活化蛋白C通過降低炎癥因子表達(dá)減輕大鼠缺血性腦損傷研究

王金橋，楊曉曉，饒高峰

卒中因其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率，給社會和家庭均帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來，缺血性卒中已成為嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病之一[1-2]。過去的20年間，僅有一種藥物被美國食品及藥物管理局批準(zhǔn)用于急性缺血性卒中的治療，即rt-PA[3]。然而，rt-PA具有很多限制其廣泛應(yīng)用的局限性，包括相對較短的治療時(shí)間窗、大血管閉塞的血管再通率較低及顱內(nèi)出血的風(fēng)險(xiǎn)[4]。近幾年，機(jī)械取栓術(shù)在急性缺血性卒中治療中的作用明顯增加，但取栓術(shù)后功能獨(dú)立的可能性與血管再通率仍然很低。神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）由腦微血管、細(xì)胞外基質(zhì)、星形膠質(zhì)細(xì)胞終足、周細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及其軸突和其他支持細(xì)胞（小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等）等組成的動態(tài)結(jié)構(gòu)，是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的基本單位，主要功能是調(diào)節(jié)腦營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)和生物信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，防止血液內(nèi)的有害成分進(jìn)入腦內(nèi)，保護(hù)大腦。炎癥反應(yīng)是局灶性腦缺血繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵機(jī)制之一，貫穿于局灶性腦缺血損傷的整個(gè)過程[5]。在因血栓形成或栓塞而阻斷腦血流后，炎癥反應(yīng)參與腦缺血損傷，引起NVU損傷、神經(jīng)細(xì)胞活動與腦血流的解偶聯(lián)及神經(jīng)細(xì)胞的死亡。

活化蛋白C（activated protein C，APC）是一種血漿絲氨酸蛋白酶，具有抗血栓形成、抗炎、抗凋亡和細(xì)胞信號傳導(dǎo)功能，研究發(fā)現(xiàn)APC可阻止大腦細(xì)胞的程序性死亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生，并減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，目前臨床缺血性卒中實(shí)驗(yàn)正在對其療效進(jìn)行研究[4]。關(guān)于APC的作用機(jī)制尚不十分明確，尤其是其對炎癥反應(yīng)參與的腦保護(hù)作用尚無相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)將在整體動物水平觀察APC對局灶性腦缺血/再灌注后炎癥反應(yīng)引起的腦損傷的作用。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象與分組 本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬溫嶺醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查通過。研究采用雄性Spraque-Dawley（SD）大鼠，體重300～330 g，3月齡，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，將大鼠隨機(jī)分為3組，每組6～8只：①假手術(shù)組：生理鹽水1 mL/kg；②溶劑對照組：生理鹽水1 mL/kg；③APC組：APC（批號090m01549v，P2200，Sigma-Aldrich，美國）2 mg/kg。在造模后6 h以單次給藥方式經(jīng)腹腔注射給予各組藥物，藥物在1 min內(nèi)注射完畢。

1.2 制模方法和成功標(biāo)準(zhǔn) 大鼠按400 mg/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，以仰臥位放置在37℃恒溫板上。采用線栓法制作右側(cè)大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型[6]。具體方法為，在手術(shù)顯微鏡下經(jīng)頸正中切口，暴露雙側(cè)頸外動脈和頸內(nèi)動脈。線栓經(jīng)頸外動脈斷端進(jìn)入頸內(nèi)動脈，向內(nèi)延伸約20 mm直到感到抵觸感，此時(shí)線栓的頭部越過大腦中動脈的起始端，并阻斷大腦中動脈的血流。腦缺血2 h后線栓被拔出至頸外動脈的斷端，再灌注22 h。假手術(shù)組線栓在頸外動脈斷端處被結(jié)扎，不再向頸內(nèi)動脈延伸，其余手術(shù)過程與另兩組相同。以制模后提尾出現(xiàn)左前肢屈曲為制模成功。本研究共使用60只大鼠，其中24只大鼠用于神經(jīng)功能評分、氯化2，3，5-三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色和梗死體積測量，16只大鼠用于血腦屏障通透性檢測，TTC染色與血腦屏障通透性檢測共用一組假手術(shù)組動物，18只大鼠用于炎癥因子表達(dá)的檢測。模型組大鼠全部造模成功，其中假手術(shù)組和APC組無死亡，溶劑對照組大鼠在制模后24 h死亡2只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 神經(jīng)功能行為評分 24只大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，在缺血后24 h和72 h，采用Jieli Chen等[7]的改良神經(jīng)功能缺損評分表（modified neurological severity score，mNSS）對3組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能行為評分，該評分包括一些特定反射的存在及完成運(yùn)動和行為學(xué)任務(wù)，如木板行走試驗(yàn)、木板平衡試驗(yàn)和自主運(yùn)動試驗(yàn)，總分為18分。該評分由一位分組盲法的實(shí)驗(yàn)者完成。

