尿石清合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

楊素紅，胡玉良，王英晶

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院，廣東中山528400）

尿石清合劑是中山市中醫(yī)院新研發(fā)的制劑，由廣金錢草、梔子、石韋、甘草、川牛膝、車前子、海金沙、滑石、冬葵果等九味藥組成，具有清熱利濕、通淋排石作用［1］，用于治療尿路結(jié)石。為有效控制該制劑質(zhì)量，確保療效穩(wěn)定，筆者參考《中華人民共和國藥典》2015版一部及相關(guān)文獻(xiàn)對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范化研究。采用薄層色譜鑒別法［2］對制劑處方中車前子、川牛膝、石韋、廣金錢草、梔子、甘草作定性鑒別，用高效液相色譜法對主要藥味梔子的指標(biāo)成分梔子苷作定量分析，從而為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。

1 儀器與試藥

KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），JP-300A高速多功能粉碎機(jī)，Goodsee-I薄層色譜攝影儀（上海科哲生化科技有限公司），美國Agilent 1100系列高效液相色譜儀；梔子苷對照品（批號:110749-201316，供含量測定用，含量:97.5%）由中國食品藥品檢定研究院所提供；色譜純（甲醇），純化水，分析純。尿石清合劑（批號:20170912、20171031、20171130、20171228），所用藥材均購于廣東致信藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定符合《中國藥典》2015版規(guī)定。

2 薄層色譜定性鑒別

2.1 車前子薄層色譜鑒別

取尿石清合劑10 mL，用水飽和正丁醇振搖提取 2次，每次 25 mL；合并正丁醇提取液，再用正丁醇飽和的水洗滌 2次，每次 25 mL；棄去水液，正丁醇液蒸干，加甲醇l mL使殘?jiān)芙猓尤胫行匝趸X 1 g（100～200 目），拌勻，蒸干，加于中性氧化鋁柱上（3 g，100～200目，內(nèi)徑 9 mm，干法裝柱），用80%的甲醇30 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干；用甲醇1 mL使殘?jiān)芙?，作為供試品溶液。同法制成不含車前子的陰性對照溶液。另取粉碎后車前子對照藥? g，加入甲醇20 mL，超聲30 min后過濾，蒸干濾液，加甲醇2 mL溶解殘?jiān)?，制成對照藥材溶液?/p>

色譜條件:吸取供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-甲酸-水（16∶3∶1∶0.8）為展開劑展開，取出并晾干后，噴以含2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在80℃～85℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外燈光（365 nm）下檢視。結(jié)果見圖1。

圖1 車前子TLC鑒別圖

2.2 川牛膝薄層色譜鑒別

取樣品10 mL，每次使用乙酸乙酯20 mL提取2次，合并乙酸乙酯溶液后蒸干，加入無水乙醇2 mL使殘?jiān)芙猓鳛楣┰嚻啡芤?。取缺川牛膝的陰性溶?0 mL同法制備陰性對照溶液。取川牛膝2 g，加20 mL甲醇，超聲30 min，過濾，濾液蒸干；殘?jiān)蛹状? mL溶解制成對照藥材溶液。于同一硅膠G薄層板上，分別吸取供試品溶液、川牛膝對照藥材溶液和陰性對照溶液各 5 μL點(diǎn)上，以氯仿-丙酮-甲 酸（15∶1∶0.2）為 展開劑，展開，取出并晾干后，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見圖2。

圖2 川牛膝TLC鑒別圖

2.3 梔子薄層色譜鑒別

取樣品10 mL，加水飽和的正丁醇萃取2次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干后，用甲醇2 mL使殘?jiān)芙?，制得供試品溶液。?0 mL缺梔子的陰性樣品，同法制備陰性對照溶液。另取梔子對照藥材 0.5 g，加乙醇 20 mL，超聲處理 20 min，濾過，濾液蒸干；加乙醇2 mL使殘?jiān)芙?，制得梔子對照藥材溶液。于同一硅膠G薄層板上，分別吸取上述3種溶液各5 μL點(diǎn)上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2） 作為展開劑，展開，取出并晾干后，噴以10%硫酸乙醇溶液，置于105℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。日光下檢視，見圖3。

圖3 梔子TLC鑒別圖

2.4 甘草薄 層色譜鑒別

取梔子項(xiàng)下供試品溶液作為供試品溶液。取缺甘草的陰性樣品10 mL，同法制備陰性對照溶液。另取甘草對照藥材0.5 g，加水適量濕潤，加水飽和的正丁醇加20 mL，超聲處理40 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，制得甘草對照藥材溶液。吸取上述 3種溶液各 5 μL，于同一硅膠G薄層板分別點(diǎn)上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑展開，取出并晾干后，噴以10%硫酸乙醇溶液，置于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視，見圖4。

圖4 甘草TLC鑒別圖

2.5 石韋薄層色譜鑒別［3-4］

取尿石清合劑10 mL，用乙酸乙酯-乙醇（8∶1）混合溶液提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，加甲醇2 mL使殘?jiān)芙猓频霉┰嚻啡芤?。?0 mL缺石韋的陰性溶液同法制得陰性對照溶液。取石韋3 g，水煮1 h，濃縮至20 mL，按供試品溶液同法制得對照藥材溶液。于同一硅膠G薄層板上，吸取供試品溶液、陰性對照溶液各5 μL、對照藥材溶液 3μL點(diǎn)上，以氯仿-丙酮-甲酸（10∶2∶0.2）為展開劑展開，取出并晾干后，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液，置于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視，見圖5。

