菌（arbuscularmycorrhizae fungi，AMF）是陸地生態(tài)系統(tǒng)中的關(guān)鍵微生物，能與90%以上的陸地植物形成互惠共生體。該菌能擴大植物根系的吸收面積，參與植物許多生理生化代謝過程，提高植物的光合作用，促進植物根系對礦質(zhì)元素的吸收，特別是提高植物對氮、磷及微量元素的吸收，減少施肥量［2］。而且能夠提高植物對干旱、鹽堿、低溫、重金屬污染等環(huán)境脅迫的抗性，減輕土傳病蟲害的發(fā)生，減少農(nóng)藥的施用，同時可提高栽培作物的品質(zhì)［3］。Morandi D報道，接種菌根真菌可導致藥用植物次生代謝產(chǎn)物異常積累，而次生代謝產(chǎn)物是藥用植物發(fā)揮藥效的主要成分［4］。魏改堂等證實AMF可提高荊芥揮發(fā)油的含量及曼陀羅中莨菪堿和東莨菪堿的含量［5］。Crush TR發(fā)現(xiàn)，AMF能強烈刺激豆科植物的生長和根瘤的形成，接種叢枝菌根真菌可有效改善栽培作物的生長勢和品質(zhì)，特別是有利于提升豆科植物的產(chǎn)量和品質(zhì)［6］。

本文對山西黃芪根際土壤中的叢枝菌根真菌進行了初步分離和鑒定，以期為今后在黃芪的規(guī)范化栽培中應用菌根生物技術(shù)提升黃芪的產(chǎn)量和品質(zhì)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗儀器 EL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、CHK-213型顯微鏡（徠卡集團）、YQ-1003A超聲波清洗器（上海易凈超聲波儀器公司）、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）、TD5A-WS離心機（常州金壇恒豐儀器制造有限公司）、水浴鍋（HH-2-39993）、SZ61奧林巴斯解剖鏡（北京瑞科中儀科技有限公司）、20目和 400 目篩子（GB1T6003.1-1997，上海璽瑞五金絲網(wǎng)有限公司）、玻璃儀器等。

1.1.2 實驗試劑 酸性品紅（南京化學試劑股份有限公司）、氯化鈉注射液（國藥準字H33021575，杭州民生藥業(yè)有限公司）、蔗糖、氫氧化鉀、乳酸、鹽酸、丙三醇（天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃芪根際土壤樣品采集 采集地:①黃芪道地產(chǎn)區(qū)，山西渾源縣千佛嶺鄉(xiāng)澤青嶺村辛莊自然村，海拔1700 m，陰坡，3年生野生蒙古黃芪；②黃芪栽培區(qū)，山西中醫(yī)藥大學校園，海拔800 m，陰坡，3年生栽培膜莢黃芪。

采集方法:9月中旬，在黃芪分布區(qū)，按1 m間隔隨機選取6株黃芪，去掉根際土壤表層腐殖質(zhì)，以黃芪植株根基為中心，分別在黃芪根際30 cm土壤范圍內(nèi)，按 0～10 cm、10～20 cm、20～30 cm 垂直分層采集土壤，每層取土樣1000 mL，將相同層次的土樣混勻裝入密封袋封口、標記后帶回實驗室，放入4℃冰箱儲存，以免孢子萌發(fā)。隨后將黃芪根系挖出，剪去枝葉密封標記后，同樣放入4℃冰箱儲存。

1.2.2 黃芪根際土壤中孢子的分離與鑒定 ①孢子的分離:采用濕篩傾析-蔗糖離心法對黃芪根際土壤中的孢子進行分離［7］。在體視鏡下觀察分離的孢子，統(tǒng)計每100 mL土樣中所有孢子的數(shù)量，計算孢子密度。②孢子的鑒定:參照Schenck&Perez叢枝菌根真菌鑒定手冊［8］和國內(nèi)相關(guān)文獻［9］，采用形態(tài)學鑒定法對分離的孢子進行鑒定。

1.2.3 根系侵染率的研究 將采回的根系用自來水緩慢沖洗，洗凈根表土壤及雜物，同時注意不能損壞根系表皮。選擇直徑0～10 mm的根系進行侵染率的研究。根據(jù)粗細程度將黃芪根系分為4個等級，一級根 0～2 mm，二級根 2～4 mm，三級根 4～6 mm，四級根6～10 mm。每級根系取樣50段。

參照Phillips和 Hayman染色方法［10］對黃芪根樣進行染色觀察。染色后用顯微鏡觀察每段根的染色情況，通過顯微測量統(tǒng)計每個根段的侵染面積。采用四舍五入法，根據(jù)侵染面積統(tǒng)計侵染率，侵染面積小于5%，侵染率計為0；侵染面積介于5%～14%，侵染率計為10%；侵染面積介于15%～24%，侵染率計為20%；其余依次類推。不同級別根段侵染率計算公式如下:

侵染率（%）=∑（0×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+20%×根段數(shù)+30%×根段數(shù)+40%×根段數(shù)+50%×根段數(shù)+60%×根段數(shù)+70%×根段數(shù)+80%×根段數(shù)+90%×根段數(shù)+100%×根段數(shù)）/觀察總根段數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同土層孢子種類與孢子密度

結(jié)果見表1。

表1 不同土層孢子種類與孢子密度

由表1可知，在渾源縣黃芪野生道地產(chǎn)區(qū)，孢子種類和孢子密度統(tǒng)計值在深度10～20 cm土層中最大，0～10 cm和20～30 cm土層均分離出8種孢子，20～30 cm土層的孢子密度最??；在山西中醫(yī)藥大學校園栽培區(qū)，10~20 cm土層中的孢子種類和孢子密度統(tǒng)計值同樣最大，0~10 cm土層中分離得到4種孢子，20~30 cm土層中分離得到3種孢子。

2.2 叢枝菌根真菌孢子的分離與鑒定

不同產(chǎn)地、不同土層黃芪根際土壤中叢枝菌根真菌孢子的分離鑒定與統(tǒng)計結(jié)果見表2。

由表2可知，2個產(chǎn)地黃芪根際土壤中均存在球囊霉屬、無梗囊霉屬和盾巨孢囊霉屬真菌，其中球囊霉屬的種類最多，盾巨孢囊霉屬的種類最少。渾源縣黃芪野生道地產(chǎn)區(qū)球囊霉屬和無梗囊霉屬的種類均多于山西中醫(yī)藥大學校園栽培區(qū)。在渾源縣黃芪野生道地產(chǎn)區(qū)，摩西球囊霉、黑色球囊霉和縮球囊霉在黃芪根際 0～10 cm、10～20 cm、20～30 cm 3個土層均有分布，平均孢子密度相對較大；在山西中醫(yī)藥大學校園栽培區(qū)，縮球囊霉分布于0～10 cm、10～20 cm、20～30 cm 3 個土層，摩西球囊霉分布于 0～10 cm、10～20 cm 2 個土層，縮球囊霉和摩西球囊霉的平均孢子密度相對較大。

表2 叢枝菌根真菌孢子的分離與鑒定結(jié)果

2.3 不同產(chǎn)地黃芪根系侵染率

不同產(chǎn)地黃芪根系侵染率的實驗結(jié)果見表3。

表3 根系侵染率的實驗結(jié)果

表3結(jié)果表明，渾源縣野生道地產(chǎn)區(qū)黃芪根系的平均侵染率為33.4%，顯著高于山西中醫(yī)藥大學校園栽培區(qū)黃芪根系的平均侵染率。在同一產(chǎn)區(qū)，不同粗度的黃芪根段其侵染率也有差異，根段越細侵染率越高，根段越粗侵染率越低。

3 討論

不同產(chǎn)地、不同土層中黃芪根際的叢枝菌根真菌孢子種類和孢子密度不同，其原因可能是多方面的。不同產(chǎn)地、不同土層的土壤理化性狀不同，每一種叢枝菌根真菌對不同理化性狀土壤環(huán)境的適應性不同；渾源縣野生道地產(chǎn)區(qū)為蒙古黃芪，山西中醫(yī)藥大學校園栽培區(qū)為膜莢黃芪，寄主的不同也是叢枝菌根真菌的種類和密度存在差異性的主要原因。多數(shù)叢枝菌根真菌分布在0～20 cm土層范圍內(nèi)，尤以10～20 cm土層范圍內(nèi)叢枝菌根真菌孢子種類最多，孢子密度最大，這是由于叢枝菌根真菌為好氣性真菌，在該土層范圍內(nèi)土壤透氣性最好，真菌生存環(huán)境最好。從叢枝菌根真菌的分布情況也可以看出，渾源縣黃芪道地產(chǎn)區(qū)土壤的理化性狀明顯優(yōu)于山西中醫(yī)藥大學校園栽培區(qū)土壤的理化性狀。

我國叢枝菌根真菌資源豐富，不同的叢枝菌根真菌與寄主藥用植物形成互惠共生體后，對寄主藥用植物的生理生化代謝過程可能會產(chǎn)生不同的影響。通過研究，進一步篩選出對黃芪產(chǎn)量和品質(zhì)形成有益的叢枝菌根真菌，并應用于黃芪的規(guī)范化栽培中，是今后仍需要深入開展的研究工作。