1.3.2 TTC染色及梗死體積測量 3組大鼠在神經(jīng)功能行為評分后，假手術(shù)組用于血腦屏障通透性檢測，溶劑對照組合模型組在缺血后72 h，按400 mg/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，斷頭處死。迅速取出腦組織，檢查并確定沒有蛛網(wǎng)膜下腔出血。將腦組織切為2 mm厚的冠狀切片，在37℃水浴中與1%TTC（Sigma-Aldrich，美國）溶液避光孵育20 min，再于10%福爾馬林溶液中固定10 min。將TTC染色后的6張腦片照相后保存，以進(jìn)行損傷區(qū)域的測量。采用ImageJ軟件計(jì)算未被TTC染色的區(qū)域，即腦缺血損傷區(qū)域?？偣Ｋ荔w積的計(jì)算方法為6張腦片未染色的面積總和乘以腦片厚度。

5.動詞不定式復(fù)合結(jié)構(gòu)做后置定語，它和動詞不定式短語一樣，均只能放在被修飾成分的后面，做后置定語。例如：

1.3.3 血腦屏障通透性檢測 另取16只大鼠隨機(jī)分為溶劑對照組和模型組，每組8只，在缺血2 h，再灌注70 h時(shí)，與假手術(shù)組一起以10%水合氯醛400 mg/kg劑量麻醉，按2 mL/kg劑量經(jīng)股靜脈注射3%伊文氏藍(lán)（Evan’s blue，EB）溶液，平衡2 h后經(jīng)心臟灌注生理鹽水，留取缺血部位腦組織。將腦組織放入玻璃小瓶內(nèi)，稱重并加入5 mL甲酰胺，室溫避光孵育72 h，吸取萃取液于4℃，12 000 g離心15 min，將上清液移至96孔板，用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，檢測指標(biāo)為吸收光波長620 nm，激發(fā)光波長683 nm。萃取后的組織放入烤箱，120℃烤干24 h，再次稱重。組織的EB含量通過EB標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，以μg/g組織表示。

1.3.4 免疫印跡法檢測炎癥因子表達(dá) 另取18只大鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，在腦缺血后72 h，動物以10%水合氯醛麻醉，斷頭處死，迅速取出腦組織。留取距額極前端3 mm的冠狀腦片，腦片厚度為4 mm，然后在中線右側(cè)2 mm處縱行切開，留取右側(cè)半球的腦組織。所留的腦組織進(jìn)行勻漿，使用細(xì)胞核蛋白和胞漿蛋白制備試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，P1200）分離組織胞漿和胞核蛋白，組織蛋白含量使用BCA（bicinchoninic acid）試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，P1511）檢測。40 μg蛋白上樣到聚丙烯酰胺凝膠，電泳電流15 mA/25 mA（濃縮膠/分離膠），時(shí)間2 h；100 mA電轉(zhuǎn)1.5 h至聚偏二氟乙烯膜（ImmobilonTM，Millipore，USA），以3%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗[核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factorκB，NF-κB）p65抗體，1∶2000，Abcam 16502；核因子κB抑制蛋白（inhibitor of nuclear transcription factor-κB，IκB）抗體，1∶1000，Abcam 32518；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）抗體，1∶500，Abcam 6671；IL-1β抗體，1∶5000，Abcam 9722；β-actin抗體作為胞漿的內(nèi)參蛋白，1∶5000，Abcam 8226；TATA盒結(jié)合蛋白（TATA binding protein，TBP）抗體作為胞漿的內(nèi)參蛋白，1∶1000，Abcam 63766]，4℃過夜孵育后，洗膜3次，加入辣根過氧化酶偶聯(lián)二抗（1∶4000，Abcam 6728；Abcam 6721），室溫孵育1 h，洗膜后以化學(xué)發(fā)光法檢測胞漿和核NF-κB p65、IκB蛋白及胞漿TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。蛋白條帶采用Imagelab軟件分析，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的體積比表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 神經(jīng)功能行為評分結(jié)果以中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，其他數(shù)據(jù)以表示。使用SPSS 19.0軟件，神經(jīng)功能行為評分?jǐn)?shù)據(jù)用非參數(shù)Kruskal-Wallis分析和Dunn's多重比較檢驗(yàn)，其余各組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析及Newman-Keuls多重比較檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活化蛋白C改善大鼠局灶性腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能評分 大鼠缺血前，缺血后24 h和72 h的神經(jīng)功能評分結(jié)果見表1。假手術(shù)組大鼠表現(xiàn)為正常的神經(jīng)功能評分，缺血再灌注后3組大鼠的神經(jīng)功能評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（KW=41.00，P＜0.001）。與假手術(shù)組相比，溶劑對照組大鼠在缺血再灌注后24 h和72 h的評分明顯升高（D=-30.06，P＜0.001；D=-29.44，P＜0.001），APC組大鼠缺血再灌注后24 h的神經(jīng)功能評分升高（D=-22.25，P＜0.05），APC組大鼠72 h時(shí)評分與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（D=-11.63，P＞0.05）；與溶劑對照組相比，缺血再灌注后24 h時(shí)，APC組大鼠的神經(jīng)功能評分有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（D=7.813，P＞0.05），而72 h的神經(jīng)功能評分明顯改善（D=20.31，P＜0.05）。