圖5 石韋TLC鑒別圖

2.6 廣金錢草薄層色譜鑒別［5-6］

取樣品10 mL，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，用乙酸乙酯提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，加無水乙醇2 mL使殘?jiān)芙?，制得供試品溶液。取缺廣金錢草的陰性溶液10 mL同法制得陰性對照溶液。取廣金錢草3 g，水煎1 h，水煎液同法制得廣金錢草對照藥材溶液。分別吸取供試品溶液、陰性對照溶液各5 μL，對照藥材溶液3 μL，于同一硅膠 G薄層板點(diǎn)上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）為展開劑展開，取出并晾干后，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，見圖6。

圖6 廣金錢草TLC鑒別圖

3 梔子苷的含量測定［7-8］

3.1 色譜條件

色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠（Inertsil ODS-3，5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫 30 ℃；流動(dòng)相:甲醇-水（30∶70）；檢測波長:236 nm；流速:1 mL/min；進(jìn)樣量:20 μL。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品溶液 精密稱取梔子苷對照品適量，用50%甲醇稀釋至0.02 mg/mL。

3.2.2 供試品溶液 精密量取 2 mL樣品于 50 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度線，搖勻，精密量取10 mL于20 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，過濾，作為供試品溶液。

3.2.3 陰性對照溶液 精密量取2 mL缺梔子的陰性溶液，按照樣品處理方法同法制得陰性對照溶液。

3.3 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20 μL，按3.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測。結(jié)果，供試品溶液色譜中有與對照品溶液色譜相對應(yīng)的峰，且陰性無干擾（圖7）。

圖7 梔子苷含量色譜圖

3.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取梔子苷對照品溶液（0.02 mg/mL）0.5 mL，1 mL，2 mL，4 mL，8 mL 于 20 mL 容量瓶中，配成5個(gè)系列濃度的溶液，濃度分別為5 mg/μL，10 mg/μL，20 mg/μL，40 mg/μL，80 mg/μL，吸取上述各組溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定，以峰面積對濃度進(jìn)行回歸分析，回歸方程為:y=52 658x+12.088，r=0.999 7。結(jié)果表明梔子苷在5～80 mg/μL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

3.5 精密度試驗(yàn)

取同一梔子苷對照品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)測定5次。按峰面積計(jì)算，測得梔子苷的RSD為1.52%，表明系統(tǒng)精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別置 0 h、1 h、3 h、6 h、24 h、48 h 后，按“3.1”項(xiàng)色譜條件測定，計(jì)算色譜中梔子苷的峰面積，RSD值為0.91%，表明樣品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取尿石清合劑，按“3.2.2”項(xiàng)方法制備供試品5份，按“3.1”色譜條件測定梔子苷含量，樣品梔子苷平均含量為 1.269 mg/mL，RSD為 1.72%.表明該法重現(xiàn)性良好。

3.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量為1.269 mg/mL的尿石清合劑（批號20171228）樣品5份，精密量取1 mL，分別精密加入梔子苷對照品溶液（0.3 mg/mL）2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL。再按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為 103.6%，RSD值為 1.59%。

3.9 樣品含量測定

取 4批樣品 （批號 20170912、20171031、20171130、20171228）按“3.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，代入回歸方程，計(jì)得含量。結(jié)果測得樣品含量分別為1.216 mg/mL，1.472 mg/mL，1.651 mg/mL，1.269 mg/mL，平均含量為 1.402 mg/mL。

4 討論

車前子中主要成分為車前子多糖，故可以采用極性大的溶劑處理。參考《中國藥典》2015版第一部，并通過參考文獻(xiàn)進(jìn)行了改進(jìn)，去掉了乙醚提取的過程。結(jié)果，供試品中有與對照藥材相同的熒青黃色的斑點(diǎn)，且陰性無干擾，Rf值適中，特征性斑點(diǎn)清晰，分離度良好，具有專屬性。藥典中并無石韋的薄層色譜鑒別記載，直接用乙酸乙酯-乙醇（8∶1）震蕩提取后，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙猓媒Y(jié)果理想，樣品中具有與對照藥材相同的斑點(diǎn)，Rf值適中，且陰性無干擾，操作簡便，該法鑒別石韋具有一定的穩(wěn)定性、可行性。尿石清合劑中川牛膝、梔子、甘草、廣金錢草參考《中華人民共和國藥典》2015版中方法亦能較好進(jìn)行定性鑒別。

藥典中梔子苷含量測定的流動(dòng)相為乙腈-水（15∶85），但乙腈毒性大于甲醇，選擇甲醇-水，調(diào)整比例后，主峰型分離度好，保留時(shí)間合適。

4批制劑中梔子苷的平均含量為1.402 mg/mL，考慮到梔子藥材品質(zhì)差異及生產(chǎn)工藝中的損耗，指標(biāo)成分的含量限度以平均值的80%作為含量下限，即尿石清合劑中梔子苷的含量不得低于1.122 mg/mL。

本次研究擬定的薄層鑒別法和含量測定法，方便快捷、重現(xiàn)性好，可作為尿石清合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，能有效控制尿石清合劑的質(zhì)量。