表1 活化蛋白C改善大鼠局灶性腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能評分

2.2 活化蛋白C降低大鼠局灶性腦缺血再灌注后的梗死體積 缺血后72 h，溶劑對照組和APC組大鼠的TTC染色結(jié)果見圖1A，兩組大鼠的腦梗死體積分別為（181.00±19.37）mm3和（132.90±9.25）mm3（圖1B），與溶劑對照組相比，APC治療后能顯著降低大鼠局灶性腦缺血再灌注后的梗死體積（t=2.242，P=0.042）。

2.3 活化蛋白C降低大鼠局灶性腦缺血再灌注后的血腦屏障通透性 結(jié)果顯示，腦缺血后72 h假手術(shù)組、溶劑對照組和APC組大鼠的腦組織EB含量分別為（1.37±0.41）μg/g，（18.12±1.53）μg/g，（13.86±1.19）μg/g。3組大鼠的血腦屏障通透性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=58.13，P＜0.001）（圖2）；與假手術(shù)組比較，溶劑對照組和APC組的EB含量明顯增加（q=14.67，P＜0.001；q=10.94，P＜0.001）；與溶劑對照組相比，APC組的腦組織EB含量明顯降低（q=3.736，P＜0.05）。

圖1 活化蛋白C對大鼠局灶性腦缺血再灌注后梗死體積的影響

圖2 活化蛋白C對大鼠局灶性腦缺血再灌注后血腦屏障通透性的影響

2.4 活化蛋白C減少大鼠局灶性腦缺血再灌注后炎癥因子的表達(dá) 缺血后72 h，胞漿和胞核部分NF-κB p65與胞漿IκB蛋白表達(dá)有明顯變化（F=9.353，P=0.002；F=9.837，P=0.002；F=5.630，P=0.015）（圖3A～圖3C）。與假手術(shù)組相比，溶劑對照組胞漿NF-κB p65表達(dá)明顯降低（q=6.012，P＜0.01），IκB蛋白表達(dá)減少（q=4.639，P＜0.05），而胞核部分NF-κB p65表達(dá)升高（q=6.268，P＜0.01）；與溶劑對照組相比，APC組的胞漿NF-κB p65和IκB蛋白表達(dá)增加（q=3.983，P＜0.05；q=3.185，P＜0.05），而胞核部分NF-κB p65表達(dá)減少（q=3.344，P＜0.05）。胞漿TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.853，P=0.024；F=9.119，P=0.003）（圖3D～圖3E，）。與假手術(shù)組相比，溶劑對照組TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)均明顯升高（q=4.284，P＜0.05；q=6.037，P＜0.01）；而APC組TNF-α和IL-1β蛋白的表達(dá)比溶劑對照組明顯降低（q=3.032，P＜0.05；q=3.181，P＜0.05）。各組蛋白相對內(nèi)參蛋白的表達(dá)量結(jié)果見表2。

3 討論

圖3 活化蛋白C對大鼠局灶性腦缺血再灌注后炎癥因子表達(dá)的影響

表2 活化蛋白C改善大鼠局灶性腦缺血再灌注后炎癥因子的相對表達(dá)量

APC能發(fā)起驅(qū)動多重、多樣化、獨(dú)立形式細(xì)胞活動的信號傳導(dǎo)，其中很多被稱為細(xì)胞保護(hù)性活動，包括抗凋亡和抗炎活動、基因表達(dá)的有利改變和內(nèi)皮細(xì)胞屏障的穩(wěn)定，其啟動有益的細(xì)胞信號傳導(dǎo)的能力是目前研究的熱點(diǎn)話題[8-10]。APC的神經(jīng)保護(hù)作用首次在小鼠MCAO模型中發(fā)現(xiàn)，缺血前及缺血后即刻給予APC可以改善腦血流，減少梗死體積、腦水腫和中性粒細(xì)胞浸潤。近年來，一些體內(nèi)外的研究已驗(yàn)證了在缺血性卒中的恢復(fù)過程中，APC在直接的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)，血腦屏障的穩(wěn)定性，神經(jīng)元的保護(hù)作用，神經(jīng)再生和新血管形成方面起到重要作用，而APC作為一種新型的多靶點(diǎn)藥物，已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)，其治療急性缺血性卒中的Ⅱ期臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行[11-14]。

本研究中，APC能明顯降低大鼠腦缺血再灌注后72 h的神經(jīng)功能評分和梗死體積，提示APC對缺血性腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究同時(shí)觀察了缺血后24 h和72 h的神經(jīng)功能評分，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的進(jìn)展，溶劑對照組的評分有下降趨勢，考慮是大鼠自身恢復(fù)的結(jié)果；APC組72 h的評分結(jié)果要明顯低于24 h，提示APC存在一定的長期療效。

局灶性腦缺血觸發(fā)炎癥反應(yīng)后，活化的炎癥細(xì)胞堵塞毛細(xì)血管，同時(shí)釋放的炎癥因子能增加微血管的通透性，引起腦微血管的痙攣和腦組織的水腫，造成缺血腦區(qū)再灌注后的無復(fù)流現(xiàn)象，加重腦組織的缺血損傷；同時(shí)，炎癥介質(zhì)可下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)黏附受體的表達(dá)，降低星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，增加血腦屏障通透性。

有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元內(nèi)，APC能抑制NF-κB p65蛋白易位入神經(jīng)元胞核。本研究同時(shí)觀察了胞漿和胞核NF-κB p65蛋白及胞漿IκB蛋白的表達(dá)，結(jié)果提示腦缺血再灌注后胞漿NF-κB p65蛋白易位入胞核，同時(shí)抑制性蛋白IκB水解增加，而APC可以抑制NF-κB p65的活化過程。此外，研究證實(shí)NF-κB p65介導(dǎo)了腦缺血后許多炎癥介質(zhì)的表達(dá)，如TNF-α、IL-1β、ICAM-1、E-選擇素、基質(zhì)金屬蛋白酶、環(huán)氧化酶-2、一氧化氮合酶等，并且下調(diào)NF-κB p65的促轉(zhuǎn)錄活性可降低局灶性腦缺血損傷[15]。本研究中，APC能明顯抑制腦缺血再灌注后TNF-α和IL-1β的蛋白表達(dá)，因此，推測APC可能通過抑制NF-κB p65的活化和核異位，從而下調(diào)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，降低血腦屏障通透性，對血腦屏障的損傷起保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示APC能有效減輕血腦屏障通透性，從而對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過抑制NF-κB p65的活化和核易位，降低炎癥因子TNF-α和IL-1β蛋白的水平，表明APC在炎癥反應(yīng)參與的缺血性腦損傷中具有保護(hù)作用。但是本研究僅僅初步探索了APC在炎癥反應(yīng)參與腦缺血引起血腦屏障損傷中的作用，而局灶性腦缺血引起的組織損傷是由一系列發(fā)生在血液-微血管-腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的病理生理事件引起，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡，本研究沒有從神經(jīng)細(xì)胞、腦微血管、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等一個(gè)功能整體層面進(jìn)行分析APC的作用，在今后的研究中，可進(jìn)一步側(cè)重觀察APC對NVU中各組分的影響和相互作用，觀察其對腦微環(huán)境內(nèi)血液供應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞能量需求之間的精細(xì)平衡的影響，以更加完善APC作用機(jī)制的研究，明確其降低神經(jīng)功能缺損和神經(jīng)細(xì)胞的死亡，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)的確切機(jī)制。

【點(diǎn)睛】活化蛋白C能減輕血腦屏障損傷保護(hù)大鼠腦缺血損傷，可為神經(jīng)保護(hù)藥物作用靶點(diǎn)的研究提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。